免疫刺激性寡核糖核苷酸的制作方法

专利名称：免疫刺激性寡核糖核苷酸的制作方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及免疫学领域，更具体地涉及免疫刺激性分子。更特别地，本发明涉及具有免疫刺激活性的核糖核酸(RNA)分子，包括寡核糖核苷酸。
背景技术：
Toll样受体(TLR)是高度保守的模式识别受体(PRR)多肽家族，其识别与病原体结合的分子模式(PAMP)，在哺乳动物的先天免疫(innate immunity)中起关键作用。目前已经鉴定出了至少十个家族成员，它们被命名为TLR1-TLR10。多种TLR的胞浆结构域特征在于 jToll-白介素 1 受体(TIR)结构域。Medzhitov R et al. (1998)Mol Cell 2 :253_8。 TLR对微生物侵入的识别引发信号级联放大的激活，这在果蝇(Drosophila)和哺乳动物中是保守的。已经报导含IlR结构域的适体蛋白MyD88与TLR结合，将与白介素1受体结合的激酶(IRAK)和肿瘤坏死因子(TNF)受体结合的因子6(TRAF6)募集至TLR。人们认为， MyD88-依赖性的信号转导途径导致NF-κ B转录因子和c-Jim NH2末端激酶(Jnk)促有丝分裂剂(mitogen)-激活的蛋白激酶(MAPK)的活化，这是免疫激活中及炎症细胞因子产生的关键步骤。综述参阅 Aderem A et al. (2000)Nature 406 :782-87和Akira S et al. (2004) Nat Rev Immunol 4 :499-511。已经鉴定出了大量的特异性TLR配体。TLR2的配体包括肽聚糖和脂肽。Yoshimura A et al. (1999) J Immunol 163 1-5 ；Yoshimura A et al. (1999) J Immunol 163:1—5; Aliprantis AO et al. (1999) Science 285 :736_9。脂多糖(LPS)是TLR4 的配体。Poltorak A et al. (1998)Science 282 :2085-8 ；Hoshino K et al. (1999)J Immunol 162 :3749_52。 细菌鞭毛蛋白是 TLR5 的配体。Hayashi F et al. (2001)Nature 410:1099-1103。已经报导肽聚糖不仅是TLR2的配体，而且还是TLR6的配体。Ozinsky A et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97 :13766-71 ；Takeuchi 0 et al. (2001)Int Immunol 13 :933—40。 最近报导某些低分子量合成化合物咪唑喹啉咪喹莫德(imidazoquinolines imiquimod, R-837)和瑞喹莫德(resiquimod，R-848)是 TLR7 和 TLR8 的配体。Hemmi H et al. (2002) Nat Immunol 3 :196-200 Jurk M et al. (2002)Nat Immunol 3 :499。从近来发现未甲基化的细菌DNA及其合成的类似物(CpG DNA)是TLR9的配体 (Hemmi H et al. (2000)Nature 408 :740-5 ；Bauer S et al. (2001)Proc Natl Acad Sci USA 98,9237-42)开始，已经有报导某些TLR的配体包括某些核酸分子。目前已经报导某些类型的RNA以序列非依赖性或序列依赖性形式是免疫刺激性的。另外，已经报导这些多种免疫刺激性RNA能刺激TLR3、TLR7或TLR8
发明内容
一般而言，本发明涉及含有某些免疫刺激性RNA基序的免疫刺激性的寡核糖核苷酸(ORN)，以及含有这类免疫刺激性ORN的相关免疫刺激性组合物，和这类免疫刺激性ORN 和组合物的使用方法。本发明的免疫刺激性ORN适用于任何用于刺激或增强免疫应答的装置(setting)或应用中。如下文所公开的，本发明的免疫刺激性ORN尤其适用于制备含有佐剂、疫苗、和其它药剂的药物组合物，所述药物组合物用于治疗多种病症，包括感染、癌症、变态反应和哮喘。因此，本发明在某些方面涉及含有本发明的免疫刺激性ORN的免疫刺激性组合物，以及它们的使用方法。如下文所公开的，本发明的免疫刺激性ORN和免疫刺激性组合物尤其适用于下述方法中，所述方法用于激活免疫细胞，疫苗接种受试者，治疗患有免疫系统缺陷的受试者，治疗患有感染的受试者，治疗患有自身免疫疾病的受试者， 治疗患有癌症的受试者，治疗患有变应性病症的受试者，治疗患有哮喘、气道重建(airway remodeling)、促进表位扩展和抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的受试者。如下文更详细地公开的，本发明的免疫刺激性ORN的特征在于它们包含至少一种序列依赖性的免疫刺激性RNA基序。序列依赖性的免疫刺激性RNA基序通常是短的RNA序列，尽管在某些实施方案中该基序也可以含有修饰，例如经修饰的核苷酸间磷酸联接、经修饰的核碱基(nuclecAase)、经修饰的糖、核苷酸类似物或其任何组合。如下文更详细地描述的，在一个实施方案中，免疫刺激性RNA基序存在于本发明的较长免疫刺激性ORN的环境中。免疫刺激性RNA基序也可以存在于嵌合的DNA:RNA核酸分子的环境中。序列依赖性的免疫刺激性RNA基序和加入有了这些基序的免疫刺激性ORN被公开为TLR8的激动剂。更具体地，至少某些序列依赖性免疫刺激性RNA基序、免疫刺激性ORN 和免疫刺激性DNA: RNA核酸分子被公开为是TLR8的激动剂而不是TLR7的激动剂。根据本发明一些方面的免疫刺激性RNA基序是N-U-R1-I^N是核糖核苷酸，并且N不包括U。在一些实施方案中，N为腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。U是尿嘧啶或其衍生物。R是核糖核苷酸，其中队和&至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物。R不是 U,除非N-U-R1-K含有至少两个A。本发明的ORN含有至少一个以及在一些实施方案中含有多于一个(即2、3或4个) 免疫刺激性基序N-U-R1-I^ ORN不含有TLR7/8基序。ORN优选长度为4-100，并任选地含有至少一处主链修饰。在一些实施方案中N-U-R1-Ii2可含有至少3个As或至少2个Cs。任选地，N-U-R1-Ii2 含有至少一个G或C。在一些实施方案中，ORN不是 ACCCAUCUAUUAUAUAACUC (SEQ ID NO 89)。在其它一些实施方案中，ORN基序通过非核苷酸接头与5’核糖核苷酸分隔。还在其它一些实施方案中，ORN基序通过非核苷酸接头与3’核糖核苷酸分隔。任选地，ORN基序通过非核苷酸接头与5’和3’核糖核苷酸分隔。ORN还包含可药用的运载体，其任选地是脂质运载体如N- [1- (2，3_ 二油酰氧)丙基]-N，N, N三甲基铵甲基硫酸酯(DOTAP)。在其它一些实施方案中，ORN不与DOTAP复合。ORN可以是单链或双链的。在其它一些实施方案中，ORN含有至少一个AU。还在其它一些实施方案中，ORN含有至少一个⑶。在一些实施方案中，ORN为以下之一A*U*A*G*G*C*A*C(SEQ ID NO :4)、G*C*C*
