专利名称：用于改善纤维蛋白密封的方法
技术领域：
本发明涉及具有改善的密封特性的纤维蛋白基质及其制备和用途。
背景技术：
纤维蛋白密封剂通 是得自商业来源或某些地区输血中心的血液制品。常用于制备纤维蛋白密封剂的组分主要是补充有不同数量的因子VIII、因子XIII、纤连蛋白、玻连蛋白和血管性血友病因子(VWF)的纤维蛋白原。纤维蛋白原组分通常被凝血级联凝血酶的最后一个蛋白酶活化。纤维蛋白密封剂通过涉及尤其是纤维蛋白原、凝血酶和因子XIII的酶促反应形成。凝血酶通过酶促反应将纤维蛋白原转化为纤维蛋白，该反应的速率由凝血酶的浓度决定。因子XIII通常存在于密封剂的纤维蛋白原组分中，是交联并且稳定纤维蛋白凝块的凝血系统的酶。该过程绕过了正常凝血作用的大多数步骤，并且模拟其最终阶段。一些制造商将抗蛋白水解剂添加到纤维蛋白密封剂制剂(如WO 93/05822中所述)中或特异性去除血纤维蛋白溶酶原，以便使纤维蛋白溶解延迟或停止(如US 5，792，835和US 7，125，569中所述)。美国专利No. 4，427，650公开了能够以干燥粉末混合物的形式立即和直接施加到伤口或手术区域上的组织粘合剂。该粘合剂由具有生物活性的固体粉末组分组成，并且包含60重量％至96重量％的纤维蛋白原(主要从低温不溶性球蛋白释放)、0. 05重量％至5重量％的纤维蛋白溶解抑制剂和O. I重量％至15重量％的凝血酶和/或凝血酶原。美国专利No. 5，962，405公开了用于制备可用作组织粘合剂的纤维蛋白原溶液的冻干纤维蛋白原制品。纤维蛋白原制品包含溶解度改善的物质。人们很早就认识到纤维蛋白密封剂可施加到伤口例如人的裸露伤口，使伤口闭合，止血并且防止其他物质例如传染原进入伤口。纤维蛋白密封剂在密封持续移动的组织(例如胃肠组织和肺组织)缺陷中的作用已有所报道。然而，这些报道中存在差异。减少术后缺陷(例如胃肠切除后在缝钉或缝合(缝钉/缝合)线处的渗漏)的一种报道方法是使用缝钉/缝线补强。不同的缝钉/缝线补强产品是可商购获得的。例如，医生尝试了非吸收或半吸收缝钉线补强产品，例如Seamguard 、Peristrips Dry :和
Surgisis 。然而，在早期实验和临床研究中，可吸收缝钉线补强材料与非吸收或半吸收缝钉线补强材料相比，似乎具有相当大的优点(Yo et al. “Buttressing of the staple linein gastrointestinal anastomoses !overview of new technology designed to reduceperioperative complications，，· Dig Surg. 2006 ；23 :283-291 (Yo 等人，“胃肠吻合口 中缝钉线的加固设计用于减少围手术期并发症的新技术概述”，《消化外科》，2006年，第23卷，第283-291页))。最近使用纤维蛋白作为可吸收缝钉线补强以用于防止胃肠术后渗漏的 艮道(Fullum et al. “Decreasing anastomotic and staple line leaks afterlaparoscopic Roux-en-Y gastric bypass，，· Surg Endosc. 2009 ;23 :1403-1408 (Fullum等人，“减少腹腔镜式Roux-en-Y胃旁路术后的吻合和缝钉线渗漏”，《外科内窥镜》，2009年，第23 卷,第 1403-1408 页)；Efthimiou et al. “Fibrin sealant associated with increasedbody temperature and leukocytosis after laparoscopic gastric bypass，，· Surg ObesRelat Dis. 2009Mar 17 (Efthimiou等人，“腹腔镜式胃旁路术后体温升高和白细胞增多相关纤维蛋白密封剂”，《肥胖和相关疾病的手术治疗》，2009年3月17日))说明，目前的纤维蛋白密封剂制剂不适合用于缝钉/缝线加强。美国专利No. 5，690, 675公开了通过两步法进行的肺组织伤口闭合，该方法基本上包括将紧固件(如缝钉、夹片、销轴、吊钩)施加到邻近伤口的区域，其中紧固件可引起渗透。紧固件存在于胶原、纤维蛋白、纤维蛋白原、弹性蛋白、白蛋白或其组合的预制层中，并且将能量施加到该区域，以将材料融合到组织，并且密封组织中的穿孔。美国专利No. 5，883，078公开了包含纤维蛋白原和凝血酶原的活化剂或前活化剂 的稳定的组织粘合剂。粘合剂可以作为液体制剂或干燥制剂存在。在一个实施例中，固体双面粘附组织粘合剂通过以下方法制成将固体形式的干燥粘合剂施加到伤口表面，随后使第二伤口表面(第二组织部分)贴合并且立即按压在一起。制剂立即通过存在的血液和/或伤口分泌的方式溶解，随后随着凝血作用的开始而凝固，从而达到粘附和止血效果。固体双面粘附组织粘合剂尤其适用于软组织部分例如肝脏或脾脏的接合。Lillemoe 等人[(2004) J Gastrointest Surg. , Vol. 8, No. 7pp 766-774Ajournalarticle entitled “Does Fibrin Glue Sealant Decrease the Rate of PancreaticFistula After Pancreaticoduodenectomy Results of a Prospective RandomizedTrial ”(2004年，《胃肠外科杂志》，第8卷，第7期，第766-774页，名称为“胰十二指肠切除术后纤维蛋白胶密封剂会降低胰瘘率吗？前瞻性随机试验的结果”的杂志文章)]示出，纤维蛋白胶密封剂局部施加到胰吻合口的表面不会减少胰十二指肠切除术后患者胰瘘或总的并发症的发生率，推断在该场景中有关该物质的使用似乎无有益效果。另一项研究(“Thesealing effect of fibrin glue against alveolarair leakage evaluated up to 48h !comparison between different methods ofapplication” Kawamura et al. (2005) Eur J of Cardiothorac Surg. 28 (I) :39-42( “评估多达48h的纤维蛋白胶对肺泡气渗漏的密封效果；不同施加方法之间的比较”，Kawamura等人，2005年，《欧洲心胸外科杂志》，第28卷，第I期，第39-42页))公开了动物模型中纤维蛋白胶对肺泡气渗漏的密封效果，并且评估了不同的施加方法。所使用的溶液A由含纤维蛋白原的蛋白质浓缩物组成，并且溶液B包含凝血酶。在摩擦和喷雾法中，滴入溶液A并且轻轻擦到漏气区域上。然后同时喷雾两种溶液，形成混合气溶胶。在另一个方法中，通过将溶液A滴在漏气表面上，然后滴入溶液B，从而制成双层。