专利名称：一种猪用c型口蹄疫基因工程疫苗佐剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种动物疫苗用的佐剂及制备方法，确切讲是一种猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂及制备方法，更确切讲本发明是一种用于由C型口蹄疫的VPl和VP3蛋白混合物构成的C型口蹄疫亚单位疫苗的佐剂，以及其制备方法。
背景技术：
口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是一种能够感染包括牛、羊、猪等主要家畜在内的多种偶蹄动物的一种急性、烈性、高度接触性的传染病，其病原体为口蹄疫病毒 (Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)。FMDV 属于微 RNA 科(Picornaviridae)、口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，共包括 7 个血清型(A、C、0、Asia I、SAT I、SAT II 及 SAT III)，各血清型之间无交叉保护力。基因亚单位工程疫苗由于安全性好易于保存，效果理想等优点具有广阔的前景。 然而基因亚单位工程疫苗免疫原性相对较弱，为了更好地激发机体的免疫系统，使其对口蹄疫病毒具有足够的抵抗力，多采用在疫苗中加入佐剂，例如油佐剂。
发明内容
本发明提供一种用于C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗的佐剂。本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂是重组猪α-干扰素。更确切讲，本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂是剔除掉了干扰素的前端8个信号肽的重组猪 α-干扰素，其核苷酸序列为SEQ ID Νο3。本发明所述的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法是用经口蹄疫病毒攻毒后屠宰的猪新鲜脾脏提取脾脏总RNA，再通过反转录方法获得猪α -IFN基因，将所得到的猪α -IFN基因连接于原核表达载体上构成质粒，再转入原核表达系统进行表达，表达产物经复性纯化处理后得到所要的佐剂。作为最佳实施方式，本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法是用经口蹄疫病毒攻毒后屠宰的猪新鲜脾脏提取脾脏总RNA，再通过反转录方法获得猪α -IFN基因，将所得到的猪α -IFN基因连接于原核表达载体上构成质粒，再转入原核表达系统进行表达，表达产物经复性纯化处理后得到所要的佐剂。这里所用的复性处理中可采用不同浓度的尿素溶液，或者盐酸胍或者甲酸溶液(如70%的的甲酸溶液)。在前述制备方法中所用的一对猪α-干扰素基因用RT-PCR引物为IFN-正向引物5 ‘ -GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3 ‘IFN-反向引物5 ‘ -CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3 ‘；。所用的原核表达载体为pET_30a ；所用的原核表达系统为大肠杆菌BL21 (DE3)。本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法中优选的于产物复性处理方法为采用含DDT和EDTA的盐酸胍溶液，其中盐酸胍的终浓度为1.5M，DDT的终浓度为 ImM, EDTA的终浓度为10mM。
α-IFN是一种广谱抗病毒剂，虽然它不直接杀伤或抑制病毒，但却可以通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白，从而抑制病毒的复制；同时还可增强自然杀伤细胞 (NK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞的活力，从而起到免疫调节作用，并增强抗病毒能力。 干扰素是一组具有多种功能的活性蛋白质(主要是糖蛋白)，是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。