A氺C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺U氺A氺U氺A氺OKC(SEQ ID NO :11)、A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺 (SEQ ID NO : 12)、U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U氺A氺U氺U (SEQ ID NO 13)、A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A (SEQ ID NO 16)、A氺A氺A氺U氺A氺A氺A 氺U氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U(SEQ ID NO 17) >A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺
A*A*U(SEQ ID NO :1 、C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U*A*C*U(SEQ ID NO :24)、
(SEQ ID NO 30),(SEQ ID NO :3 、
U*U*A*C*C*C (SEQ ID NO :幼)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C (SEQ ID NO :76)、C*C*
G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺U氺A氺C氺C氺C氺C(SEQ ID NO :42)、C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺C(SEQ
ID NO 39)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*A*U*U*A*C*C(SEQ ID NO 65)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A* U*C*C*C*C*C (SEQ ID NO :44)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C (SEQ ID NO :47)、C*C*
(SEQ ID NO 38) >(SEQ
ID NO 37)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO :40)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U* A*U*C*C*C*C(SEQ ID NO 55)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C(SEQ ID NO 82)、C*C*
G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺G氺A氺U氺A氺C氺C(SEQ ID NO :85)、C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺U氺G氺U氺A氺C氺C(SEQ
ID NO 63)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO 43)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A* U*A*U*C*C*C(SEQ ID NO :36)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C(SEQ ID NO :87)、C*C*
(SEQ ID NO 45) >(SEQ
ID NO 41)、C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺G氺A氺A氺G氺G氺U氺G氺C氺C (SEQ ID NO 83)、C氺C氺G氺A氺G氺C氺C氺G氺C氺A氺 U*C*C*C*C*C(SEQ ID NO :46)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C(SEQ ID NO 88)、C*C* G*A*G*OOG*OOG*OOOOC (SEQ ID NO 35) >(SEQ
ID NO :84)，或 C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C(SEQ ID NO :56)。ORN特别排除TLR7/8基序。TLR7/8基序可含有例如选自以下的核糖核苷酸序列(i)5' -C/U-U-G/U-U-3‘，(ii)5' -R-U-R-G-Y-3‘，(iii)5' -G-U-U-G-B-3‘，(iv)5' -G-U-G-U-G/U-3 ‘，禾口(ν) 5' -G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3‘，其中C/U为胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U为鸟嘌呤(G)或U，R为嘌呤，Y为嘧啶， B为U、G或C，G/C为G或C，且A/C为腺嘌呤㈧或C。在多种实施方案中，5‘ -C/U-U-G/U-U-3 ‘为 CUGU、CUUU, UU⑶或 UUUU。在多种实施方案中，5'-R-U-R-G-Y-3 ‘为 GUAGU、GUAGC、⑶GGU、⑶GGC、AUAGU、 AUAGC, AUGGU或AUGGC。在一个实施方案中，碱基序列为GUA⑶⑶。在多种实施方案中，5' -G-U-U-G-B-3‘为⑶UGU、⑶UGG或GUUGC。在多种实施方案中，5' -G-U-G-U-G/U-3'为GUGUG或GUGUU。在一个实施方案中， 碱基序列为GUGUUUAC。在多种实施方案中，5'-G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3 ‘为 GUAGGCAC、GUCGGCAC、 CUAGGCAC 或 CUCGGCAC。