在另一个方法中,将一侧被干燥纤维蛋白原和凝血酶包被的胶原纤维网(特可考(TachoComb))用于动物(狗)模型，并且在24小时后检验。据作者所述，纤维蛋白胶的密封效果在施加后最多12小时内是相对不稳定的。另外，作者得出如下结论与其他两种方法相比，摩擦和喷雾法可帮助纤维蛋白密封剂更迅速地达到其全部强度。Yo等人(2006年)的另一项研究(Dig Surg 23 :283-291 (《消化外科》，第23卷，第283-291页))公开了在进行胃肠切除时减少吻合并发症，如在缝钉线处的出血或渗漏所作出的努力。Yo指出，在大鼠结肠吻合动物模型中，施加纤维蛋白胶以密封并且防止渗漏的技术似乎是不可行的。据公开，在胃切除术中，施加纤维蛋白胶以支持和密封缝钉线似乎更成功。美国专利No. 7，196, 054公开了用于处理患者受伤组织的方法，该方法包括以含纤维蛋白原的干燥粉末的形式将组合物施加到受伤组织，所施加的量可在存在凝血酶、因子XIII、Ca2+和水溶液的情况下形成纤维蛋白基质；向组合物提供凝血酶、因子XIII、Ca2+和水溶液，所提供的量可在存在纤维蛋白原的情况下形成纤维蛋白基质。Fullum等人(2009年)公开了在肥胖患者中腹腔镜式Roux-en-Y胃旁路术(LRYGB)后发生的吻合和缝钉线渗漏(ASL)。纤维蛋白密封剂沿着胃缝钉线放置。作者得出如下结论操作技术(包括适当的缝钉大小、缝钉线补强、手工缝制切开闭合、留置缝线、术中渗漏测试和纤维蛋白密封剂)对于减少LRYGB后ASL的发生率是有作用的。作者不能确定是否有一种组分在预防ASL中是最重要的。相比之下，Efthimiou等人(2009年)公开了 LRYGB中纤维蛋白密封剂的使用对吻合或缝钉线渗漏率没有效果。 对于用于密封持续移动的组织(如胃肠组织和肺组织)缺陷的优异纤维蛋白密封剂制剂，还存在尚未满足的需求。
发明内容
纤维蛋白密封剂的当前主要用途是用于止血；该作用可通过存在于覆盖受伤区域的血液中的自体凝血因子(如纤维蛋白原)来增强。纤维蛋白密封剂的另一种用途是密封组织渗漏，例如气体和/或液体如尿液、肠液、血清肿的渗漏。通常，在这些组织渗漏中，不存在自体凝血因子。大多数密封剂(包括合成密封剂)不能有效密封组织渗漏。不希望受机理的约束，气体/液体可充当密封剂和组织之间的屏障，从而防止密封剂和组织之间的紧密接触。一般来讲，外科医生通常在施加密封剂之前尽可能干燥受伤的渗漏组织。通常，干燥使用海绵/纱布和气体喷雾器人工进行(Hidas et al. ^Sutureless nephron-sparingsurgery use of albumin glutaraldehyde tissue adhesive (BioGlue)，，·Urology,2006 ;67 :697-700 (Hidas等人，“无缝合保留肾单位手术白蛋白戊二醛组织粘合剂(BioGlue)的使用”，《泌尿学》，2006年，第67卷，第697-700页))。这些干燥工序增加了产生组织粘连的风险(Kamel RM. “Prevention of postoperative peritoneal adhesions，，· Eur J ObstetGynecol Reprod Biol. 2010 ; 150 ⑵:111-118 (Kamel RM，“术后腹膜粘连的预防”，《欧洲妇产科和生殖生物学杂志》，2010年，第150卷，第2期，第111-118页))。此外，在外科医生如进行腹腔镜操作时不能达到的区域处，这些干燥工序也是有问题的。本发明提供有效密封组织渗漏的纤维蛋白基质。在一个方面，本发明提供将纤维蛋白基质施加到湿润组织上的方法，该方法包括将有效量的固体纤维蛋白密封剂共混物施加到湿润组织上；并且在所施加的固体纤维蛋白密封剂共混物的至少一部分上施加有效量的液体纤维蛋白密封剂制剂，其中固体纤维蛋白密封剂共混物和液体纤维蛋白密封剂制剂的有效量足以在湿润组织上产生纤维蛋白基质，其相对于施加有效量的液体纤维蛋白密封剂制剂或固体纤维蛋白密封剂共混物中的任一者而言具有改善的密封强度。在本发明的一个实施例中，密封强度相对于施加液体纤维蛋白密封剂制剂具有至少I. 2倍的改善。在本发明的另一个实施例中，密封强度相对于施加液体纤维蛋白密封剂制剂具有约I. 7倍的改善。在本发明的另一个实施例中，在不富含、具有少量、没有或缺乏血管的组织上和/或渗血或未出血的组织上进行施加。在本发明的一个实施例中，固体纤维蛋白密封剂共混物包含含有纤维蛋白原的固体组分和含有蛋白水解酶组分(当与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白)的固体组分。在本发明的另一个实施例中，固体纤维蛋白密封剂共混物的含纤维蛋白原组分通 过干燥含纤维蛋白原溶液(纤维蛋白原的浓度为小于25mg/ml)的步骤制备。在本发明的一个实施例中，纤维蛋白原的浓度为约20mg/ml。而在本发明的另一个实施例中，蛋白水解酶是凝血酶。 而在本发明的另一个实施例中，在组织缺陷上进行施加。在本发明的另一个实施例中，在组织中存在的缝钉或缝线的至少一部分上进行施加。本发明的另一方面涉及用于在潮湿表面上制备纤维蛋白基质的方法，该方法包括以下步骤提供含纤维蛋白原的固体组分；提供含蛋白水解酶的固体组分，该蛋白水解酶与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白；提供液体纤维蛋白密封剂制剂；将有效量的固体组分施加到潮湿表面的至少一部分上；以及在所施加的固体组分的至少一部分上施加有效量的液体纤维蛋白密封剂制剂。在本发明的一个实施例中，潮湿表面不含纤维蛋白原。在本发明的另一个实施例中，液体纤维蛋白密封剂制剂以固体形式提供，并且在其施加前复原。在本发明的另一个实施例中，液体纤维蛋白密封剂制剂以冷冻形式提供，并且在其施加前融化。在本发明的另一个实施例中，固体组分以液体形式提供，并且在其施加前干燥。而在本发明的另一个实施例中，固体组分以冷冻形式提供，并且在其施加前干燥。而在本发明的另一个实施例中，固体组分同时或相继施加。在本发明的另一个实施例中，液体组分同时或相继施加。在本发明的另一个实施例中，固体组分以共混物提供。在本发明的一个实施例中，表面是组织。在本发明的一个实施例中，组织不富含、具有少量、没有或缺乏血管和/或为渗血或未出血的。在另一方面，本发明涉及可根据本发明获得的纤维蛋白基质。而在另一方面，本发明提供用于处理或防止有需要的受试者的湿润组织中的缺陷的方法，该方法包括以下步骤a)提供含固体纤维蛋白原的组分，提供含固体蛋白水解酶的组分，该蛋白水解酶在与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白；以及提供液体纤维蛋白密封剂制剂；
b)将有效量的a)的固体组分施加到湿润组织的至少一部分上；以及c)在所施加的固体组分的至少一部分上施加有效量的a)的液体纤维蛋白密封剂制剂。在本发明的一个实施例中，湿润组织不富含、具有少量、没有或缺乏血管和/或为渗血或未出血的。在本发明的另一个实施例中，缺陷是组织中的渗漏。在本发明的另一个实施例中，渗漏物质不富含、具有少量、没有或缺乏血浆或血液组分。
