专利名称：猪伪狂犬病毒毒株及用其制备的猪伪狂犬病灭活疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株分离的病毒毒株，尤其涉及一株分离的猪伪狂犬病毒毒株以及用该毒株制备得到的猪伪狂犬病灭活疫苗，本发明属于猪伪狂犬病灭活疫苗领域。
背景技术：
猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒(PRV)引起的以发热、奇痒及脑脊髓炎为主要特征的急性传染病。猪伪狂犬病毒通常引起妊娠母猪流产、产木乃伊胎、死胎和产弱仔。初生仔猪出现神经症状，感染率和死亡率可达100%，成年猪感染后多耐过，呈隐性感染，造成长期带毒、排毒，成为最危险的传染源，严重影响种猪生产及优良品种的推广。随着中国规模化和集约化养猪业的发展，从国外引进的种猪相应增多，伪狂犬病随之传入并不断蔓延扩大， 给养猪业造成了巨大的经济损失，OIE将其列为法定报告动物疾病的B类多种动物共患病， 中国也将其列为二类传染病。。由于PRV目前尚无有效的药物治疗方法，因此，该病的预防免疫就显得更为重要。近年来，使用疫苗被公认是预防猪伪狂犬病、提高母猪繁殖率的唯一有效方法。国内外已研制出猪伪狂犬病的常规弱毒疫苗、灭活疫苗、基因缺失弱毒疫苗和基因缺失灭活疫苗，而病毒载体重组疫苗和基因疫苗尚处于实验室研究阶段。基因缺失疫苗已在生产中发挥着重要作用，但在实际生产中，该病并没有得到很好的控制。流行毒株是否发生了变异或重组，引起了疫苗研发人员的思考，用流行毒株制备灭活疫苗也就提上了日程。目前，在制备灭活疫苗时所使用的主要灭活剂有福尔马林、B2丙内酯(B2PH)、 N-乙酰乙烯亚胺(ΑΕΙ)、二乙烯亚胺(BEI)等。有试验结果表明，PRV用福尔马林灭活后做成的疫苗的保护效果不如用二乙烯亚胺灭活后做成的疫苗的保护效果好；用B-丙内酯灭活的疫苗的保护力较好。免疫佐剂也是影响PRV灭活疫苗免疫效果的重要因素。有试验结果表明，50%的氢氧化铝、顺丁烯乙酰(ΕΜΑ)、油水乳剂、DDA分别作为佐剂的疫苗，均诱导猪产生高滴度的抗体。但几种佐剂的混合物，如油佐剂、SDS、氢氧化铝和油乳剂的混合物以及SDS、氢氧化铝的混合物作佐剂的疫苗产生的抗体滴度均较低。目前国内有两种猪伪狂犬病毒灭活疫苗供预防本病。一种是猪伪狂犬病毒灭活氢氧化铝疫苗，另一种是猪伪狂犬病毒灭活油佐剂苗。对于猪伪狂犬病毒应用二乙烯亚胺灭活，并加入油佐剂配制而成油乳剂灭活苗,还未报道。
发明内容
本发明目的之一是提供一株新分离的猪伪狂犬病毒株；本发明目的之二是将所分离的猪伪狂犬病毒毒株制备成猪伪狂犬病灭活疫苗。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的一株分离的猪伪狂犬病毒H株，其微生物保藏号是GCMCC No. 5013 ；分类命名猪伪狂犬病毒；保藏时间2011年6月四日；保藏单位是中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。本发明猪伪狂犬病毒H株是从黑龙江某地猪场母猪死胎的脑、扁桃体等组织中分离得到，通过传代适应，所分离的病毒株在ST细胞上增殖快、滴度高，可诱导动物产生高滴度中和抗体，具有更好的免疫原性。本发明将所分离病毒颗粒进行电镜负染观察电镜负染观察，结果显示均见有囊膜的圆形病毒粒子，直径约为130 170nm。基因分析发现，本发明所分离的PRV分离株H株与其它15株PRV的gE基因核苷酸同源性以及由gE基因推导的氨基酸序列同源性分别为97. 0% 99. 2%和93. 2% 98.5%,最低为AiN3株，最高为SH株。本发明所分离的毒株可代表中国PRV的主要流行株， 可作为制备猪伪狂犬病毒灭活疫苗的毒种。本发明的另一个目的是用本发明所分离的猪伪狂犬病毒H株制备猪伪狂犬病灭活疫苗；本发明的另一个目的是通过以下技术方案来实现的一种制备猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，包括(1)培养所分离的猪伪狂犬病毒H株，得到病毒液；(2)向病毒液中加入灭活剂，将病毒液灭活；(3)配制油相和水相，乳化，即得。