近年研究表明干扰素有利于CD8+记忆T细胞的生长作用， 在病毒性疾病，如乙肝、丙肝、水泡性口炎病毒等得治疗中被广泛应用。IFN-α家族由至少13个功能性亚型组成，它们拥有同样的受体系统和相似的生物活性。研究发现它在先天性免疫和适应性免疫方面具有许多重要的功能。作为口蹄疫疫苗佐剂的研究最早见于 Moraes (2003)的报道，国内研究见于2008年，是以干扰素全序列(含有全部信号肽)与口蹄疫病毒VPl结构蛋白序列以及腺病毒载体共表达的活载体疫苗(Veterinary Immunology and Immunopathology, 124, 2008 :274-283)，但安全性目前依然存在风险。本发明的佐剂是用于是将口蹄疫亚单位疫苗中，由于口蹄疫亚单位疫苗不存在自我复制能力，不会整合到试验动物基因组上，安全性很高。本发明优选采用C型FMDV的VPl 和VP3蛋白作为亚单位疫苗的研制对象是基于以下原因首先，C型FMDV的VPl其最主要的结构蛋白，其上含有一个高度保守的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp) (RGD)基序的G-H环(G-H Loop)，是细胞的吸附位点的主要成分，又是重要的中和位点，一般位于VPl 的140-160位氨基酸残基。另外在VPl的C端还存在一个主要的连续性抗原位点，接种动物可以产生中和抗体。其次，C型FMDV的VP3上包括了 B-B knob在内的多个抗原位点，并且与其他小RNA病毒一样，VP3是结构蛋白中结构最为保守的。因此，VP3也可以作为基因工程疫苗制备的基点。需要指出的是，IFN-α制剂已在40多个国家得到广泛使用，用于治疗14种以上类型的癌症，包括一些血源性恶性肿瘤，如毛细胞白血病，慢性骨髓白血病，一些B细胞和T 细胞淋巴瘤及某些实性肿瘤，如黑色素瘤、肾癌，安全性良好。本发明是首次将α干扰素的原核表达产物作为亚单位疫苗佐剂，特别是用作口蹄疫VPl和VP3表达产物的构成的联合疫苗的佐剂。在本发明中由于采用了剔除掉了干扰素的前端8个信号肽的重组猪α-干扰素为佐剂，这种利用剔除干扰素的前端部分信号肽可来提高蛋白的表达量，更有利于佐剂的制备。本发明中在对原核表达产物时进行复性时采用了含DDT和EDTA的盐酸胍溶液。 还原剂DTT可以尽可能的打开半胱氨酸融合蛋白中所有二硫键，EDTA可螯合Cu2+Je3+等金属离子与还原状态的巯基发生氧化反应，从而使得融合蛋白的复性率达到最高。同时DDT 和EDTA可以最大程度的减少融合蛋白质溶液中各种离子型、非离子型表面活性剂等得干扰的作用；复性操作简单，不需要特殊仪器，所用试剂稳定，通常可稳定存放6-12个月。由本实验制备的没有干扰素为佐剂的C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗对IOOLD5tlC型FMDV毒株AV104强毒攻击不能提供保护，而以干扰素为佐剂的C型口蹄疫基因工程亚单位疫苗可以对50LD5(iC型FMDV毒株AV104强毒攻击达到100%保护，对IOOLD50C型FMDV毒株AV104 强毒攻击也能提供83. 3%保护率，同时，以猪α -干扰素为佐剂的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗免疫猪抗体水平是不以猪α -干扰素普通猪用C型口蹄疫基因工程疫苗的2. 2倍。
图1. PCR扩增a-干扰素基因，其中M lDL2000Marker，泳道1RT-PCR扩增猪α -干
扰素产物。图2. PCR和双酶切鉴定干扰素重组载体，其中M DLlOOOOMarker,泳道IPCR从克隆载体上扩增的猪α-干扰素产物，泳道2PCR从表达载体上扩增的猪α-干扰素产物，泳道3EcoR V, EcoR I双酶切鉴定重组表达载体。图3.猪α-IFN表达量比较，其中泳道1本发明所涉及的猪α-IFN基因的融合蛋白，泳道2本发明用于表达量对照的的猪α -IFN全基因的融合蛋白。图4.猪α -干扰素融合蛋白包涵体复性和纯化SDS-PAGE分析，其中泳道1猪 α -IFN融合蛋白的纯化产物，泳道2猪α -IFN融合蛋白的全菌产物。图5.复性后猪干扰素融合蛋白Western-blotting分析，其中M 蛋白Marker， 泳道1猪α -IFN融合蛋白与酶标二抗IgG的反应。图6. ELISA检测疫苗免疫猪后的抗体水平