在本发明的一个实施例中，液体纤维蛋白密封剂制剂以固体形式提供，并且在其施加前复原。在本发明的另一个实施例中，液体纤维蛋白密封剂制剂以冷冻形式提供，并且在其施加前融化。在本发明的一个实施例中，固体组分以液体形式提供，并且在其施加前干燥。而在本发明的另一个实施例中，固体组分以冷冻形式提供，并且在其施加前干燥。而在本发明的另一个实施例中，固体组分同时或相继施加。在本发明的一个实施例中，液体组分同时或相继施加。在本发明的另一个实施例中，a)的固体组分以共混物提供。在本发明的另一个实施例中，缺陷是缝钉或缝线。在一个方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包括(i)包含固体组分的容器，该固体组分包含(a)_纤维蛋白原组分和(b)_蛋白水解酶组分，该蛋白水解酶组分与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白，其中(a)和(b)组分装于单独的容器中或作为共混物装于相同的容器中；以及(ii)至少两个单独的容器，至少第一个单独的容器包含液体、冷冻或固体纤维蛋白原组分，并且至少第二个单独的容器包含液体、冷冻或固体蛋白水解酶组分，该蛋白水解酶组分与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白，其中当(ii)的至少两个单独的容器包含固体组分时，(a)和(b)组分作为共混物装于相同的容器中。 在本发明的一个实施例中，蛋白水解酶是凝血酶。在本发明的另一个实施例中，该试剂盒用于施加到潮湿表面上。在本发明的另一个实施例中，该试剂盒用于密封组织中的渗漏，该组织不富含、具有少量、没有或缺乏血管和/或该组织为渗血或未出血的。根据本发明的纤维蛋白基质或试剂盒可用于处理或防止湿润组织中的缺陷。
图I示出了将两层回肠组织分开所需的力(剥离力)，该组织使用两种不同的纤维蛋白密封剂制剂粘合在一起冻干纤维蛋白原和凝血酶的混合物与双组分液体纤维蛋白密封剂制剂的比较。图2示出了下列物质的密封强度(通过破裂测试测量)冻干纤维蛋白原和凝血酶的混合物、双组分液体纤维蛋白密封剂制剂以及按顺序施加冻干纤维蛋白原和凝血酶及双组分液体纤维蛋白密封剂形成的纤维蛋白基质。图3示出了下列物质的密封强度(通过破裂测试测量)通过施加冻干凝血酶，然后喷涂液体纤维蛋白密封剂形成的纤维蛋白；通过施加冻干纤维蛋白原，然后喷涂液体纤维蛋白密封剂形成的纤维蛋白；通过施加冻干纤维蛋白原和凝血酶的混合物，然后喷涂液体纤维蛋白密封剂形成的纤维蛋白；以及通过施加白蛋白粉末，然后喷涂液体纤维蛋白密封剂形成的纤维蛋白制剂。本发明实施例的
具体实施例方式本发明涉及将纤维蛋白基质施加到粘膜或其他湿润组织上的方法，该方法包括按顺序将固体纤维蛋白密封剂共混物施加到组织的表面上，然后在表面的至少一部分上施加液体纤维蛋白密封剂制剂。本发明还涉及在粘膜或其他湿润组织中按顺序施加第一固体纤维蛋白密封剂共混物，然后是液体纤维蛋白密封剂制剂而有效地密封缺陷。本发明基于以下调查结果
不同的测试纤维蛋白制剂的粘合力(或剥离力)通过剥离测试测量。该测试测量猪小肠粘膜下层的层之间的纤维蛋白胶的粘合强度。在一个实施例中，将测试的粘合剂制剂施加到猪回肠的浆膜侧上。在测试的纤维蛋白密封剂制剂施加后，将回肠组织沿自身折叠(浆膜对浆膜)，并且使纤维蛋白密封剂制剂聚合。使用万能拉伸试验机-劳埃德仪器(Lloyd Instruments) LFPLUS测量将两个粘附的回肠组织层彼此分开所需的力(剥离力)。通常，测得的剥离力越大，测试制剂的粘合力越大。根据本发明已发现，与使用液体纤维蛋白密封剂制剂相比，使用冻干纤维蛋白密封剂制剂时粘合力显著改善。已发现，冻干纤维蛋白密封剂制剂的粘合力与液体纤维蛋白密封剂制剂的粘合力相比为约2. 7倍高。通过破裂测试测量不同纤维蛋白制剂的密封特性。破裂测试可确定和评估密封剂防止渗漏的能力。简而言之，将连接至水源并且包含孔的铝管引入猪回肠的管状段中，将管状段密封并固定在铝管的两端。在允许水流入铝管中时，水通过孔进入回肠和铝管之间的空隙中，进入的方式为防止水回流进入铝管中。在允许水流动之前，形成垂直于肠长度的IOmm切口，并且首先在中线缝合切口，然后将测试的纤维蛋白密封剂制剂通过放置于切口区域附近的6cm2石蜡膜模板框架施加到切口区域上。测试的制剂施加后，使纤维蛋白固化(或聚合)10分钟，并且用水灌肠以测试其抗压能力。一旦水流入回肠和管之间的空隙中，水压就持续升高直到切口的密封打开，并观察到压力急剧下降。使用连接至液流管的压力计(D-Iogmate 590 MRC Israel)监测压力水平。记录下降前观察到的压力，并且视为爆裂压力。通常，观察到越高的爆裂压力表明测试制剂的密封特性越强。根据本发明还发现，显示出比液体纤维蛋白密封剂具有更强粘合力的冻干纤维蛋白密封剂不能有效密封。相比之下，液体纤维蛋白密封剂制剂比冻干纤维蛋白密封剂具有更好的密封效果。还意外地发现按顺序施加冻干纤维蛋白密封剂和液体纤维蛋白密封剂制剂显示出密封特性协同增强。与液体纤维蛋白密封剂制剂的密封强度相比，观察到密封强度增加约I. 7倍。然而，按顺序施加冻干纤维蛋白原或冻干凝血酶，然后施加液体纤维蛋白密封剂制剂未观察到密封特性的协同增强。另外，据发现，在施加液体纤维蛋白密封剂制剂前干燥粘膜(如通过将蛋白质粉末例如白蛋白粉末施加到粘膜层上)不会增强液体纤维蛋白密封剂制剂的密封性能。这些调查结果促使了在粘膜或其他湿润组织上产生具有更高密封强度的纤维蛋白基质的改进方法的开发。根据本发明产生的纤维蛋白基质可用于密封粘膜或其他湿润组织如持续移动的组织(如胃肠组织和肺组织)的缺陷。术语“组织”是指细胞和/或细胞组分联合执行特定功能的结合体。组织中的细胞可以全部是一种类型或不止一种类型。组织可以是内有细胞生长的人工组织，其中细胞发挥作用的方式类似于活体生物中的组织。组织可以是人体组织或动物组织。术语“纤维蛋白基质”是指按顺序施加固体纤维蛋白密封剂共混物和液体纤维蛋白密封剂制剂得到的纤维蛋白。术语“有效量的固体纤维蛋白密封剂共混物”是指包含纤维蛋白原的固体组分的量和包含蛋白水解酶的固体组分的量，该蛋白水解酶与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白，纤维蛋白原在湿润组织上发生水合作用后形成纤维蛋白凝块。术语“有效量的液体纤维蛋白密封剂制剂”是 指包含纤维蛋白原的液体组分的量和包含蛋白水解酶(与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白)的液体组分的量，纤维蛋白原在液体组分混合后允许形成纤维蛋白凝块。不希望受机理的约束，似乎一旦固体密封剂共混物施加到湿润组织上，就发生水合作用。通过固化湿润组织中存在的液体，并且在接近组织处形成纤维蛋白层，从而将水合固体密封剂共混物涂在组织上。