本发明的一个方面提供了包含本发明免疫刺激性ORN和佐剂的免疫刺激性组合物。在多种实施方案中，佐剂为产生储存作用(depot effect)的佐剂、免疫刺激性佐剂、或产生储存作用并刺激免疫系统的佐剂。在一个实施方案中，根据本发明该方面的免疫刺激性组合物是免疫刺激性ORN和佐剂的缀合物。在根据本发明该方面的一个实施方案中，免疫刺激性ORN与佐剂共价连接。在其它一些实施方案中它们不缀合。在一个实施方案中， 佐剂是TLR9的激动剂。在一个实施方案中，佐剂是免疫刺激性的CpG核酸。本发明的组合物可任选地含有抗原。因此，本发明的一个方面提供了下述疫苗，其中所述疫苗含有本发明的免疫刺激性ORN和抗原。本发明的一个方面提供了一种疫苗，所述疫苗含有本发明的免疫刺激性ORN和抗原的缀合物。在一个实施方案中，根据本发明该方面的缀合物含有与抗原共价连接的免疫刺激性0RN。在其它一些实施方案中，它们不缀合。在多个实施方案中，抗原可以是抗原本身。抗原可以是任何抗原，包括癌症抗原、微生物抗原或变应原。本发明的一个方面提供了免疫刺激性组合物，所述组合物含有本发明的免疫刺激性ORN与亲脂部分的缀合物。在一个实施方案中，免疫刺激性的ORN与亲脂部分共价连接。 在一个实施方案中，亲脂部分选自胆固醇基、棕榈基和脂肪酰基。在一个实施方案中，亲脂部分是胆固醇的衍生物，例如胆固醇基。在一个实施方案中，免疫刺激性ORN含有至少一个脱氧核糖核苷酸。所述至少一个脱氧核糖核苷酸通常可以出现在免疫刺激性RNA基序之外的任何地方。在多个实施方案中，所述至少一个脱氧核糖核苷酸为 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、 19、20、21、22、23或M个连续的脱氧核糖核苷酸。本发明也考虑了包含非连续的脱氧核糖核苷酸的免疫刺激性0RN。在多个实施方案中，至少一个脱氧核糖核苷酸是免疫刺激性ORN 的5’端、3’端或5’和3’两端。所述至少一个脱氧核糖核苷酸也对应于嵌合的DNA:RNA分子的DNA部分。在一个实施方案中，嵌合的DNA: RNA分子的DNA组分包括CpG核酸，即TLR9 激动剂。在一个实施方案中，嵌合的DNA: RNA分子的DNA和RNA部分通过核苷酸间磷酸键共价连接。在另一实施方案中，嵌合的DNA: RNA分子的DNA和RNA部分通过接头(例如非核苷酸接头)共价连接。本发明的一个方面提供了免疫刺激性组合物，所述组合物包含共价闭合的、部分单链的、 铃形的核酸分子，其中该分子的至少一个单链部分包含本发明的免疫刺激性RNA基序。本发明的一个方面提供了包含本发明前述任何方面的组合物和任选的可药用运载体的药物组合物，所述组合物与选自以下的递送媒介物结合阳离子脂质、脂质体、螺旋状的(cochleate)、病毒颗粒、免疫刺激性复合物(ISCOM)、微粒、微球、毫微球、单层囊泡 (LUV)、多层囊泡、水包油乳剂、油包水乳剂、乳体(emulsome)和聚阳离子肽。在根据本发明该方面的一个实施方案中，药物组合物包含抗原。可以在喷雾器或吸入器中配制0RN，例如定量吸入器(metered dose inhaler)或干粉吸入器。在一些实施方案中，ORN还包含额外的组合物，例如化学治疗剂、抗病毒剂或可药用运载体。可药用运载体可以被配制为用于注射或粘膜施用。另外，根据本发明的这些方面和其它方面，在多种实施方案中，免疫刺激性ORN可任选包含至少一个5' -5'核苷酸间联接、至少一个3' -3'核苷酸间联接、至少一个包含接头部分的5' -5'核苷酸间联接、至少一个包含接头部分的3' -3'核苷酸间联接，或其任何组合。在一个实施方案中，接头部分是非核苷酸接头部分。另外，还根据本发明的这些方面和其它方面，在多种实施方案中，免疫刺激性 ORN可任选包含至少一个2' -2'核苷酸间联接、至少一个2' -3'核苷酸间联接、至少 2' -5'核苷酸间联接或其任何组合。在优选的实施方案中，所述至少一个2' -2'核苷酸间联接、至少一个2' -3'核苷酸间联接、或至少2' -5'核苷酸间联接存在于免疫刺激性 RNA基序之外。还根据本发明的这些和其它方面，在一个实施方案中，免疫刺激性ORN包含至少一个倍增单元(multiplier unit)。因此，在某些实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN 可以具有分支结构。分支的组合物可以包含任意组合的3' -5'、5' -5'、3' -3'、 2' -2'、2' -3'或2' -5'核苷酸间键。在一个实施方案中，免疫刺激性ORN包含至少两个倍增单元，产生所谓的树状聚体(dendrimer)。另外，在某些实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN可包含两个或更多的免疫刺激性RNA基序，其例如在分支结构的不同臂上沿线性ORN随机排列，或均沿线性ORN随机排列并位于分支结构的不同臂上。分支结构(包括树状聚体)可任选的包含至少一个免疫刺激性的CpG核酸，例如作为分支结构的独立臂。还根据本发明的这些和其它方面，在一个实施方案中，免疫刺激性ORN不包含CG DNA或RNA 二核苷酸。本发明的一个方面提供了用于下调免疫抑制性CD4+调节(Treg)细胞的方法。根据本发明该方面的方法包括下述步骤将CD4+Treg细胞与有效量的含本发明的TLR8-特异性免疫刺激ORN的组合物接触，以降低⑶4+Treg细胞的抑制作用。在一个实施方案中，组合物包含TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特异性ORN和免疫刺激性 CpG核酸未连接。在一个实施方案中，组合物含有TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特异性的ORN和免疫刺激性CpG核酸作为缀合物存在。本发明另一方面提供了用于调控受试者中免疫应答的方法。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。在一些实施方案中，ORN可以被递送给受试者，以在受试者中治疗自身免疫疾病或气道重建。ORN可以单独或与抗原一起被施用给受试者。任选地，以例如口、鼻、舌下、静脉内、皮下、粘膜、呼吸、直接注射和经皮的途径递送ORN。ORN可以以有效量递送给受试者以诱导细胞因子表达，例如TNFa、IL_10、IL_6、 IFN-γ、MCPl 禾口 IL-12。本发明的一个方面提供了对受试者疫苗接种的方法。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用抗原和本发明的免疫刺激性ORN的步骤。本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有传染性疾病或具有患传染性疾病的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN 的步骤。在一个实施方案中，受试者患有病毒感染。病毒感染可以是例如乙型肝炎或丙型肝炎。也可以对受试者施用抗病毒剂。任选地，抗病毒剂与ORN连接。本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。 