具体实施例方式本发明实施例分成两个部分完成，即实施例一猪α -干扰素的原核表达和复性； 实施例二 重组猪α-干扰素作为疫苗佐剂的在C型口蹄疫亚单位基因工程疫苗的效力试验(包括豚鼠的免疫和攻毒实验测定)实施例一猪α -干扰素的原核表达和复性取得以口蹄疫病毒攻毒后7天屠宰的猪新鲜脾脏样品，以大连宝生物的试剂盒提取脾脏总RNA，通过RT-PCR方法从脾脏总RNA中获得181个氨基酸的猪α -IFN基因，其氨基酸序列见SEQ. NO. 3，其编码的核苷酸序列见SEQ. NO. 4。将上述基因克隆载体pMD18_T， 转化大肠杆菌DH5 α，挑取阳性质粒测序并与Genbank的猪α -干扰素比较，获得正确的基因；设计猪α -干扰素特异性表达引物，其序列为SEQ. NO. 2，加入EcoR V和EcoR I酶切位点，插入pET-30a，转化大肠杆菌DH5 α，获得的阳性质粒命名为pET_SIFN，与LB培养基培养，进行纯化、复性并用SDS-PAGE和Western-blotting分析猪干扰素融合蛋白特性。具体步骤如下1猪α -干扰素的RT-PCR扩增基因组模板 3ul，IX st印 Enzyme mix 0. 8 μ 1，2Xbuffer 10 μ 1,正反引物各 50pmol、补无菌的超纯水至总体积为50 μ 1，混合均勻。扩增条件50°C 30min,94°C IOmin, 然后于以下条件进行30个循环94°C lmin,56°C lmin,72°C 40s，最后72°C延伸&iiin。本发明用于扩增猪α -干扰素特异性引物，其序列分别为SEQ. NO. 1和SEQ. N0. 2， 即IFN-正向引物5 ‘ -GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3 ‘IFN-反向引物5 ‘ -CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3 ‘；2PCR产物与质粒连接的具体步骤为(1)目标 DNA 片段(20ng)、pMD18_T 载体(50ng)、T4DNALigase 5UU0XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，补无菌的超纯水至总体积10 μ 1。
(2) 16°C连接10 12小时制备成连接好载体的基因，命名为pMD_SIFN。(3)对步骤⑵连接好的样品进行PCR检测；连接产物lul，dNTP(10mM)5y 1, IOXpfu buffer 5 μ 1, pfu DNA polymerase 5U 和正反引物各 50pmol、补无菌的超纯水至总体积为50 μ 1，混合均勻；扩增条件94°C IOmin,然后于以下条件进行30个循环 940C lmin，56°C lmin，72°C 40s，最后 72°C延伸 8min。其中所用的正反向引物见SEQ. NO. 3和SEQ. NO. 4，为IFN-正向引物5 ‘ -GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3 ‘IFN-反向引物5 ‘ -CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3 ‘；(4) 1 % TBE琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察DNA条带。3猪α -干扰素基因序列的原核表达重组载体构建方法(1)从pMD-SIFN扩增的目标DNA 片段 QOng)、pET_30a载体(50ng)、T4DNA Ligase 5UU0XT4DNA Ligase Buffer 1 μ 1，补无菌的超纯水至总体积10 μ 1。(2) 16°C连接10 12小时制备成连接好载体的基因。(3)对步骤⑵连接好的样品进行PCR检测；连接产物lul，dNTP(10mM)5y 1, IOXpfu buffer 5 μ 1, pfu DNA polymerase 5U 和正反引物各 50pmol、补无菌的超纯水至总体积为50 μ 1，混合均勻；扩增条件94°C IOmin,然后于以下条件进行30个循环 940C lmin，56°C lmin，72°C 40s，最后 72°C延伸 8min。其中本实验从pMD-SIFN扩增的目标DNA片段以及PCR测序所用的正反向引物见 SEQ. N0. 5 和 SEQ. N0. 6 为:IFN-ES :5-GCGATATCGCCCCAACCTCAGCCTTCCT-3 (下划线标记为 EcoRV 酶切位点)IFN-EAs :5-GCGAATTCCTCCTTCTTCCTGAGTCTGTCTTGC_3 (下划线标记为 EcoR I 酶切位点)(4)连接好的 pET-SIFN重组基因 IOul，10XH buffer 2ul，EcoR I (8-20U/μ 1)和 Xho I (8-20U/ μ 1)各 1. 