然后将液体纤维蛋白密封剂制剂施加到该涂覆的组织上，从而得到改善的密封强度和耐用性。有利的是，在无需海绵或纱布的情况下使表面上的湿润物固化，可降低术后粘连形成的风险。术语“粘连”是指组织和/或器官之间的异常附着。通常，粘连发生在外科手术后，例如对组织用力操作后；组织表面干燥后；和/或由于手术区域中存在反应性异物(如缝线材料、滑石粉或棉绒残留物)。术语“粘膜”或“粘膜组织”是指覆盖一些器官和体腔的湿润组织。通常，粘膜组织分泌粘液物质。粘膜组织的实例包括(但不限于)口腔粘膜如口腔和舌下粘膜；鼻腔粘膜；眼睛粘膜；生殖器粘膜；直肠粘膜；耳粘膜；肺粘膜；支气管粘膜；胃粘膜；肠粘膜；嗅粘膜；子宫粘膜；和食道粘膜。术语“粘液”是指潮湿/湿润和粘性的物质，例如富含粘蛋白、糖蛋白的白蛋白和/或起到粘性作用的任何其他组分的物质。术语“其他湿润组织”是指潮湿组织。该组织可因体液而湿润，例如血清、血清渗透物、血液和炎症液和/或其他流体/液体例如磷酸盐缓冲液(PBS)。在本发明的一个实施例中，流体不包含凝血因子(如不包含纤维蛋白原)。如本文所用，术语“缺陷”是指如组织中的裂口、孔隙、钻孔、裂缝、刺孔、空穴、断裂、开口、切口、间隙、穿孔、断口、刺孔或破裂、渗漏。如缺陷可在吻合手术后形成。缺陷可以是先天的，如疝；身体相关病变如血清肿、疝、感染、炎症引发的症状；手术、缝合和/或钉合后形成的症状；或非身体因素如意外、外伤引发的症状。术语“渗漏”是指物质(如流体、粘性物质和/或气体)如通过组织中的裂口、孔隙、钻孔、裂缝、刺孔、空穴、断裂、开口、切口、间隙、穿孔、断口、刺孔或破裂逸出或通过。术语“吻合”通常是指用于重新连接器官或组织的两个或更多个部分的外科手术。该手术可在泌尿道(尿道)、咽喉(食道)切开后使用，或肠道手术中使用。该手术也可在疾病组织(例如发炎组织、癌组织或其他病理组织如溃疡性疾病)切除后使用。
本发明还涉及一种试剂盒，该试剂盒包括(i)包含固体组分的容器，该固体组分包含(a)_纤维蛋白原组分和(b)_蛋白水解酶组分，该蛋白水解酶组分与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白；以及(ii)至少两个单独的容器，至少第一个单独的容器包含液体、冷冻或固体纤维蛋白原组分，并且至少第二个单独的容器包含液体、冷冻或固体蛋白水解酶组分，该蛋白水解酶组分与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白。元件(i)的(a)和(b)组分可装于单独的容器中或作为共混物装于相同的容器中。在一个实施例中，当(ii)的至少两个单独容器包含固体组分时，(a)和(b)组分作为共混物装于相同的容器中。在另一个实施例中，当(ii)的至少两个单独容器包含固体组分时，还包括至少一个包含用于实现水合作用的水溶液的容器。与商业化纤维蛋白试剂盒(特别用于止血)相比，本发明的试剂盒也适用于密封不富含、具有少量、没有或缺乏血管的组织中的渗漏。
不富含、具有少量、没有或缺乏血管的组织的非限制性实例为硬脑膜、膀胱、眼睛、肺和胆囊。在本发明的一个实施例中，该试剂盒用于密封不富含、具有少量、没有或缺乏血管的组织中的渗漏。术语“止血”是指试剂阻止受伤血管出血和/或促使血液保持在血管内的能力。另外，与商业化纤维蛋白试剂盒(特别用于阻止受伤血管出血和/或将血液保持在血管内)相比，本发明的试剂盒也适用于密封非血液或血浆物质，如脑脊液(CSF)、气体、肠内容物、胆汁、淋巴液和玻璃体液的渗漏。在一个实施例中，本发明的纤维蛋白基质或试剂盒适用于密封渗血或未出血的组织中的渗漏。术语“渗血”是指例如轻微出血。术语“渗血”包括以相对低的速率失去相对小量的血液的出血情况。该试剂盒也可包含使用说明。该试剂盒还可包括用于切割和/或钉合或缝合组织或器官的装置，例如机械或人工切割和钉合装置。容器可以是瓶、预填充注射器、小瓶、管或任何其他装有固体或液体组分的合适容器。该容器可以具有不同的大小，并且装有不同体积/重量的组合物，例如每一个液体组分具有的体积可以为等于或小于约10ml，每一个固体组分具有的粉末重量可以为等于或小于约3g。任选地，施加固体和液体组分的施用装置也可以包括于试剂盒中。根据本发明的纤维蛋白基质或试剂盒可用于任何治疗目的。术语“任何治疗目的”是指在受试者中进行的任何治疗或预防性处理。示例性的治疗目的包括(但不限于)密封组织或器官如骨骼中形成的钻孔；在血管处吻合；接合组织部分如软组织部分；治疗或预防硬脑膜缺陷如硬脑膜注射后出现的裂口和渗漏、裂缝或断裂；治疗或预防出血；治疗或预防例如肺部切除后的漏气；治疗或预防肠穿孔后的缺陷；治疗或预防任何组织如子宫、食道、胃、胰腺、胰管、胆囊、胆管、肠(包括小肠和大肠)和直肠进行吻合手术后的缺陷；治疗或预防任何组织如子宫、食道、胃、胰腺、胰管、胆囊、胆管、肠(包括小肠和大肠)和直肠的术后渗漏；预防或减少缝钉或缝线处术后渗漏的发生率，如将根据本发明的纤维蛋白基质施加到至少一部分缺陷例如缝钉/缝线；以便如在疝手术期间有力固定假体；以便使缝钉/缝线加强；以便预防或减少气泡渗漏；从而治疗或预防肾缺陷；治疗或预防瘘管；治疗或预防心脏缺陷如穿刺性心脏损伤；增强血管移植假体；以及治疗或预防脑脊液渗漏。
在本发明的一个实施例中，治疗用途为用于密封不富含血管或缺乏血管的组织中的渗漏。在本发明的另一个实施例中，治疗用途为用于缝钉/缝线加强。本发明的纤维蛋白基质可用于密封缺陷而无需缝钉或缝线。术语“缝钉或缝线”包括用于闭合伤口的任何紧固件，例如(但不限于)缝钉、夹片、销轴、吊钩、缝线等。 如本文所用，术语“缺陷的至少一部分”是指小于、等于或大于缺陷的区域。例如，该区域可为缺陷的 I20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%^； 100%，包括所公开的百分比之间的任何范围，或者更大。在本发明的一个实施例中，将根据本发明的纤维蛋白基质或试剂盒用于缝钉/缝线加强。例如，首先将外科手术中在受试者中形成的IOmm切口缝合或钉合。对于补强,将IOOmg固体纤维蛋白密封剂共混物(每70mg纤维蛋白原1000IU凝血酶)施加到缝钉/缝线上，然后喷涂液体纤维蛋白密封剂制剂。通过喷涂总体积为2ml的1000IU/ml的凝血酶和70mg/ml的纤维蛋白原(两种组分之间的比率为