在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN的步骤。在一个实施方案中，也对受试者施用化学治疗或辐射。本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有癌症或具有患癌症的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的组合物的步骤，所述组合物含有本发明的TLR8-特异性免疫刺激性ORN以降低CD4+Treg细胞的抑制作用。在一个实施方案中，组合物包含TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特异性ORN 和免疫刺激性CpG不连接。在一个实施方案中，组合物包含TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸，其中TLR8-特异性ORN和免疫刺激性CpG核酸作为缀合物存在。本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有变应性病症或具有患变应性病症的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN 的步骤。在一个实施方案中，受试者患有变应性鼻炎。本发明的一个方面提供了用于治疗受试者的方法，所述受试者患有哮喘或具有患哮喘的风险。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明组合物的步骤。 在一个实施方案中，该方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN的步骤。在一个实施方案中，哮喘是被病毒感染加重的哮喘。ORN可以单独或与变应原一起被施用。本发明的另一方面提供了用于治疗患有气道重建的受试者的方法。根据本发明该方面的方法包括对受试者施用有效量的本发明免疫刺激性ORN的步骤。本发明的一个方面提供了用于提高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的方法。根据本发明该方面的方法包括下述步骤对需要增加的ADCC的受试者施用有效量的本发明的免疫刺激性ORN和抗体，以增加ADCC。在一个实施方案中，抗体是对癌症抗原或癌细胞表达的其它抗原特异的抗体。在一个实施方案中，抗体为IgG抗体。本发明的一个方面提供了用于增强表位扩展的方法。根据本发明该方面的方法包括下述顺序步骤将免疫系统的细胞与抗原接触，随后将该细胞与至少两份剂量的本发明的免疫刺激性ORN接触。在一个实施方案中，该方法体内进行。在一个实施方案中，该方法包括下述步骤以能有效诱导多重表位特异性免疫应答的量对受试者施用包含抗原和佐剂的疫苗，随后对受试者施用至少两份剂量的本发明的免疫刺激性0RN。该方法在一个实施方案中涉及应用治疗方案，所述方案导致受试者中的免疫系统抗原暴露，然后以能有效诱导多重表位特异性免疫应答的量对受试者施用至少两份剂量的本发明的免疫刺激性0RN。 在多种实施方案中，治疗方案为手术、辐射、化学治疗、其它癌症药剂、疫苗或癌症疫苗。在一个实施方案中，所述至少两份剂量的免疫刺激性ORN彼此隔开至少一天到一周被施用。 在一个实施方案中，所述至少两份剂量的免疫刺激性ORN彼此隔开至少一周到一个月被施用。在一个实施方案中，所述至少两份剂量的免疫刺激性ORN彼此隔开至少一个月到六个月被施用。一方面，本发明是通过将表达TLR8的细胞与下述用量的包含N-U-R1-I的RNA寡核糖核苷酸(ORN)接触，其中N是核糖核苷酸且N不包括U，U是尿嘧啶或其衍生物，R是核糖核苷酸，其中札和&至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物，其中R不是U，除非 N-U-R1-R2含有至少两个A，其中所述ORN不包含TLR7/8基序，并且其中所述ORN长度为 4-100，所述用量有效刺激前炎性细胞因子生产并且其中应答于ORN的IFN-α生产相对于背景而言不被显著诱导。在一些实施方案中，应答于ORN的IFN-α生产少于300pg/ml。在一个实施方案中，ORN 不是 ACCCAUCUAUUAUAUAACUC (SEQ ID NO 89)。ORN 可以与 N_[l_(2， 3-二油酰氧)丙基]-N，N，N三甲基铵甲基硫酸酯(DOTAP)复合或不复合。在一些实施方案中，表达TLR8的细胞是单核细胞或mDC。还在其它一些实施方案中，表达TLR8的细胞是体外的或体内的。本发明的这些和其它特征将在发明详述部分被更详细地描述。附图概述

图1是描述在PBMC刺激时由ORN诱导的细胞因子生产。通过测量IFN-α和TNF-α 细胞因子生产，观察到TLR8和TLR7/8之间的差异。在完全滴定曲线上用与D0TAP(25y g/ ml，1/3稀释度)复合的指定0RM2yM，l/3稀释度)或用R-848 O μ M，1/3稀释度)刺激人 PBMC0 16小时后收集上清液，并通过ELISA测量IFN- α (图Ia)和TNF- α (图lb)。数据显示了至少三份独立实验的三个血供体的均值。DOTAP单独不显示作用。ORN可与DOTAP复合， R-848不复合。DOTAP单独是对照。在图Ic中，用与DOTAP O. 2 μ g/ml)或与R-848 O μ Μ) 复合的0. 2 μ M指定的ORN刺激人PBMC。16小时后收集上清液并通过ELISA测量IFN-α (左图)和TNF-α (右图)。数据显示了 3个供体的均值(士SEM)。图2是一组柱状图，其描述了经分离的pDC(图2a)、单核细胞(图2b)和mDC(图 2c)刺激时由ORN诱导的细胞因子生产。用与10μ g/mlD0TAP、0. 5μΜ CpG ODN或DOTAP 复合的0. 5 μ M ORN或单独的培养基刺激细胞，并测量IFN- α (图加)、TNF- α (图2c)和 IL-12p40(图 2c)。图3是一组柱状图，其阐述了 PBMC刺激时由ORN诱导的细胞因子生产。用与10 μ g/ml DOTAP复合的指定ORN(0. 5 μ M 0RN)刺激人PBMC,并通过ELISA技术测量 IFN-α (图3Α)和TNF-α (图3Β)和通过Luminex技术测量细胞因子生产。图4是阐述指定ORN的(图4a)和TNF- α (图4b)最大活性比较的柱状图。用与 DOTAP (从25 μ g/ml开始，稀释度1/3)复合的ORN(7种浓度，从2 μ g/ml开始，1/3稀释度) 刺激人PBMC，并对两份单独实验中0. 6 μ M处3-6个血供体的平均最大活性进行了测定。图5是阐述IFN- α最大活性(图5a)与IFN- α EC50 (图5b)比较的柱状图。用于DOTAP复合的ORN刺激人PBMC并测量IFN- α。图6 是一组图，其比较了带有 TLR8 (SEQ ID NO :13)或 TLR7/8 (SEQ ID NO :21)的 ORN对3个血供体的PBMC、经分离的pDC或经分离的单核细胞的滴定曲线。