5ul，ddH20 定容至 20ul。(5) 1 % TBE琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分析仪下观察DNA条带。4猪α -干扰素基因序列的原核表达、复性及检测将鉴定为阳性的重组载体菌液20 μ L接种至6mL LB培养基中，37°C、200rpm振摇过夜。取过夜培养物20 μ L接种于6mL LB培养基中，37°C振摇培养至0D600为0. 6-1. 0时， 加入IPTG至终浓度为0. 5mM，37°C诱导8h，SDS-PAGE观察各重组菌表达情况。具体方法是将所取菌液样12，OOOrpm离心3min，弃上清。用去离子水重悬菌体至无大的细菌块残留，12. OOOrpm离心3min，弃去上清，去离子水重悬菌体。反复冻融3次， 12，OOOrpm离心3min，吸取上清，菌体用去离子水重悬。取上清和重悬菌体各20 μ L加入 5yL 5 X Loading Buffer，混勻后煮沸7min。蛋白质Marker同样煮沸7min。按预定顺序用微量加样器吸取待分析样品5 μ L，缓慢加入加样孔。每加完一个样品，应在电极缓冲液中彻底清洗微量加样器。加蛋白质分子量标准Marker作参照。200伏电压电泳40min左右， 电泳结束后，染色和脱色，待拍照，记录结果。猪α-干扰素重组基因的表达产物的纯化，具体如下(1)蛋白的制备将pET-30VPl 及 pET_30INF BL21 (DE3)菌过夜培养物 500 μ L 分别加入 200mL 培养基中，37°C，0.5mM IPTG诱导他。诱导结束后将菌液3800rpm，4°C离心15分钟，弃去上清。 去离子水重悬，相同条件离心，弃去上清。用50mL TE缓冲液重悬菌体，200w超声3s停3s， 超声至菌液不再粘稠为止。12，OOOrpm 4°C离心lOmin，弃去上清。(2)包涵体洗涤与变性依次使用包涵体洗涤液BufferA、B、C、D对所制备的包涵体洗涤，其中使用Buffer B洗涤5遍，其余1遍。最后使用8M尿素溶液溶解洗涤后包涵体，4°C过夜。12，000rpm，4°C 离心lOmin。收集上清，取少许上清，使用SDS-PAGE观察洗涤效果。(3)包涵体复性对包涵体复性处理可分别采取不同浓度的尿素、盐酸胍、盐酸胍(含DDT和EDTA) 和70%的甲酸的方法进行复性。将复性成功的包涵体使用SDS-PAGE观察结果。(4)Western-blotting上述的猪α -干扰素重组基因的Wfestern blotting分析(1)电泳取所纯化的各种蛋白制样进行SDS-PAGE。(2)转印将电泳完的凝胶切除浓缩胶后，去离子水清洗表面，然后在膜转移缓冲液中平衡30min。剪1块与凝胶相同大小的PVDF膜，在100%甲醇中浸泡^iin左右后与凝胶在缓冲液中平衡至30min结束。再剪取8块与所取PVDF大小相同滤纸，并在转移缓冲液中浸泡lOmin。然后在正极板上按四层滤纸、PVDF膜、凝胶、四层滤纸的顺序叠放整齐，用玻璃棒轻轻挤压，赶走各层间气泡，确保各层完全接触后盖上负极板，120mA转移150min。(3)封闭转印结束后，取下PVDF膜，按照预先标记剪下蛋白质分子量标准Marker 所在区PVDF膜，置于氨基黑染色液中浸染2-aiiin，取出后用漂洗液(150mM NaCl, 50mM Tris-HCL,pH 7.5)脱色，直至背景兰色脱尽。其余PVDF膜用PBS冲洗，加入10_20mL封闭液，室温轻轻振摇池，或4°C过夜(配制封闭液时要保证脱脂奶粉充分溶解，以免未溶解的奶粉颗粒附着与膜上，影响实验效果)。(4)与一抗的结合封闭结束后，用PBST清洗PVDF膜3次，每次在摇床上振摇 IOmin,加入用PBST适当稀释的各检测抗体10mL，室温振摇1. 5h,用PBST冲洗3次，每次在摇床缓慢摇振IOmin。(5)与二抗的反应加入适当稀释的辣根过氧化物酶标记的与一抗相对应的二抗，室温下轻摇孵育lh，取出用PBST冲洗3次，每次在摇床缓慢摇振lOmin。(6)显色将PVDF膜转移到10_20mL底物溶液中，室温避光轻摇^iin观察显色情况，待出现条带时，立即转入PBS缓冲液中终止反应，室温保存待图像采集。5前述产物测序及实验结果5. 1经测序，由前述所得猪α -干扰素重组基因序列见基因序列表的SEQ. Ν0. 7，其氨基酸序列见基因序列表的SEQ. N0. 8。5. 2上述实施例一实验结果1应用RT-PCR技术，扩增到了猪α -干扰素基因，预期大小相同的目的DNA片段，在电泳图中可以看到一条^Obp左右的两条特异性条带(附图1)。将从琼脂糖凝胶中纯化的猪α干扰素基因DNA片段与表达载体pET_30a重组载体，经PCR、酶切鉴定大小与预期结果相符。(附图2)。经测序，本发明获得了剔除前段8个氨基酸的猪α-IFN基因序列，见序列表 SEQ. Ν0. 7 和 SEQ. N0. 8。