I D而施加液体纤维蛋白。如本文所用，术语“受试者”包括哺乳类动物，包括人。在一个实施例中，受试者为患者。在一个方面，本发明提供将纤维蛋白基质施加到湿润组织上的方法。该方法包括以下步骤将有效量的固体纤维蛋白密封剂共混物施加到湿润组织上；以及在该固体纤维蛋白密封剂共混物的至少一部分上施加有效量的液体纤维蛋白密封剂制剂，其中该有效量的固体纤维蛋白密封剂共混物和液体纤维蛋白密封剂制剂足以在湿润组织上形成纤维蛋白基质，其相对于施加有效量的液体纤维蛋白密封剂制剂或固体纤维蛋白密封剂共混物中的任一者而言具有改善的密封强度。有利的是，在液体纤维蛋白密封剂之前施加固体纤维蛋白密封剂改善液体纤维蛋白密封剂的密封强度。术语“湿润组织”是指潮湿组织并包括如粘膜、粘膜组织和其他湿润组织。在本发明的另一个实施例中，组织因无纤维蛋白原的液体而湿润。术语“无纤维蛋白原”是指例如浓度为低于I. 5g/L的纤维蛋白原。如本文所用，术语“在固体纤维蛋白密封剂共混物的至少一部分上”是指与施加固体纤维蛋白密封剂组分的区域相比从较小表面积至较大表面积变化的区域。例如，可将液体纤维蛋白密封剂制剂施加到施加固体组分的表面积的I %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60^^70^^80^^90%或100%上，包括所公开的百分比之间的任何范围。作为另外一种选择，可将液体纤维蛋白密封剂制剂施加到大于施加固体组分的区域的表面积上，如整个湿润组织或器官上。术语“液体纤维蛋白密封剂制剂”出于本专利申请的目的是指形成纤维蛋白密封剂所需的至少两种分离的液体组分。至少第一种分离的组分包含纤维蛋白原，至少第二种分离的组分包含蛋白水解酶，其能够在与纤维蛋白原(或含纤维蛋白原的制剂)反应时形成纤维蛋白。当将所述至少两种分离的组分施用(如注射)到目标部位中时，液体组分发生接触，从而模拟凝血级联过程的最后阶段，以便形成熟知的凝块，即纤维蛋白。术语“软组织”通常是指连接、支持、包封和/或围绕其他结构和器官的身体结构。软组织可为结缔组织或非结缔组织。软组织的实例包括(但不限于)肌腱、韧带、纤维组织、滑膜、筋膜、肌肉、肌肉壁、神经、肠、脂肪组织、肝、皮肤、脾和血管。术语“固体纤维蛋白密封剂共混物”出于本专利申请的目的是指包含用于形成纤维蛋白密封剂的前体的固体组合物。该组合物包含能够在与纤维蛋白原(或含纤维蛋白原的制剂)反应时形成纤维蛋白的固体蛋白水解酶以及固体纤维蛋白原。该固体共混物还可包含其他组分，诸如白蛋白。蛋白水解酶可为凝血酶和/或可得自蛇毒的物质。在本发明的一个实施例中，该固体组合物包含冻干形式的纤维蛋白原和凝血酶组分。在另一个实施例中，将含凝血酶和纤维蛋白原的溶液单独干燥，如通过冻干，以制备其在总固体纤维蛋白密封剂共混物中的相应固体组分。在本发明的另一个实施例中，将所得的固体材料用超细研磨机或冷却的刀片粉碎机磨成 粉末，或让固体材料过筛(如通过使用刮刀)而手动进行。在本发明的一个实施例中，用刮刀研磨材料，使材料通过200 μ m的筛。在本发明的另一个实施例中，使用如WO 2008/053475中所述的方法将固体材料磨成粉末，该专利以引用方式并入本文中。研磨后固体材料的粒度可为小于1000 μ m。在本发明的一个实施例中，研磨后固体材料的粒度为等于或小于200 μ m。粒度分布可为在10至100 μ m的范围内或10至60 μ m的范围内。固体蛋白水解酶和固体纤维蛋白原可一起提供。也可能的是，单独地提供固体前体，并同时地或相继地施加到所需表面上。在本发明的一个实施例中，将固体蛋白水解酶和固体纤维蛋白原作为共混物提供。本发明还提供用于在潮湿表面上制备纤维蛋白基质的方法。该方法包括以下步骤提供包含纤维蛋白原的固体组分；提供包含在与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的蛋白水解酶的固体组分；提供液体纤维蛋白密封剂制剂；将有效量的固体组分施加到潮湿表面的至少一部分上；在固体组分的至少一部分上施加有效量的液体纤维蛋白密封剂制剂。术语“潮湿表面”是指湿润表面。该表面可以为粘膜、粘膜组织和/或其他湿润组织。该表面可因诸如血清渗透物、血液和炎症液体的体液而润湿和/或因诸如PBS的非体液而润湿。潮湿表面可以为患者身体部分的表面，如含液体或空气的任何组织。术语“表面”包括(但不限于)性区，包括子宫、阴道和卵巢；肺；肛门；脾；肝；硬脑膜 ’肾;食道；胃；胰腺；胰管；胆囊；胆管；肠(包括小肠和大肠)以及心肌。表面可为出血或未出血的部位。在本发明的一个实施例中，表面为未出血的部位。在本发明的另一个实施例中，表面因无凝血因子(如，无纤维蛋白原)的液体而润湿。表面还可为如工作表面、假体装置表面的任何表面。如本文所用，术语“潮湿表面的至少一部分”是指小于、等于或大于潮湿表面的区域。例如，该区域可以为表面的 1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100 %，包括所公开的百分比之间的任何范围，或者更大。术语“在固体组分的至少一部分上”是指与施加固体纤维蛋白密封剂组分的区域相比从较小表面积至较大表面积变化的区域。例如，可将液体纤维蛋白密封剂制剂施加到施加固体组分的表面积的1%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%上，包括所公开的百分比之间的任何范围。作为另外一种选择，可将液体纤维蛋白密封剂制剂施加到施加固体组分的更大表面积上，如整个表面上。
固体纤维蛋白共混物中的固体组分一旦水合(如与湿润组织接触时)就反应以形成纤维蛋白密封剂。通常，纤维蛋白原制剂具有相对低的溶解度，而粘液组织显示具有相对低的液体含量。有利的是，所用的固体纤维蛋白密封剂共混物的纤维蛋白原组分可在施加到组织上时快速溶解和/或水合。根据本发明发现，通过冻干纤维蛋白原浓度为20mg/ml的含纤维蛋白原的溶液的步骤制得的固体纤维蛋白原在室温下在短于10分钟的时间内复原到水溶液中。在本发明的一个实施例中，固体纤维蛋白密封剂共混物的纤维蛋白原组分通过纤维蛋白原浓度为等于或低于150 (诸如等于或低于85mg/ml、25mg/ml或低于20mg/ml)的含纤维蛋白原溶液而制备。固体纤维蛋白密封剂共混物可通过干燥液体纤维蛋白密封剂制剂而制备。可使用本领域已知的任何干燥工序，包括(但不限于)冻干(冷冻干燥)或喷雾干燥工序。干燥可使用各种干燥设备(诸如控湿箱、干燥箱、干燥隧道、真空干燥机)或不影响凝块形成的任何其他合适方法在不同的温度下进行。 如本说明书通篇所用，术语“固体”是指按干燥组合物的总重量计液体含量为低于5重量％ (诸如4重量％、3重量％、2重量％、1重量％或更低)的组合物。术语“固体”可与术语“干燥”或“粉末”互换。固体纤维蛋白密封剂可通过分配器施加到组织上。分配器的实例在美国专利No. I, 776，489和美国专利No. 7，455，248中示出，它们以引用方式并入本文中。术语“改善的密封强度”是指例如与仅通过液体密封剂获得的密封强度相比为至少约I. 2倍高的密封强度。在本发明的一个实施例中，密封强度相对于施加液体纤维蛋白密封剂制剂为约I. 7倍高。密封强度可如通过上述破裂测试而测量。“I. 2倍高的改善的密封强度”是指比施加液体纤维蛋白密封剂制剂所实现的密封强度高20%的密封强度。“I. 7倍高的改善的密封强度”是指比施加液体纤维蛋白密封剂制剂所实现的密封强度高70%的密封强度。蛋白水解酶可为凝血酶和/或可得自蛇毒的物质。可将液体组分冷冻直至使用(如在-18°C或更低的温度下)或干燥(如通过冻干)以便长期储存。干燥的组分可通过在使用前添加各种体积的可药用载体而复原。