为了达到更好的技术效果，本发明对所述灭活疫苗的制备方法的各工艺参数进行了优化和筛选，试验结果发现，采用以下条件能够提高灭活疫苗产品的质量或效果本发明通过实验发现，在对所述的病毒液加入灭活液进行灭活时，所加入的灭活剂优选为二乙烯亚胺；其中，所加入的二乙烯亚胺的终浓度可以为病毒液总量的 0.01%-1% (w/v)；加入二乙烯亚胺后，对病毒液在气浴振荡的条件下灭活2-100小时，所述的气浴振荡优选是温度为30°C，转速为lOOr/min。本发明通过进一步的试验发现，向病毒液中所加入的二乙烯亚胺溶液的浓度或用量以及灭活时间等参数直接影响到灭活疫苗产品的效果，不同的参数所得到的产品在保护效力或安全性等方面有显著的差异。为了摸索出上述最优的技术参数，本发明进行了大量的实验对所加入的二乙烯亚胺溶液的浓度或用量以及灭活时间等参数进行了优化，最终发现采用下述技术参数最有利于提高灭活疫苗产品的免疫保护效力或安全性能(1)、病毒液中所加入二乙烯亚胺的终浓度优选为0. 02% (w/v)。(2)、加入二乙烯亚胺后，对病毒液在气浴振荡的条件下灭活60小时。此外，本发明通过试验发现，将灭活后的病毒液浓缩后再加入佐剂、乳化，可以显著提高疫苗制品的免疫保护效力和安全性。其中，所述的浓缩优选采用以下方式进行(1) 病毒液的预处理将灭活后的病毒液离心后用以0. 2um滤膜滤器过滤；(2)微滤后的病毒液以100KD滤膜滤器超滤浓缩。所述的油相组成为注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1. 5份；所述的水相组成为96ml的灭活病毒液和吐温-80混合，向混合液中加入硫柳汞至终浓度为 0.01% (w/v)得到水相；将水相和油相按照1 1.5比例进行乳化，制成油包水单相苗。本发明灭活疫苗免疫剂量为猪肌肉注射aiil/头，一次接种灭活疫苗，现地免疫期可达6个月以上。用本发明灭活疫苗超剂量接种IOml/头，单剂量3次重复接种后，均未发现任何异常反应，说明本发明灭活疫苗具有良好的免疫原性及安全性。
图1细胞病变效应(CPE)结果。图2病毒的电镜检查结果。图3免疫荧光法检查结果。图4PRV H株gl和gE基因部分核苷酸序列。
图5PRV H株gE基因的进化关系。图6本发明猪伪狂犬病毒毒株灭活疫苗的工艺流程图。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1猪伪狂犬病毒H株的分离、培养、鉴定一、猪伪狂犬病毒H株的分离和培养1.病料采集无菌采集取母猪死胎的脑、扁桃体等组织。以1 10加入MEM，研磨，制备组织悬液，经反复3次冻融后，2000r/min离心15min，收集上清液，再经0. 2um滤膜滤器过滤，将滤出液置-40°C冰箱冻结保存。2.分离培养将上述病料按病毒培养液的10%含量接入尚未形成单层的细胞培养物中，37°C感作lh，换加含2%犊牛血清的MEM培养液，37°C培养5日。第二代培养96h， 收获含毒培养液，经2次冻融后，收毒。连续传代5代。3.基础种子批建立取原始毒种，按病毒培养液量的接入形成单层的ST细胞培养物中，置37°C培养，当病变达到80%时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒；连续传代6代。4.生产种子批建立取基础种子，按病毒培养液量的接入形成单层的ST细胞培养物中，置37°C培养，在C0237°C条件下培养，每天对细胞病变效应(CPE)进行观察。观察结果显示细胞膨大，圆缩，继而开始脱落逐渐形成空斑病灶，并且有“拉网”现象(图1)， 当病变达到80%时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒。连续传代11代，最终获得一株猪伪狂犬病毒毒株，命名为猪伪狂犬病毒H株，将该猪伪狂犬病毒H株提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏号是CGMCCNo. 5013。二、猪伪狂犬病毒H株的鉴定(1)电镜负染观察经培养5-7d后，病变细胞上清蔗糖梯度超速离心，分离病毒颗粒进行电镜负染观察。结果显示均见有囊膜的圆形病毒粒子，直径约为130 170nm。见图2。