专利名称：胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种糖尿病相关的药物领域，具体而言，本发明涉及一种延长的胰高血糖素样肽-1的体内半衰期的胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用。
背景技术：
糖尿病是一种遗传因素和多种环境因素相关联的以慢性高血糖为特征的代谢紊乱综合症。由于糖尿病还伴随着诸多并发症，现已成为仅次于恶性肿瘤和心血管疾病之后的第三大健康杀手。1984年，胰高血糖素样肽-KGlucagon-like ρ印tide-l，GLP-l)被发现，它是一种具有30个氨基酸的肠降血糖素，具有促进胰岛素分泌和生物合成，抑制胰高血糖素的分泌，促进胰岛细胞增殖，抑制胰岛细胞凋亡，保存细胞对血糖的敏感性等多种生理功能。GLP-I与其受体结合后能够增加细胞内cAMP浓度并激活蛋白激酶A(PKA)，通过 cAMP/PKA激酶通路增强细胞内胰岛素基因的转录和翻译，并提高对葡萄糖刺激信号的敏感性，从而增加胰岛素分泌量。GLP-I还通过与细胞上的胰高血糖素样肽-1受体(GLP-IR)作用抑制胰高血糖素的分泌，或者间接通过促进胰岛素和生长抑素的分泌来抑制胰高血糖素的分泌。GLP-I作为降血糖药物受到限制的主要原因是GLP-I在体内能够迅速的被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)所降解而失去活性。肠促胰岛素类似物(Exendin-4)是一条39个氨基酸组成的直链多肽，最初由南美巨蜥的唾液分离获得。它与人源GLP-I序列有53%的同源性。Exendin-4同样能够和GLP-I 受体结合，产生促进胰岛素分泌等生理作用，且Exendin-4的N端第二个氨基酸为甘氨酸， 能够耐受血浆中DPP-IV的分解，故Exendin-4被吸收入血后的半衰期较长(tl/2 = 2.4小时)；C端比GLP-I多9个氨基酸，结构上形成了“色氨酸笼” ("Trp-cage")，能够和GLP-I 受体更紧密的结合。由于GLP-I为人源多肽，没有Exendin-4的免疫源性问题，根据其设计的GLP-I类似物在临床试验中副作用较为轻微，已成为设计用于治疗2型糖尿病的GLP-I受体激动剂的理想原型，开发潜力巨大。2010年，诺和诺德公司以GLP-I为原型设计的Liraglutide (中文名利拉鲁肽，商品名Victoza )在美国上市，因其良好的临床效果、较低的副作用以及更好的患者依从度(一天注射一次)赢得了广泛关注，从而掀起了 GLP-I受体激动剂的开发热潮。虽然现在上市的Liraglutide等GLP-1受体激动剂延长了半衰期，但仍需患者每天注射药物，在药物使用舒适度上仍有改进空间。因此有必要进一步提高GLP-I类多肽药物的体内半衰期，提高患者依从度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，提供一种提衰期较长的胰高血糖素样肽-1突变体多肽。本发明的另一个目的是提供上述多肽的制备方法，此外，还提供上述多肽在制备治疗糖尿病和肥胖症的药物中的应用。本发明的又一个目的是提供一种以GLP-I突变体多肽作为有效成分的药物组合物。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种胰高血糖素样肽-1突变体多肽，所述胰高血糖素样肽-1突变体多肽是在SEQ ID NO 1序列多肽的N端加入能形成二硫键的延长多肽形成的突变体，所述的突变体的结构通式如下X1 (ni) -C-X2 (n2) -C-X3 (n3) SEQ ID NO 1其中上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glycine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸 (Valine)，亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine), H1指代上述X1氨基酸的数目，Ii1 = 1 5 ；上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glycine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸 (Valine)，亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)，n2指代上述&氨基酸的数目，n2 = 1 5 ；上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glycine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸 (Valine)，亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)，n3指代上述&氨基酸的数目，n2 = 1 5 ；所述的胰高血糖素样肽-1突变体，多肽内的两个半胱氨酸形成二硫键。所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽选自SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID N04、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 中的任一种。一种上述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽的制备方法，该方法包括胰高血糖素样肽-1突变多肽经多肽合成仪固相制备后，加入50-100mM的二硫基苏糖醇DTT或β -巯基乙醇进行变性，而后于4 °C缓慢氧化或通入氧气形成二硫键。