术语“可药用载体”是指适于人类或其他动物使用的任何稀释剂或媒介物。载体可选自本领域已知的任何载体，诸如(但不限于)磷酸盐缓冲溶液(PBS)、盐水、氯化钠溶液、氯化钙溶液、乳酸林格氏溶液(LR)、5%右旋糖的生理盐水溶液以及注射用水。冻干的纤维蛋白原可在使用前用无菌水复原。冻干的凝血酶可在使用前用无菌氯化钙溶液或水(诸如蒸馏水)复原。复原的冻干纤维蛋白原和凝血酶可用于液体纤维蛋白密封剂制剂，然后可加以组合以形成纤维蛋白。两种组分可同时地或相继地施加到所需部位上。在本发明的一个实施例中，含纤维蛋白原的组分由生物活性组分(BAC)构成，该生物活性组分为衍生自血浆的蛋白的溶液。该组分还可包含氨甲环酸和精氨酸或赖氨酸或者精氨酸和赖氨酸的混合物或它们的可药用盐。BAC可衍生自冷沉淀物，诸如浓缩的冷沉淀物。术语“冷沉淀物”是指得自由全血制备的冷冻血浆的血液组分。当将冷冻血浆在寒冷条件下(通常在0-4°C的温度下)解冻，导致形成含有纤维蛋白原和因子XIII的沉淀的上清液时，可获得冷沉淀物。可例如通过离心收集沉淀物。通常，BAC包含因子VIII、纤连蛋白、血管性血友病因子(vWF)、玻连蛋白等，例如，如美国专利No. 6，121，232和相应的已公布的PCT申请WO 98/33533中所述，它们均以引用方式并入本文中。BAC可包含稳定剂，诸如盐酸精氨酸。通常，BAC中纤维蛋白原的量在约40mg/ml至约60mg/ml的范围内。BAC溶液中氨甲环酸的量可为约80mg/ml至约110mg/ml。盐酸精氨酸的量可为约15mg/ml至约25mg/ml。任选地，将溶液缓冲到生理相容的pH值。缓冲液可由甘氨酸、柠檬酸钠、氯化钠、氯化钙和作为载体的注射用水组成。甘氨酸可按约6mg/ml至约10mg/ml的量存在于组合物中，朽1檬酸钠可在约lmg/ml至约5mg/ml的范围内，氯化钠可在约5mg/ml至约9mg/ml的范围内，以及氯化钙可在约O. 1-0. 2mg/ml的浓度范围内。在另一个实施例中，将BAC组合物中纤溶酶原和纤溶酶的浓度降低至等于或低于15μ g/ml，例如5μ g/ml或更低的纤溶酶原，如使用如美国专利No. 7，125，569以及相应的已公布的PCT申请WO 02/095019中所述的方法，它们均以引用方式并入本文中。 还可能的是，纤维蛋白密封剂制剂包含促进凝块形成的组分，诸如Ca2+、因子VIII、纤连蛋白、玻连蛋白、血管性血友病因子(VWF)，它们可作为单独的组分提供或与液体组分配制。可使用分配器将液体纤维蛋白密封剂制剂施加到组织上，该分配器在使用或不使用空气喷雾的情况下将密封剂直接喷到组织或其他基底或工作表面上，如通过滴下。在本发明的一个实施例中，将密封剂在15磅/平方英寸的气压下喷涂。组织密封剂分配器的实例在美国专利 No. 4，631，055,No. 4，846，405,No. 5，116，315,No. 5，582，596,No. 5，665，067、No. 5，989，215、No. 6，461，361、No. 6，585，696、No. 6，620，125 和 No. 6，802，822 以及 PCT 公布No. WO 96/39212,WO 2007/059801和WO 2010/095128中示出，这些专利均以引用方式并入本文。液体纤维蛋白密封剂制剂在外科手术中施加前包含至少两种组分。在一个实施例中，液体纤维蛋白密封剂制剂包含两种液体组分，第一组分包含纤维蛋白原，并且暴露于包含蛋白水解酶(诸如人凝血酶)的第二组分时，形成纤维蛋白凝块。在外科手术中，施加单独的液体组分(例如两种液体组分)，例如通过同时或相继地排空的两只注射器，从而导致两种组分混合并形成纤维蛋白。在本发明的一个实施例中，蛋白水解酶是活性为约2IU/ml至约4，000IU/ml的人凝血酶。凝血酶的凝血活性可直接测量，例如根据欧洲药典检测分析法(0903/1997)程序；和/或间接测量，诸如通过测量在倾斜表面上的迁移长度(如已公布的美国专利申请2010/0203033中所述的“液滴测试”)或通过本领域已知的任何其他方法。技术人员应理解的是，纤维蛋白胶可由其可凝固蛋白的含量而定义，而不是基于可凝固纤维蛋白原的定义。在本发明的另一个实施例中，将纤维蛋白原和蛋白水解酶组分按一定方式施加，使得混合等体积的两种组分并在相应的伤口部位施加到患者身上。当然，应当理解，本发明的纤维蛋白基质可在外科手术中使用，也可用在必须止血的其他情形中。固体纤维蛋白密封剂共混物可通过将固体纤维蛋白原和固体凝血酶按任何所需的比率范围混合而制备。例如，当固体纤维蛋白原组分通过纤维蛋白原浓度为40-85mg/ml的含纤维蛋白原溶液制得，并且固体凝血酶组分通过凝血酶浓度为约800-1200IU/ml的含凝血酶溶液制得时，可分别按I : 1、3.2 1,6.4 I等比率将两种固体组分混合。混合可在控湿区域(25%的相对湿度，37°C的温度)中进行。可将混合粉末保持在密闭室中直至使用。可将含纤维蛋白原的溶液在干燥步骤前稀释到如含25mg/ml或20mg/ml的纤维蛋白原。两种组分的混合可在将固体纤维蛋白密封剂共混物施加到组织上之前进行或以所需的比率直接施加到组织上。在将液体纤维蛋白密封剂制剂施加到组织上的过程中，可按任何所需的比率范围施加含纤维蛋白原的组分以及含凝血酶的组分。例如，当纤维蛋白原组分的浓度为40-85mg/ml并且凝血酶浓度为约800-1200IU/ml时，可分别按I Ul 2、1 3、1 4、I : 5、1 : 6等比率混合两种组分。在本发明的一个实施例中，按I : I的比率施加液体纤维蛋白密封剂的组分。可按治疗有效量施加本发明的纤维蛋白基质。术语“治疗有效量”是指预防或治疗 疾病、障碍或病症所需的剂量。有效剂量可根据受试者的年龄和体重、疾病及其严重性(如切口的大小)以及本领域技术人员可认识到的其他因素而变化。例如，可按O. lmg/cm2至IOOmg/cm2范围内的重量施加固体纤维蛋白密封剂共混物,诸如按O. 5mg/cm2、lmg/cm2、4mg/cm2、8mg/cm2、16mg/cm2、30mg/cm2、60mg/cm2 或 IOOmg/cm2 的重量。在一个实施例中，对于IOmm的切口，通过分散IOOmg固体纤维蛋白密封剂共混物(每70mg纤维蛋白原1000IU凝血酶)然后喷涂液体纤维蛋白密封剂制剂，按顺序施加到6cm2的面积上。通过喷涂总体积为2ml的1000IU/ml的凝血酶和70mg/ml的纤维蛋白原(两种组分之间的比率为I : I)而施加液体制剂。在本发明的方法中，液体纤维蛋白密封剂制剂可按固体形式提供，然后在其施加前复原。复原可通过添加各种体积的可药用载体而进行。术语“复原”是指其中将固体转化成液体形式的过程。复原后的产品可以为通过将含水液体加到之前液体已被移除的干固体中而制得的液体产品。作为另外一种选择，液体纤维蛋白密封剂制剂可按冷冻形式提供，例如在_18°C或更低的温度下，然后在其施加前解冻。解冻可通过将装有液体组分的容器在室温(20°C至250C )、在2°C至8°C的温度或在37°C的温度下温育而进行。