5. 3上述实施例一实验结果2将含有重组质粒的大肠杆菌BL21 (DE3)基因工程菌在不同浓度IPTG诱导下进行表达，取各浓度诱导下的菌液裂解产物做SDS-PAGE分析，结果表明在^kDa出现特异性条带。在IPTG浓度为0. 5mmol/ml下表达量最大，表达产物是融合蛋白且以包涵体形式存在， 并且剔除掉前段8个氨基酸的猪α -IFN基因的表达量高于没有剔除信号肽前段8个氨基酸的的猪α-IFN基因约为20%，惨见附图3。使用Model 422EleCtr0-Eluter切胶回收器回收蛋白与目的蛋白大小一致，而且由本发明的优选复性方法(即采用含DDT和EDTA和盐酸胍复性)所得产物纯度高，紫外分光光度法检测表明，其纯度可以达到85%，参见附图4。上述实施例一融合蛋白包涵体的复性分别用尿素、盐酸胍、盐酸胍(含DDT和 EDTA(其中DDT的终浓度为ImM，EDTA的终浓度为IOmM)和70%的甲酸的方法进行复性结果见表1，其中盐酸胍(含DDT和EDTA)复性率可以达到85%以上，对比结果见下表1。表1不同复性物质复性率的实验结果
权利要求
1.一种猪用C型口蹄疫亚单位疫苗佐剂，其特征在于这种佐剂是重组猪α-干扰素。
2.根据权利要求1所述的猪用C型口蹄疫亚单位疫苗佐剂，其特征在于所用的重组猪 α-干扰素剔除掉了干扰素的前端8个信号肽，其核苷酸序列为SEQ ID Νο3。
3.权利要求1或2所述的猪用C型口蹄疫亚单位疫苗佐剂用于由C型口蹄疫的VPl和 VP3蛋白混合物构成的C型口蹄疫亚单位疫苗。
4.权利要求1所述的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法，其特征在于用经口蹄疫病毒攻毒后屠宰的猪新鲜脾脏提取脾脏总RNA，再通过反转录方法获得猪α -IFN基因，将所得到的猪α -IFN基因连接于原核表达载体上构成质粒，再将质粒转入原核表达系统进行表达，表达产物经复性纯化处理后得到所要的佐剂。
5.权利要求2所述的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法，其特征在于用经口蹄疫病毒攻毒后屠宰的猪新鲜脾脏提取脾脏总RNA，再通过反转录方法获得猪α-IFN 基因，将所得到的猪α-IFN基因连接于原核表达载体上构成质粒，再转入原核表达系统进行表达，表达产物经复性纯化处理后得到所要的佐剂，所用的一对猪α -干扰素基因用 RT-PCR引物为IFN-正向引物5 ‘ -GACCTGGAAGCCTGTGTCAT-3 ‘IFN-反向引物5 ‘ -CTGTCTTGCAGGTTTGTGGA-3 ‘；。所用的原核表达载体为pET-30a ；所用的原核表达系统为大肠杆菌BL21 (DE3)。
6.根据权利要求5所述的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂制备方法，其特征在于产物复性处理时采用了含DDT和EDTA的盐酸胍，其中盐酸胍的终浓度为1. 5M，DDT的终浓度为ImM，EDTA的终浓度为10mM。
全文摘要
本发明公开一种猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂及制备方法，特别是一种用于由C型口蹄疫的VP1和VP3蛋白混合物构成的C型口蹄疫亚单位疫苗的佐剂，以及其制备方法。本发明的猪用C型口蹄疫基因工程疫苗佐剂是重组猪α-干扰素，特别是剔除掉了干扰素的前端8个信号肽的重组猪α-干扰素，其核苷酸序列为SEQ ID No3。
文档编号A61P31/14GK102363043SQ201110303309
公开日2012年2月29日 申请日期2011年10月9日 优先权日2011年10月9日
发明者丁耀忠, 刘永生, 周建华, 张 杰, 陈豪泰, 马丽娜 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所