一种药物组合物，所述的组合物含有上述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽。还含有含一种或多种药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体选自水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水或渗透压调节剂。所述水溶性填充剂选自以下的一种或几种甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖或半乳糖；所述pH调节剂为生理可接受的酸、碱和/或盐；所述稳定剂为选自以下的一种或几种EDTA_2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷；所述渗透压调节剂选自氯化钠和/或氯化钾。所述pH调节剂选自以下的一种或几种非挥发性酸枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸或盐酸；碱氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵；盐碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢铵盐；
所述药物组合物为注射剂。所述注射剂为冻干粉针或溶液注射剂。所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽用于治疗和/或预防糖尿病和/或肥胖症的药物组合物中的应用。本发明的有益效果是针对临床上GLP-I类似物在体内存留时间较短，需要每天注射给药的缺限，提供一种半衰期较长的GLP-I突变体多肽，该GLP-I突变体多肽半衰期较长，不需要每天给患者注射，能够有效地提高患者的依从态度。
图1本发明所述的GLP-I突变多肽在小鼠体内的降血糖功能实验的结果示意图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明本发明提供一种胰高血糖素样肽-1突变体多肽，本发明中涉及的突变体的结构通式如下X1 (ni) -C-X2 (n2) -C-X3 (n3) SEQ ID NO 1即 \ (ni) -C-X2 (n2) -C-X3 (n3) 7HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAffLVKGRG36其中，上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glycine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸 (Valine)，亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)0 Ii1指代上述&氨基酸的数目，H1 =1 5。上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glycine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸 (Valine)，亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)0 n2指代上述&氨基酸的数目，n2 =1 5。上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glycine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸 (Valine)，亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)0 n3指代上述&氨基酸的数目，n2 =1 5如上所述的胰高血糖素样肽-1突变体，多肽内的两个半胱氨酸形成二硫键。再一方面，本发明提供如上所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽在制备用于治疗和/或预防糖尿病和/或肥胖症的药物组合物中的应用；优选地，所述药物组合物为注射剂；更优选地，所述注射剂为冻干粉针或溶液注射剂。又一方面，本发明提供一种药物组合物，所述的组合物含有如上所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽。如上所述的药物组合物，其还含有还包含一种或多种药学上可接受的载体；优选地，所述药学上可接受的载体选自水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水和渗透压调节剂；更优选地，所述水溶性填充剂选自以下的一种或几种甘露醇、低分子右旋糖苷、 山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖或半乳糖；更优选地，所述pH调节剂为生理可接受的酸、碱和/或盐，优选选自以下的一种或几种