在另一个实施例中，同时地施加液体组分。而在又一个实施例中，相继地施加液体组分。固体组分可按液体形式提供，然后在其施加前干燥，如通过冻干(冷冻干燥)或喷雾干燥工序。作为另外一种选择，固体组分可按冷冻形式提供，然后在其施加前干燥。冷冻的组分可解冻后干燥或可直接从冷冻形式转化成固体，如通过升华。固体组分可按悬浮液提供，如在任何合适的溶剂中，包括非水性液体，诸如氢氟烃(HFE)或任何其他固体组分不溶于其中的载流体，诸如醇、醚或其他有机流体。在本发明的方法中，可同时地或相继地施加固体组分和/或液体组分。在一个实施例中，固体组分以共混物提供并同时地施加。在另一个实施例中，将固体组分在单独的容器中提供并同时地施加。在又一个实施例中，将固体组分在单独的容器中提供并相继地施加。本发明的纤维蛋白基质可通过外科医生治疗或预防缺陷所用的任何手段而施加，包括(但不限于)开放性手术和微创手术(MIS)，诸如在腹腔镜手术中。在本发明的一个实施例中，在手术部位产生切口，然后将纤维蛋白基质施加到缺陷上。在另一个实施例中，在手术部位产生切口，然后将切口钉合或缝合，再将纤维蛋白基质施加到缝钉或缝线上。患者可接受局部、区域或全身麻醉。术语“开放性手术”是指其中外科医生通过相对大的切口直接到达手术部位的手术。如本文所用，术语“微创手术”是指其中外科医生通过小切口或通过体腔或解剖学开口(如通过腹腔镜检查)到达手术部位的手术。可使用专门的技术来显示手术区域，诸如具有显微镜的微型摄像机、微型光纤闪光灯以及高清晰度监视器。可将具有“端部执行器”的器械诸如钳子、切割器、持针器、烧灼器等引入手术部位。
含纤维蛋白原和凝血酶的组分可得自诸如OMRIX公司(如HVICKI:, QUIXIlzi , ΑΓ)11];Χ!].'μ, I-VTiIIROMi' )、百特公司(Baxter)(如TISEEL*) ,CSL公司(如Beripiasf )等制造商。在一个实施例中，液体纤维蛋白密封剂组分由混合的人源血浆制造，并作为由两个小瓶组成的一次性试剂盒提供一个小瓶容纳生物活性组分2 (BAC2)，另一个小瓶容纳凝血酶。试剂盒还可以包括无菌施加装置和使用说明。在一个实施例中，BAC2组分为pH 6. 7-7. 2的无菌溶液，其主要由人纤维蛋白原的浓缩物组成。纤维蛋白原是与凝血酶结合时会形成凝块的人血蛋白。诸如BAC2溶液的液体纤维蛋白密封剂制剂可包含人纤维蛋白原浓缩物(55-85mg/ml)、盐酸精氨酸、甘氨酸、氯化钠、柠檬酸钠、氯化钙和注射用水(WFI)。在一个实施例中，凝血酶组分为pH 6. 8-7. 2的无菌溶液，其包含活化最终组合产品凝血作用的高纯人凝血酶。凝血酶是一种将BAC2中所含的纤维蛋白原转化成纤维蛋白的高特异性蛋白酶。凝血酶溶液可包含人凝血酶(800-1200IU/ml)、氯化钙、人白蛋白、甘露糖醇、乙酸钠和注射用水。可以作为BAC2原料的冷沉淀物以及可以作为凝血酶制备原料的冷上清(cryo-poor plasma)均可由混合的人源血衆制成。制备冷沉淀物和冷上清的步骤是熟知的。在一个实施例中，凝血酶通过从冷上清中色谱纯化凝血酶原，然后通过氯化钙进行活化而制成，如，如以引用方式并入本文的美国专利No. 5，143，838中所述。在另一个实施例中，纤维蛋白原组分衍生自冷沉淀物，尤其是浓缩的冷沉淀物。上文用作双液体纤维蛋白密封剂组分或冻干组分一部分的纤维蛋白原和凝血酶组分可由人类或哺乳动物血浆制备。然而，也可能的是，这些组分由重组方法制备。纤维蛋白原组分可根据美国专利No. 6，121，232和已公布的PCT申请WO 98/33533中所述的方法而制备，其中将纤溶酶(原)移除，如已公布的欧洲专利申请EP 1，390，485中所述，并且不添加氨甲环酸。无论是作为双组分液体纤维蛋白密封剂的一部分还是作为固体纤维蛋白密封剂共混物的一部分，衍生自血或血成分的纤维蛋白密封剂组分通常都要接受至少两个分离的病毒灭活/移除步骤。病毒灭活和移除过程可如通过以下方法进行纳滤、溶剂/去污剂、低pH处理、紫外线照射、硫氰酸钠处理和/或通过本领域已知的任何其他方法。术语“病毒灭活步骤”是指其中将病毒维持在溶液中但使之无活性(如通过溶解其脂质衣壳)的情形。术语“病毒移除步骤”是指其中通过物理方法将病毒从溶液中移除(如通过尺寸排除技术)的情形。术语“至少两个分离的病毒灭活/移除步骤”涉及进行至少两种不同且独立的处理，以用于灭活或移除病毒。可使用以下非限制性处理实例的两个或更多个的组合巴氏灭菌、溶剂/去污剂(S/D)、纳滤、低pH处理、紫外线照射和硫氰酸钠处理。使用衍生自浓缩冷沉淀物的BAC是有利的，因为这种成分除了纤维蛋白原外还包含有价值的血液组分，这些组分在诸如人凝血酶的蛋白水解酶与BAC溶液接触时起到重要的凝血作用。有价值的组分为例如因子VIII、因子XIII、纤连蛋白、玻连蛋白、血管性血友病因子(vWF)等。施加固体纤维蛋白密封剂共混组合物然后是液体纤维蛋白密封剂组合物而在组织上生成纤维蛋白基质，其密封优越性通过单独施加任一种密 封剂组合物均无法实现。根据本发明生成的纤维蛋白基质尤其适用于密封粘膜组织以及处于持续移动的其他肠内或湿润组织(如胃肠组织)中的缺陷。例如，本发明的纤维蛋白可用于防止胃肠手术的钉合切除或吻合中发生的泄漏并发症。此外，本发明的纤维蛋白可有利地用于疝气手术中假体的有力固定。以上或以下引用的专利申请、专利和出版物的公开内容据此均以引用方式并入。参考下列非限制性实例对本发明进行进一步描述。SM材料和方法冻干。按照以下循环进行冻干
权利要求
1.一种用于将纤维蛋白基质施加到湿润组织上的方法，包括 a)将有效量的固体纤维蛋白密封剂共混物施加到所述湿润组织上；以及 b)将有效量的液体纤维蛋白密封剂制剂施加到所述施加的固体纤维蛋白密封剂共混物的至少一部分上， 其中固体纤维蛋白密封剂共混物和液体纤维蛋白密封剂制剂的所述有效量足以在所述湿润组织上产生纤维蛋白基质，所述纤维蛋白基质具有相对于施加有效量的所述液体纤维蛋白密封剂制剂或所述固体纤维蛋白密封剂共混物中的任一者而言改善的密封强度。
2.根据权利要求I所述的方法，其中所述密封强度相对于施加所述液体纤维蛋白密封剂制剂的改善为至少I. 2倍。
3.根据权利要求I或权利要求2所述的方法，其中所述密封强度相对于施加所述液体纤维蛋白密封剂制剂的改善为约I. 7倍。
4.根据权利要求I至权利要求3中任一项所述的方法，其中所述施加在不富含、具有少量、缺乏或不含血管的组织和/或渗血或未出血组织上进行。
5.根据权利要求I至权利要求4中任一项所述的方法，其中所述固体纤维蛋白密封剂共混物包括含有纤维蛋白原的固体组分和含有与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的蛋白水解酶组分的固体组分。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述固体纤维蛋白密封剂共混物的所述含纤维蛋白原的组分通过干燥纤维蛋白原浓度低于25mg/ml的含纤维蛋白原的溶液的步骤而制备。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述纤维蛋白原浓度为约20mg/ml。