用与DOTAP (从 25 μ g/ml开始，1/4稀释度)复合的ORN (4种浓度，从1 μ g/ml开始，1/4稀释度)刺激细胞。 16小时后收集上清液并通过Luminex技术测量细胞因子生产。图显示SEQ ID NO =21(0, 3μΜ)细胞因子生产百分比。图7-1到7-4显示了一组柱形图，其阐述在任何浓度的3个血供体对PMBC、经分离的单核细胞、经分离的PDC和⑶14-⑶123-PBMC的平均最大活性。用与DOTAP (从25 μ g/ml 开始，1/4稀释度)复合的ORN(4种浓度，从1 μ g/ml开始，1/4稀释度)刺激细胞。16小时后收集上清液并通过Luminex技术测量细胞因子生产。红色正方形指示在DOTAP和培养基的背景上的阳性反应。图 8 是一组柱形图，其显示了 TLR8 (SEQ ID NO 13)和 TLR7/8 (SEQ ID NO 21) ORN 之间的差异。用与DOTAP (从25 μ g/ml开始，1/4稀释度)复合的0RM4种浓度，从1 μ g/ ml开始，1/4稀释度)刺激细胞。16小时后收集上清液并通过Luminex技术测量细胞因子生产。图表显示测量的任何浓度下的平均最大细胞因子生产，其表示为TLR8 ORN(SEQ ID NO 13)比TLR7/8 ORN (SEQ ID NO 21)的百分比。针对经分离的pDC、PBMC、经分离的单核细胞和CD123-CD14-PBMC显示。
图9是一组图和曲线，其显示了经稳定转染的HEK-293细胞中通过TLR8作用的 TLR8 ORN(SEQ ID NO 13)和TLR7/8 ORN(SEQ ID NO 21)的反应。用指定的ORN将HEK-293 细胞刺激16小时，所述HEK-293细胞用NF κ B-萤光素酶读出报告子和人TLR8稳定转染。 16个小时后去除上清液，将细胞裂解并测量萤光素酶活性或细胞因子水平。图9a和9b显示了刺激后NFK B-萤光素酶的倍数诱导。图9c显示了存在抑制剂时刺激后NF κ B-萤光素酶的倍数诱导。图9d显示了通过萤光素酶测定测量的刺激后的IP-10刺激。
图10是一组图表，其显示了用富含AU或富含⑶的ORN刺激的人pDC上的表面标记物表达。用与25 μ g/ml DOTAP复合的1 μ M ORN或单独用DOTAP (图IOa)，或指定量的与 DOTAP复合的ORN或单独用DOTAP (图IOb-IOc)孵育CD123+经纯化的pDC(图IOa和IOb) 或经分离的单核细胞(图IOc)。16小时后收集细胞并用⑶123、⑶Ilc和HLA-DR抗体(图 IOa 和 IOb)或 CD14 和 CD19 (图 IOc)染色。通过 CD86 (图 IOa 和 IOb)或 CD80 (图 IOc)表达测量细胞表面标记物激活。图IOa显示FACS分析，其证明了富含AU的0RN(SEQ ID NO 13)和富含⑶的ORN(SEQ ID NO 21)在pDC刺激时的⑶86表面标记物表达中显示差异。 图IOb是阐述人pDC刺激时的⑶86表面标记物表达是剂量依赖性的。图IOc是显示以下内容的图富含AU的ORN(SEQ ID NO 13)和富含GU的ORN(SEQ ID NO 21)在人PBMC (数据未显示)和⑶14-阳性细胞刺激时在⑶80表面标记物表达中显示无差异。
图 11 是一组柱形图，其显示了 TLR8 ORN(SEQ ID NO :13)和 TLR7/80RN(SEQ ID NO 21)之间的差异。使用SEQ ID NO 5 ORN作为对照。将牛PBMC与10 μ g/ml ORN(HD) 或2. 5 μ g/ml ORN(LD)孵育48小时。收集上清液并用ELISA分析。图lla_c分别显示了 IL-12、IFN- γ 和 TNF- α 的水平。
图12是一组展示出下述内容的图表鼠细胞体内或体外不应答于富含AU的ORN SEQ ID NO: 13。使用的细胞是小鼠巨噬细胞系RaW64. 7细胞(图12a)、J774细胞(图 12b)、经纯化的小鼠CDllc+细胞(svU9小鼠)(图12c-12g)和体内小鼠细胞。通过ELISA 评价细胞因子浓度。
图13是展示下述内容的图表大鼠脾细胞不应答于富含AU的ORN SEQ ID N0:13。 将来自3只Sprague-Dawley大鼠的脾细胞合并，并用指定浓度的SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :13(均与 62. 5 μ g/ml DOTAP 复合，1/5 稀释度)、R_848 或 DOTAP 单独(62. 5 μ g/ml_>l/5 稀释度)刺激。20小时后收集上清液并通过ELISA测量TNF-α水平。
发明详述
本发明的一部分涉及本发明的发明人对大量序列特异性的免疫刺激性RNA基序的发现。目前已经发现含有免疫刺激性RNA基序的分子(单独或与某些其它成分组合) 是重要的免疫刺激性化合物，其在用于治疗患有病症或具有患病症风险的受试者的大量方法中有用，所述病症中诱导、增加或更改免疫应答会是有利的。在一个实施方案中，本文所使用的本发明的免疫刺激性组合物是本发明的免疫刺激性0RN。
已经发现某些序列特异性RNA基序是免疫刺激性的，其通过TLR8作用，与作用于 TLR7和TLR8的其它基序(富含GU和富含CU)相反。RNA寡核苷酸(RON)(优选含有富含AU的序列)通过TLR8刺激免疫应答。已经在不同种类的ORN (例如含有含AU和含⑶重复的0RN)中观察到IFN- α、TNF- α、IFN- γ和IL-12生产之间的差异。有趣的是，已经发现本发明的免疫刺激性ORN生产强的前炎性细胞因子应答，而IFN-α和IFN-α相关的分子除外。用这些新颖的ORN刺激时IFN-α生产减少或缺乏。根据本发明一些方面的免疫刺激性RNA基序为N-U-R1-I^N是核糖核苷酸，并且N不包括U。在一些实施方案中，N为腺苷或胞嘧啶(C)或其衍生物。U是尿嘧啶或其衍生物。R是核糖核苷酸，其中队和&至少之一是腺苷(A)或胞嘧啶或其衍生物。R不是 U,除非N-U-R1-K含有至少两个Α。本发明的ORN含有至少一个和在一些实施方案中含有多于一个(即2、3或4个) 免疫刺激性基序N-U-R1-I^ ORN不含有TLR7/8基序。ORN是寡核苷酸。任选地，该寡核苷酸长度为4-100。ORN长度也可以是例如8_40、 15-25或20-30个核苷酸。ORN任选地含有至少一个主链修饰。在一些实施方案中N-U-R1-R2可含有至少3个As或至少2个Cs。任选地，N-U-R1-R2 含有至少一个G或C。在一些实施方案中，ORN不是 ACCCAUCUAUUAUAUAACUC (SEQ ID NO 89)。ORN还可包含可药用的运载体，其任选地是脂质运载体如N- [1- (2，3_ 二油酰氧) 丙基]-N，N, N三甲基铵甲基硫酸酯(DOTAP)。在其它一些实施方案中，ORN不与DOTAP复合。在其它一些实施方案中可药用运载体可以是肽，如聚阳离子肽。