非挥发性酸如枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸或盐酸，碱如氢氧化钾、氢氧化钠或氢氧化钾或氢氧化铵，盐如碳酸钠或碳酸钾或碳酸铵盐，碳酸氢钠或碳酸氢钾或碳酸氢铵盐；更优选地，所述稳定剂为选自以下的一种或几种EDTA_2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇 4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等，进一步优选自焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、三羟甲基氨基甲烷中的一种或几种；更优选地，所述渗透压调节剂选自氯化钠和/或氯化钾。本发明又一方面还提供上述GLP-I突变多肽的制备方法，该方法包括GLP-1突变多肽经多肽合成仪固相制备后，加入50-100mM的DTT (二硫基苏糖醇)或β-巯基乙醇进行变性，而后于4°C缓慢氧化或通入氧气形成二硫键，即得。本发明再一方面还提供上述GLP-I突变多肽在制备治疗糖尿病的药物中的应用， 以及该多肽复合物在制备治疗和/或预防肥胖症的药物中的应用。并且，所述药物组合物优选为注射剂，更优选地为冻干粉针或溶液注射剂。本发明的又一方面还提供一种药物组合物，包含上述所述的GLP-I突变多肽。优选地，还包含可接受的辅料成分。现结合本发明的目的对本发明逐一加以描述。(I)GLP-I 多月太本发明所述的GLP-I 多肽序列如下SEQ ID NO 1，即 7HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI AffLVKGRG36O) GLP-I 突变多肽本发明所述的GLP-I突变多肽序列如下序列(SEQ ID NO 2-9)，即SEQ ID NO 2 :GCGCGHAEGTFTSCVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGRGCSEQ ID NO 3 :GGCGGCGGHAEGTFTSDVSSYLECQAAKEFIAWLCKGRGCSEQ ID N04 :GGGCGGGCGGGHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGCSEQ ID NO 5 :GCGGCGGHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGCSEQ ID NO 6 :GCGGGCGGGHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGCSEQ ID NO 7 :GGCGGCGGGHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGCSEQ ID NO 8 :GGGCGCGHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGCSEQ ID NO 9 :GGGCGGCGGHAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLCKGRGC(3)本发明的药物组合物本发明的具二硫键的GLP-I突变多肽可以与一种或多种药学上可接受的辅料共同制成药物组合物，这些辅料包括水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水、渗透压调
节剂等等。本发明所述的水溶性填充剂辅料为选自以下的一种或多种甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等。所述pH调节剂选自以下的一种或多种枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸、盐酸等非挥发性的酸，以及氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵、碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢铵盐等生理可接受的有机或无机酸、碱或盐等。
所述稳定剂选自以下的一种或多种EDTA_2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷等。优选为焦亚硫酸钠、磷酸氢二钾、精氨酸、聚乙二醇6000、 三羟甲基氨基甲烷。所述渗透压调节剂为氯化钠和/或氯化钾。(4)注射剂的制备方法本发明的药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。冷冻干燥注射剂的制备方法取多肽溶液适量，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入 0. 1-0.5%活性炭，在0-101下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，采用冷冻干燥法，制得白色疏松块状物，封口即得，每个规格含有GLP-I突变多肽在 5 μ g-lmg0注射液的制备方法取串肽溶液或冻干粉适量，加入水溶性填充剂、稳定剂、渗透压调节剂等，加入注射用水适量，调节PH值至4-8使其溶解，加水稀释至适当浓度，加入 0. 1-0. 5%活性炭，在0-10°C下搅拌10-20分钟，脱碳，采用微孔滤膜过滤除菌，滤液进行分装，封口即得，每个规格含有GLP-I突变多肽在5 μ g-lmg。本发明的药物组合物可以通过肌肉、静脉内、皮下注射途经进行给药，优选的剂型为冻干粉或溶液注射剂。虽然剂量依治疗对象、给药方式、症状及其它因素而改变，本发明的组合物在相当宽的剂量范围内是有效的。在成人的治疗中，剂量范围在5 μ g/人-Img/ 人，每日一次或每几日一次给药。实际剂量应该由医生根据有关的情况来决定，这些情况包括被治疗者的身体状态、给药途径、年龄、体重、患者对药物的个体反应，患者症状的严重程度等等，因此上述剂量范围并不是以任何方式限制本发明的范围。本发明利用二硫键，在GLP-I的N末端形成发夹结构，保护了易受DPPIV降解的多肽N端，克服了半衰期短的问题。所提供的突变多肽中，体内的半衰期均可达到M小时以上，较单独给药的GLP-I的半衰期明显延长，极大地便利了 GLP-I (半衰期仅为2分钟)的临床推广和应用。下面结合具体实施方式