8.根据权利要求5至权利要求7中任一项所述的方法，其中所述蛋白水解酶为凝血酶。
9.根据权利要求I至权利要求8中任一项所述的方法，其中所述施加在组织缺陷上进行。
10.根据权利要求I至权利要求9中任一项所述的方法，其中所述施加在存在于所述组织中的缝钉或缝线的至少一部分上进行。
11.一种用于在潮湿表面上制备纤维蛋白基质的方法，包括如下步骤提供含有纤维蛋白原的固体组分；提供含有与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的蛋白水解酶的固体组分；提供液体纤维蛋白密封剂制剂；将有效量的所述固体组分施加到所述潮湿表面的至少一部分上；以及将有效量的所述液体纤维蛋白密封剂制剂施加到所述施加的固体组分的至少一部分上。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述潮湿表面不含纤维蛋白原。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述液体纤维蛋白密封剂制剂以固体形式提供并在其施加前复原。
14.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述液体纤维蛋白密封剂制剂以冷冻形式提供并在其施加前解冻。
15.根据权利要求11至权利要求14中任一项所述的方法，其中所述固体组分以液体形式提供并在其施加前干燥。
16.根据权利要求11至权利要求14中任一项所述的方法，其中所述固体组分以冷冻形式提供并在其施加前干燥。
17.根据权利要求11至权利要求16中任一项所述的方法，其中所述固体组分同时或相继施加。
18.根据权利要求11至权利要求17中任一项所述的方法，其中所述液体组分同时或相继施加。
19.根据权利要求11所述的方法，其中所述固体组分以共混物提供。
20.根据权利要求11至权利要求19中任一项所述的方法，其中所述表面为组织。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述组织不富含、具有少量、缺乏或不含血管和/或为渗血或未出血组织。
22.—种可根据权利要求I至权利要求21中任一项所述的方法获得的纤维蛋白基质。
23.一种用于治疗或预防有需要的受试者的湿润组织中的缺陷的方法，包括以下步骤 a)提供含有固体纤维蛋白原的组分，提供含有与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的固体蛋白水解酶的组分；以及提供液体纤维蛋白密封剂制剂； b)将有效量的a)的所述固体组分施加到所述湿润组织的至少一部分上；以及 c)将有效量的a)的所述液体纤维蛋白密封剂制剂施加到所述施加的固体组分的至少一部分上。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述湿润组织不富含、具有少量、缺乏或不含血管和/或为渗血或未出血组织。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的方法，其中所述缺陷为所述组织中的渗漏。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述渗漏物质不富含、具有少量、缺乏或不含血浆或血液组分。
27.根据权利要求23至权利要求26中任一项所述的方法，其中所述液体纤维蛋白密封剂制剂以固体形式提供并在其施加前复原。
28.根据权利要求23至权利要求26中任一项所述的方法，其中所述液体纤维蛋白密封剂制剂以冷冻形式提供并在其施加前解冻。
29.根据权利要求23至权利要求28中任一项所述的方法，其中所述固体组分以液体形式提供并在其施加前干燥。
30.根据权利要求23至权利要求28中任一项所述的方法，其中所述固体组分以冷冻形式提供并在其施加前干燥。
31.根据权利要求23至权利要求30中任一项所述的方法，其中所述固体组分同时或相继施加。
32.根据权利要求23至权利要求31中任一项所述的方法，其中所述液体组分同时或相继施加。
33.根据权利要求23所述的方法，其中a)的所述固体组分以共混物提供。
34.根据权利要求23至权利要求33中任一项所述的方法，其中所述缺陷为缝钉或缝线。
35.一种试剂盒，包括(i)包含固体组分的容器，所述固体组分包含(a)_纤维蛋白原组分和(b)_与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的蛋白水解酶组分，其中所述(a)和(b)组分位于单独的容器中或作为共混物位于相同的容器中；以及(ii)至少两个单独的容器，至少一个单独的容器包含液体、冷冻或固体形式的纤维蛋白原组分，而至少第二个单独的容器包含与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的液体、冷冻或固体形式的蛋白水解酶组分， 其中当(ii)的所述至少两个单独容器包含固体组分时，则所述(a)和(b)组分作为共混物位于相同的容器中。
36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述蛋白水解酶为凝血酶。
37.根据权利要求35或权利要求36所述的试剂盒用于施加到潮湿表面上。
38.根据权利要求35至权利要求37中任一项所述的试剂盒，其用于密封组织中的渗漏，所述组织不富含、具有少量、缺乏或不含血管和/或为渗血或未出血组织。
39.根据权利要求22所述的纤维蛋白基质或根据权利要求35至权利要求38中任一项所述的试剂盒用于治疗或预防湿润组织中的缺陷。
40.一种用于治疗或预防湿润组织中的缺陷的纤维蛋白基质，所述纤维蛋白基质通过如下步骤制备提供含有纤维蛋白原的固体组分；提供含有与纤维蛋白原反应时能够形成纤维蛋白的蛋白水解酶的固体组分；提供液体纤维蛋白密封剂制剂；将有效量的所述固体组分施加到所述湿润组织的至少一部分上；以及将有效量的所述液体纤维蛋白密封剂制剂施加到所述施加的固体组分的至少一部分上。
41.根据权利要求40所述的纤维蛋白基质，其中所述湿润组织不富含、具有少量、缺乏或不含血管和/或为渗血或未出血组织。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的纤维蛋白基质，其中所述缺陷为缝钉或缝线。
全文摘要
本发明涉及纤维蛋白基质、其制备以及有效密封粘膜或其他湿润组织中的缺陷的用途。
文档编号A61L24/00GK102791299SQ201180007775
公开日2012年11月21日 申请日期2011年1月27日 优先权日2010年1月28日
发明者E.伊兰, I.努尔, K.雷格夫 申请人:奥姆里克斯生物药品有限公司