聚阳离子肽包括例如多重的多聚赖氨酸、多聚精氨酸和多聚肽(其在多于5个、特别是多于8个氨基酸残基的范围内含有多于50%的碱性氨基酸、特别是精氨酸或赖氨酸残基)或其混合物，并可例如含有天然存在的昆虫抗菌蛋白质。在其它一些实施方案中，ORN含有至少一个AU。除了是序列特异性的以外，作为单链RNA、部分双链RNA或完全双链RNA的免疫刺激性RNA基序是有效的。对本发明的ORN和具有TLR7/8基序(即含⑶的重复)的ORN而言，观察到IFN-α 和IFN-α相关分子和其它前炎性细胞因子如TNF-α、IFN-γ、IL-10、IL_6和IL-12的生产之间的清晰差异。具有N-U-R1-I基序的本发明的0RN，例如那些含有AU或AUU重复(SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13)的ORN在PBMC和pDC刺激时显示无IFN-α细胞因子生产。相反，具有一列中三个或更多U(SEQ ID NO :14, SEQ ID NO :15)的ORN诱导IFN-α生产，尽管存在As。有趣的是，使用相同的、单室用A交换G的ORN组时，观察到PBMC刺激时的强 IFN-α生产。本文存在的数据强烈地提示两个不同ORN种类的存在一种作用于表达TLR8 的细胞，如单核细胞和 mDC (SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :16_SEQ ID NO :18)、 含本发明的N-U-R1-I基序的0RN，另一种作用于表达TLR7/8 二者的细胞，例如含有⑶、⑶ 和 GUU 序列的单核细胞、mDC 和 pDC (SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15、SEQ ID N0:19_SEQ ID NO 23)。因此，本发明的ORN具有诱导免疫应答而不诱导相对于背景的显著量IFN-α或 IFN-α相关分子的能力。相对于背景的显著量的IFN-a或IFN-α相关分子优选是相对于背景的IFN-α或IFN-α相关分子水平改变少于20 %。在一些实施方案中，其少于 15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。在其它一些实施方案中，被诱导的 IFN-α或相关分子等于背景或少于背景水平。还在其它一些实施方案中，被本发明ORN诱导的IFN-α少于或等于被TLR7/8 ORN诱导的IFN-α的20%。被本发明的ORN诱导的 IFN-α在体外测试中可任选的少于300pg/ml，或可以具有大于1. 5μΜ的EC50。
本文使用的IFN-a相关分子是与IFN-α表达相关的细胞因子或因素。这些分子包括但不限于MIPl- β、ΙΡ-10和MIPl- a。
目前报导⑶4+Treg细胞表达TLR8，且这些细胞中的TLR8信号转导降低或逆转了它们的免疫刺激性功能。Peng G et al. (2005) Science309 1380-4。在患有多种类型癌症的患者中观察到增加的⑶4+Treg细胞种群，其中免疫抑制可有助于免疫“逃逸”和下调这些癌症的生长。因此，预计Treg-介导的抑制的反转在治疗癌症中是有利的。
PRN特别排除TLR7/8基序。已经发现TLR7/8基序可以产生显性结果，其屏蔽了本发明ORN的独特的免疫刺激特性。TLR7/8基序包括例如核糖核苷酸序列，如5 ‘ -C/U-U-G/ U-U-3 ‘、5 ‘ -R-U-R-G-Y-3 ‘、5 ‘ -G-U-U-G-B-3 ‘、5 ‘ -G-U-G-U-G/U-3 ‘或 5 ‘ -G/ C-U-A/C-G-G-C-A-C-3'。C/U是胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U)，G/U是鸟嘌呤(G)或U，R是嘌呤， Y是嘧啶，B是U、G或C，G/C是G或C，A/C是腺嘌呤(A)或C。5' -C/U-U-G/U-U-3‘可以是 CU⑶、CUUU、UU⑶或 UUUU。在多个实施方案中，5' -R-U-R-G-Y-3‘是 GUA⑶、GUAGC、⑶GGU、 GUGGC、AUA⑶、AUAGC、AUG⑶或AUGGC。在一个实施方案中，碱基序列是GUAGUGU。在多个实施方案中，5' -G-U-U-G-B-3‘是GUU⑶、GUUGG或⑶UGC。在多个实施方案中，5' -G-U-G-U-G/ U-3'是GUGUG或GUGUU。在一个实施方案中，碱基序列是GUGUUUAC。在多个实施方案中， 5 ‘ -G/C-U-A/C-G-G-C-A-C-3 ‘是 GUAGGCAC、GUCGGCAC、CUAGGCAC 或 CUCGGCAC。
一般而言，本发明涉及免疫刺激性寡核糖核苷酸，其包含一个或多个免疫刺激性 RNA基序、含有一个或多个本发明的免疫刺激性ORN的免疫刺激性组合物，和本发明的免疫刺激性ORN和免疫刺激性组合物的使用方法。
本文使用的术语“RNA”和等效的“天然RNA”旨在表示通过3' -5'磷酸二酯键共价连接在一起的两个或更多的核糖核苷酸(即每个分子包含与磷酸基和嘌呤或嘧啶核碱基(例如鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶或尿嘧啶)连接的一个核糖)。
免疫刺激性的RNA基序可以存在于免疫刺激性ORN的末端(当免疫刺激性ORN具有游离末端时)。例如，具有游离末端的免疫刺激性ORN和位于免疫刺激性ORN末端的免疫刺激性RNA基序可以作为XaM或作为M)(b存在，其中M表示免疫刺激性RNA基序，Xa和)(b 各自独立地表示免疫刺激性ORN除免疫刺激性RNA基序外的一个或多个相同或不同的核苷酸。
或者，免疫刺激性RNA基序可以在其两侧末端连接有免疫刺激性ORN的至少一个额外的核苷酸，无论该免疫刺激性ORN是否具有游离末端。例如，具有游离末端和免疫刺激性RNA基序侧翼的核苷酸的免疫刺激性ORN可以作为XaMXb存在，其中M表示免疫刺激性 RNA基序，Xa和)(b各自独立地表示免疫刺激性ORN除免疫刺激性RNA基序外的一个或多个相同或不同的核苷酸。
在不同的实施方案中，包含免疫刺激性RNA基序的免疫刺激性ORN可含有单个基序或多于一个的免疫刺激性RNA基序。单个免疫刺激性ORN中具有两个或更多免疫刺激性RNA基序被认为可能是有利的，例如如果基序被隔开使得免疫刺激性ORN能够结合两个或更多的TLR的时候。例如，免疫刺激性ORN可以结合两个或更多的TLR8受体，从而扩增或修饰得到的免疫刺激作用。当免疫刺激性ORN包含多于一个免疫刺激性RNA基序时，在一个实施方案中免疫刺激性ORN可作为M1XM2存在，其中M1和M2各自独立地表示免疫刺激性RNA基序，X表示免疫刺激性ORN除免疫刺激性RNA基序外的一个或多个相同或不同的核苷酸。在一个实施方案中，X包含本文所述的非核苷酸接头。在一个实施方案中，X包含本文所述的分支单元。当免疫刺激性ORN中存在多于一个免疫刺激性RNA基序时，该基序一般可以在沿着免疫刺激性ORN的任何位置发生。例如，当存在两个基序时，它们可各自存在于免疫刺激性ORN的末端。或者，一个基序可以存在于一个末端，一个基序可以通过免疫刺激性ORN的至少一个外的核苷酸包围在其两侧末端。还在另一实施方案中，各基序可以通过免疫刺激性ORN的至少一个额外的核苷酸包围在其两侧末端。免疫刺激性ORN包括但不限于以下，以从左到右读出5，到3，显示在一些实施方案中，ORN是下表1和表2显示的活性ORN之一，例如以下 U*U*A*G*G*C*A*C(SEQ ID NO :2)、A*U*A*G*G*C*A*C(SEQ ID NO :4)、G*C*C*A*C*C*G*A*G*C