(2)免疫荧光法检查取分离的毒株接种ST传代细胞上，在C023 7°C条件下培养^h，当CPE达80%时，传第二代，选用第二代培养物经2次冻融后，做荧光抗体检查。取已培养Mh的ST细胞盖玻片培养物，接种病毒，再经24h培养。取出盖玻片，用PBS冲洗，经丙酮固定，再用猪伪狂犬病毒荧光抗体湿盒内染色30min，冲洗，封固，镜检。结果显示标本感染ST传代细胞，细胞有病变，在细胞核细胞质中，可见呈苹果绿色的特异性荧光，阴性对照无特异性荧光出现(图3)。(3)病毒的测序检测PRV分离株H株gE基因核苷酸序列同源性比较应用DNASTAR7. 1软件将测出的H株 gE基因部分序列以及推导的核苷酸序列与同国内外PRV分离株SH株(AY683136)，⑶SH株 (EF552427)，P-Prv株(FJ176390)，Ea株(AF171937)，YS株(AY249861)，GD株(AF403050)， FA 株(AF403049)， HNDF 株(EU561350)， Ron-A 株(AY683134)， BE 株(AY368490)， Α Ν3 株 (EU502923), Rice 株(AY683134)， LA 株(AY683135)， Jiaozuo 株(EU561349)， MIN-A 株 (AY170318)等15株病毒的相应序列进行同源性比较分析。由结果可知，H株与其他15 株PRV的gE基因核苷酸同源性以及由gE基因推导的氨基酸序列同源性分别为97. 0% 99. 2%和93. 2% 98. 5%，最低为AiN3株，最高为SH株。见附图4。H株和其它几株PRV gE的进化树分析(图5)。表明本发明所分离的PRV分离株 H株与LA株和SH株的遗传距离最近。实施例2猪伪狂犬病毒病灭活苗的制备1.制苗用病毒液的制备将实施例1所分离的猪伪狂犬病毒H株毒种按病毒培养液量的接入形成单层的ST细胞培养物中，置37°C旋转培养，当病变达到80%时，收获含毒细胞培养液，经2次冻融后，收毒。2.灭活按病毒液总量的0. 02% (w/v)向病毒液中加入2% (w/v) 二乙烯亚胺溶液，充分振荡后，于3(TC、100r/min摇床上灭活60h，然后加入2 %硫代硫酸钠溶液，终止灭
活。并作无菌检验。3.浓缩取灭活后的病毒液，经4000r/min水平离心，然后以0. 2um滤膜滤器过滤。微滤后的病毒液以100KD滤膜滤器超滤浓缩5倍。4.油佐剂灭活疫苗的配制按照注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1. 5份的比例配制油相；按照96ml抗原加入4ml吐温-80及0. 01 %加入硫柳汞的比例配制水相； 水相和油相按照1 1.5比例进行乳化，制成油包水单相苗。试验例1本发明猪伪狂犬病毒灭活疫苗的工艺优化试验本发明选用二乙烯亚胺作为灭活剂，对灭活剂的使用剂量、作用时间等进行一系列优化试验，以优化二乙烯亚胺灭活猪伪狂犬病毒程序。(1) 二乙烯亚胺使用剂量及浓度确定分别采用1%，0. 2%，0.05%，0.02% (w/v)(在病毒液中的终浓度)的二乙烯亚胺，在30°C，lOOr/min，气浴振荡的条件下，灭活60h，灭活后做灭活病毒液细胞培养物感染性病毒检查及小白鼠感染试验。试验结果见表1。表1不同BEI浓度灭活PRV试验浓度/%
CPE
试验鼠
对照鼠
1
0. 2 0. 05 0. 02
0/5 0/5 0/5 0/5
10/10 10/10 10/10 10/10
5/5
5/5
5/5 5/5
果最佳。
注分母为接种数，分子为存活数或CPE数。
根据试验结果，最终确定以终末浓度0. 02%二乙烯亚胺溶液灭活猪伪狂犬病毒效
(2) 二乙烯亚胺作用时间确定
0. 02%二乙烯亚胺，在30°C，100r/min，气浴振荡的条件下，分别做7、10、15、24、 48、60、72、80h等不同时间的灭活，灭活后做灭活病毒液细胞培养物感染性病毒检查及小白鼠感染试验。试验结果见表2。
表2PRV灭活试验
时间/h
CPE
试验鼠
对照鼠
7 10
15 24 48 60 72 80
5/5 5/5
5/5 5/5 3/5 0/5 0/5 0/5
0/10 0/10
3/10 5/10
7/10 10/10 10/10 10/10