对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1 GLP-I突变多肽体外GLP-I受体结合实验受体结合实验利用GLP-I受体高表达细胞系INS-I (大鼠胰岛细胞-1，购自上海中科院动物中心)进行。首先将INS-I细胞接种于12孔板上，并于实验前2小时用PBS缓冲液冲洗细胞，而后用4%多聚甲醛室温下固定细胞10分钟。细胞计数后，IO5个细胞/孔分别于 GLP-I 突变多肽(SEQ ID 2，SEQ ID 3，SEQ ID 4，SEQ ID 5，SEQ ID 6，SEQ ID 7，SEQ ID 8及SEQ ID9)及天然GLP-I (SEQ ID NO 1)共同孵育2小时。PBS将未与细胞结合的多肽冲洗后，使用GLP-I ELISA试剂盒进行检测。从表1可看出，GLP-I突变多肽较大提高了其与GLP-I受体的结合能力，相比GLP-I而言。表1、GLP-I突变多肽及GLP-I多肽
与体外GLP-I受体结合的结合常数
权利要求
1.一种胰高血糖素样肽-1突变体多肽，其特征在于，所述胰高血糖素样肽-1突变体多肽是在SEQ ID NO 1序列多肽的N端加入能形成二硫键的延长多肽形成的突变体，所述的突变体的结构通式如下X1 (η,) -C-X2 (n2) -C-X3 (n3) SEQ ID NO 1 其中上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glyc ine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸(Valine)， 亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)，H1指代上述&氨基酸的数目，Ii1 = 1 5 ； 上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glyc ine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸(Valine)， 亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)，n2指代上述\氨基酸的数目，n2 = 1 5 ； 上述序列氨基酸残基&指代甘氨酸(Glyc ine)，丙氨酸(Alanine)，缬氨酸(Valine)， 亮氨酸(Leucine)或异亮氨酸(Isoleucine)，n3指代上述\氨基酸的数目，n2 = 1 5 ； 所述的胰高血糖素样肽-1突变体，多肽内的两个半胱氨酸形成二硫键。
2.根据权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽，其特征在于，所述的胰高血糖素样肽-1 突变体多肽选自 SEQ ID NO 2、SEQ ID NO 3、SEQ ID N04、SEQ ID NO 5、SEQ ID NO 6、SEQ ID NO 7、SEQ ID NO 8 或 SEQ ID NO 9 中的任一种。
3.—种权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽的制备方法，其特征在于，该方法包括胰高血糖素样肽-1突变多肽经多肽合成仪固相制备后，加入50-100mM的二硫基苏糖醇DTT或β -巯基乙醇进行变性，而后于4°C缓慢氧化或通入氧气形成二硫键。
4.一种药物组合物，其特征在于，所述的组合物含有权利要求1-3中任一项所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，还含有含一种或多种药学上可接受的载体，所述药学上可接受的载体选自水溶性填充剂、PH调节剂、稳定剂、注射用水或渗透压调节剂。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述水溶性填充剂选自以下的一种或几种甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二醇、葡萄糖、乳糖或半乳糖；所述PH调节剂为生理可接受的酸、碱和/或盐；所述稳定剂为选自以下的一种或几种EDTA-2Na、硫代硫酸钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、 磷酸氢二钾、碳酸氢钠、碳酸钠、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫酸钠或三羟甲基氨基甲烷；所述渗透压调节剂选自氯化钠和/或氯化钾。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述PH调节剂选自以下的一种或几种非挥发性酸枸橼酸、磷酸、乳酸、酒石酸或盐酸；碱氢氧化钾、氢氧化钠、氢氧化钾或氢氧化铵；盐碳酸钠、碳酸钾、碳酸铵盐、碳酸氢钠、碳酸氢钾或碳酸氢铵盐。
8.根据权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为注射剂。
9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述注射剂为冻干粉针或溶液注射剂。
10.权利要求1、2或3中任一项所述的胰高血糖素样肽-1突变体多肽在治疗和/或预防糖尿病和/或肥胖症的药物组合物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用，所述突变多肽由胰高血糖素样肽-1突变体N末端添加含有Cys的延长多肽而成，并且所述突变多肽自身折叠成二硫键，所述胰高血糖素样肽-1突变多肽用于制备治疗糖尿病、治疗和/或预防肥胖症的药物组合物。针对临床上GLP-1类似物在体内存留时间较短，需要每天注射给药的缺限，提供一种半衰期较长的GLP-1突变体多肽，该GLP-1突变体多肽半衰期较长，不需要每天给患者注射，能够有效地提高患者的依从态度。
文档编号A61K47/48GK102363633SQ20111036192
公开日2012年2月29日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者李瑛 申请人:天津拓飞生物科技有限公司