氺OKG氺A氺A氺U氺A氺U氺A氺OKC (SEQ ID NO :11)、A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U氺A氺U (SE
Q ID NO :1 、U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U*A*U*U(SEQ ID NO 13), A*A*U*A*A*
U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A氺U氺A氺A(SEQ ID NO :16)、A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺U氺A (SEQ ID NO 17)、A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U氺A氺A氺A氺A氺U(SEQ ID NO 18)> C
ID NO 24),(SEQ ID NO:
30)、U*A*U*A*U*A*U(SEQ ID NO 33)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*U*A*C*C*C(SEQ ID NO 幼)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*U*U*G*A*A*C*C(SEQ ID NO :76)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*A*C*C *C*C(SEQ ID NO :4 、C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*A*U*C(SEQ ID NO :3 、C*C*G*A*G*C *C*G*A*U*A*U*U*A*C*C(SEQ ID NO :6 、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*C*C*C*C*C(SEQ ID NO: 44)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*U*A*C*C*C*C(SEQ ID NO :47)、C*C*G*A*G*C*C*A*U*A*U*A*U*C *C*C(SEQ ID NO 38)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*A*C*C*C(SEQ ID NO :37)、C*C*G*A*G*C *C*G*A*A*U*A*A*C*C*C(SEQ ID NO :40)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*U*A*U*C*C*C*C(SEQ ID NO: 5 、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*G*U*A*C*C(SEQ ID NO :8 、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*A*U*A *C*C(SEQ ID NO 85)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*U*G*U*A*C*C (SEQ ID NO 63)、C*C*G*A*G*C *C*G*OOU*A*A*OOC (SEQ ID NO :4 、OOG*A*G*OOG*OA*U*A*U*OOC (SEQ ID NO: 36)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*A*C*C(SEQ ID NO :87)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*C*C *C*C(SEQ ID NO 45)、C*C*G*A*G*C*C*G*C*A*U*A*A*C*C*C (SEQ ID NO :41)、C*C*G*A*G*C *C*G*A*A*G*G*U*G*C*C (SEQ ID NO :8 、OOG*A*G*OOG*OA*U*OOOOC (SEQ ID NO: 46)、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*G*C*C(SEQ ID NO :8 、C*C*G*A*G*C*C*G*C*C*G*C*C*C *C*C(SEQ ID NO :3 、C*C*G*A*G*C*C*G*A*A*G*C*U*C*C*C(SEQ ID NO :84)或 C*C*G*A*G* C*C*G*A*A*G*G*C*A*C*C(SEQ ID NO :56)。如上所述，RNA是通过3’ -5’磷酸二酯键连接的核糖核苷酸的多聚物。在某些实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN是RNA。然而，本发明的免疫刺激性ORN不限于RNA，如下文将描述的。
在一个实施方案中，本发明的免疫刺激性ORN可以包含两个或更多经修饰的核碱基，即A、C、G和U的衍生物。这些经修饰的核碱基的特定实施方案包括但不限于5-取代的胞嘧啶(例如5-甲基-胞嘧啶、5-氟-胞嘧啶、5-氯-胞嘧啶、5-溴-胞嘧啶、5-碘-胞嘧啶、5-羟基-胞嘧啶、5-羟甲基-胞嘧啶、5-二氟甲基-胞嘧啶，和未取代的或取代的 5-炔基-胞嘧啶)、6_取代的胞嘧啶，N4-取代的胞嘧啶(例如N4-乙基-胞嘧啶)、5_氮杂-胞嘧啶、2-巯基-胞嘧啶、异胞嘧啶、假异胞嘧啶、带有稠环系统的胞嘧啶类似物(例如N，N’ -丙烯胞嘧啶或吩噁嗪)，和尿嘧啶及其衍生物(例如5-氟-尿嘧啶、5-溴-尿嘧啶、5-溴乙烯基-尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羟基-尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶)，胸腺嘧啶衍生物(例如2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧啶、6-取代的胸腺嘧啶)，鸟苷衍生物 (7-脱氮鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤(例如7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤)、7_脱氮-8-取代的鸟嘌呤、次黄嘌呤、N2-取代的鸟嘌呤(例如N2-甲基-鸟嘌呤)、8_取代的鸟嘌呤(例如8-羟基鸟嘌呤和8-溴代鸟嘌呤)和6-硫代鸟嘌呤)或腺苷衍生物(5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑基[4，5-d]嘧啶-2，7- 二酮、2，6- 二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、 吲哚、腺嘌呤、取代的腺嘌呤(例如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧-腺嘌呤))。