5/5 5/5
5/5 5/5
5/5
5/5
5/5 5/5注分母为接种数，分子为存活数或CPE数。根据试验结果，最终确定以终末浓度0. 02%二乙烯亚胺溶液在30°C，lOOr/min， 气浴振荡的条件下，做60h灭活猪伪狂犬病毒效果最佳。(3) 二乙烯亚胺毒性试验设定1%、0. 2%、0. 02%等浓度的二乙烯亚胺溶液，注射18_22g小白鼠，观察10d， 记录死亡数和存活数。确定0. 2% 二乙烯亚胺注射0. 2ml及0. 02% 二乙烯亚胺0. 4ml为安全剂量。
试验例2本发明猪伪狂犬病毒病灭活苗的保护效力试验按照实施例2所述的方法重复生产3批疫苗，对10276头猪(多数为初产母猪) 进行了疫苗接种实验。以免疫剂量为猪肌肉注射ani/头，一次接种灭活疫苗，现地免疫期可达6个月以上，说明本发明所制备的灭活疫苗具有良好的免疫原性。现地免疫期测定结果以中试生产的3批疫苗，2mL/头接种一定数量5月龄左右的猪只，于免疫后6个月，购入场内，攻击猪伪狂犬病毒强毒，测定疫苗现地免疫持续期，结果详见表3。表3免疫期测定结果
权利要求
1.一株分离的猪伪狂犬病毒H株，其微生物保藏号是GCMCC No. 5013。
2.权利要求1所述的猪伪狂犬病毒H株在制备猪伪狂犬病灭活疫苗中的用途。
3.一种制备猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，包括(1)培养权利要求1所述的猪伪狂犬病毒H株，获得病毒液；(2)病毒液中加入灭活剂，将病毒液灭活；(3)配制油相和水相，乳化，即得。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于向病毒液中所加入的灭活剂是二乙烯亚胺。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于按w/v计，所加入的二乙烯亚胺的终浓度为病毒液总量的0. 01 % -1 %，优选为0. 02 %。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于所述的灭活时间为2-100小时，优选为60 小时。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于所述的灭活是在气浴振荡的条件下进行灭活；其中所述气浴振荡的条件下优选是温度为30°C，转速为 lOOr/min。
8.按照权利要求3所述的方法，其特征在于将病毒液灭活后进行浓缩；优选的，所述的浓缩采用以下方式进行(1)病毒液的预处理将灭活后的病毒液离心后用以0. 2um滤膜滤器过滤；(2)微滤后的病毒液以100KD滤膜滤器超滤浓缩。
9.按照权利要求3所述的方法，其特征在于所述的油相组成为按质量计，注射用白油94份、司本-806份和硬脂酸铝1. 5份；所述的水相配制方法包括96ml的灭活病毒液和 4ml吐温-80混合；按w/v计，向混合液中加入硫柳汞至终浓度为0. 01 %，得到水相；将水相和油相按照1 1.5的体积比例进行乳化，制成油包水单相苗。
10.由权利要求3-9任何一项方法得到的灭活疫苗。
全文摘要
本发明公开了猪伪狂犬病毒毒株及用其制备的猪伪狂犬病灭活疫苗。本发明从猪场母猪死胎的脑、扁桃体等组织中分离并通过传代适应得到一株猪伪狂犬病毒毒株，其微生物保藏号是GCMCC No.5013。本发明所分离的病毒株在ST细胞上增殖快、滴度高，可诱导动物产生高滴度中和抗体，具有良好的免疫原性。本发明还公开了一种制备猪伪狂犬病灭活疫苗的方法，包括培养本发明猪伪狂犬病毒毒株，获得病毒液；加入灭活剂，将病毒液灭活；配制油相和水相，乳化，即得。本发明还对灭活疫苗的各工艺参数进行了优化。免疫保护效力和安全性试验表明，本发明灭活疫苗具有良好的免疫原性及安全性。
文档编号A61P31/22GK102344912SQ20111027934
公开日2012年2月8日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者丁国杰, 付丽杰, 任德强, 吴金, 姜力, 张智明, 张杨, 张立恒, 戴秀莉, 李尊江, 武佳斌, 潘兴广, 赵辉 申请人:哈药集团生物疫苗有限公司