碱基也可以被通用碱基(例如4-甲基-吲哚、5-硝基-吲哚、3-硝基吡咯、P-碱基和K-碱基)、芳环(例如苯并咪唑或二氯-苯并咪唑、1-甲基-1H-[1，2，4]三唑-3-羧酸胺)、芳环系统(例如氟苯或二氟联二苯)或氢原子(dSpacer)取代。优选的碱基修饰是尿嘧啶和7_脱氮-鸟嘌呤。这些经修饰的U核碱基和它们对应的核糖核酸可从商业供应商得来。
经修饰的G核碱基的特定实施方案包括N2-二甲基鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮-7-取代的鸟嘌呤、7-脱氮-7-(C2-C6)炔基鸟嘌呤、7-脱氮-8-取代的鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤、6-硫代鸟嘌呤和8-氧代鸟嘌呤。在一个实施方案中，经修饰的G核碱基是8-羟基鸟嘌呤。这些经修饰的G核碱基和它们相应的核糖核苷可得自商业供应商。
在某些实施方案中，至少一个β-核糖单元可以被β-D-脱氧核糖或经修饰的糖单元置换，其中经修饰的糖单元例如选自β-D-核糖、α-D-核糖、β-L-核糖(如 iSpiegelmers'中)、α -L-核糖、2’ -氨基_2’ -脱氧核糖、2’ -氟_2’ -脱氧核糖、 2'-0-(Cl-C6)烷基核糖，优选2' -0-(Cl-C6)烷基核糖为2' -O-甲基核糖、2’-0-(C2-C6) 链烯基核糖、2’ -[O-(C1-C6)烷基-0-(Cl-C6)烷基]核糖、LNA 和 α-LNA(Nielsen P et al. (2002) Chemistry-Α European Journal8 :712-22)、β-D-木-呋喃糖、α -阿拉伯呋喃糖、2’ -氟代阿拉伯呋喃糖和碳环和/或开环糖类似物(描述于例如Vandendriessche et al. (1993)Tetrahedron49 :7223中)和/或双环糖类似物(描述于例如Tarkov M et al. (1993)Helv Chim Acta 76 :481 中)。
或者，本发明的免疫刺激性ORN的各核糖核苷酸和核糖核苷可以通过非核酸的接头连接，尤其是脱碱基接头(abasic linkers (dSpacers))、三乙二醇单元或六乙烯基乙二醇(hexaethylene glycol)单元。其它接头为烷氨基(alkylamino)接头，例如C3、C6和 C12氨基接头，以及烷基硫醇(alkylthiol)接头，例如C3或C6硫醇接头。或者，本发明的免疫刺激性ORN的个体核苷酸和核糖核苷可以通过芳香族残基连接，所述芳香族残基还可被烷基或取代的烷基取代。
RNA是通过3’ -5’磷酸二酯联接而连起来的核糖核苷酸的多聚物。本发明的免疫刺激性ORN的核苷酸也可以通过3’ -5’磷酸二酯联接连起来。然而，本发明也包括具有异常核苷酸间联接的0RN，特异地包含5' -5'、3' -3'、2' -2'、2' -3'和2' -5'核苷酸间键。在一个实施方案中，这类异常联接被排除在免疫刺激性RNA基序外，尽管一个或多个这种联接可存在于免疫刺激性ORN的别处。对于具有游离末端的免疫刺激性ORN而言， 包含一个3’ -3’核苷酸间联接可导致免疫刺激性ORN具有两个游离的5’端。相反，对于具有游离末端的免疫刺激性ORN而言，包含一个5’ -5’核苷酸间联接可导致免疫刺激性的 ORN具有两个游离的3’末端。本发明的免疫刺激性组合物可含有两个或更多的免疫刺激性RNA基序，其可以通过分支的单元连接。核苷酸间联接可以是3' -5'、5' -5'、3' -3'、2' -2'、2' -3' 或2' -5'联接。其中，名称2’-5’根据核糖的碳原子选择。异常核苷酸间联接可以是磷酸二酯联接，但是其也可以被修饰为硫代磷酸酯或本文所述的任何其它经修饰的联接。下式通过核苷酸分支单元显示本发明的分支的免疫刺激性ORN的一般结构。其中NUl、Nu2和恥3可以通过 3' -5'、5' -5'、3' -3'、2' -2'、2' -3'或 2' -5'-联接来连接。免疫刺激性ORN的分支也可以涉及非核苷酸接头和脱碱基间隔的使用。在一个实施方案中， Nu1^Nu2和Nu3表示相同或不同的免疫刺激性RNA基序。在另一实施方案中，Nu1、Nu2和Nu3 包含至少一个免疫刺激性RNA基序和至少一个免疫刺激性CpG DNA基序。
权利要求
1.SEQ ID NO 21的寡核苷酸。
2.SEQ ID N0:21的寡核苷酸在制造用于在受试者中调控免疫应答的药剂中的用途。
3.权利要求2所述的用途，其中所述寡核苷酸以能诱导细胞因子表达的有效量递送给受试者。
4.权利要求2所述的用途，其中所述细胞因子选自IL-6、IL-10、IL-12,TNF-α和 IFN- γ ο
5.组合物，其包含处于可药用的运载体中的SEQID Ν0:21的寡核苷酸。
6.权利要求5所述的组合物，其还包含下述抗原，其中所述抗原任选地与所述寡核苷酸缀合。
7.权利要求5或6所述的组合物，其中所述可药用的运载体被配制为用于注射。
8.权利要求5或6所述的组合物，其中所述可药用的运载体被配制为用于口服施用、鼻施用、舌下施用、粘膜施用、呼吸施用或经皮施用。
全文摘要
本发明涉及免疫刺激性寡核糖核苷酸。本发明提供了免疫刺激性组合物以及这些化合物在药物制备以及体外用途中的用途，所述药物用于治疗疾病。本发明的组合物尤其包括加入了序列依赖性免疫刺激性序列基序的免疫刺激性寡核糖核苷酸。本发明提供了涉及磷酸联接、核苷酸类似物、加合物及其组合的特定修饰。可以任选地含有抗原的本发明组合物能够单独使用，或与其它治疗一起用于刺激或增强免疫应答。本发明还提供了适用于治疗下述受试者的方法，所述受试者患有感染、癌症、变应性病症、哮喘、气道再造或免疫缺陷。本发明的免疫刺激性寡核糖核苷酸被认为能刺激Toll样受体8(TLR8)。
文档编号A61K31/7115GK102517292SQ20111043092
公开日2012年6月27日 申请日期2006年11月22日 优先权日2005年11月25日
发明者亚历山大·福斯巴赫, 格雷森·B·利浦福德, 约尔格·沃尔梅尔 申请人:科勒制药股份公司, 科勒制药集团公司