用于治疗间质性肺病的因子xii抑制剂的制作方法

专利名称：用于治疗间质性肺病的因子xii抑制剂的制作方法
用于治疗间质性肺病的因子Xl I抑制剂本发明涉及因子XII和/或因子XIIa的细胞活性的非内源抑制剂的用途，用于治疗和/或预防纤维增生性间质性肺病，例如特发性肺纤维化。
背景技术：
间质性肺病(ILD)也称为弥漫性实质性肺病(DPLD)，指影响间质组织(在肺的气囊周围的组织和腔)的一组肺病。它涉及肺泡上皮、肺毛细血管内皮、基膜、血管周和淋巴周围周组织。特发性肺纤维化(IPF)定义为局限于肺且与普通型间质性肺炎(UIP)的组织学模式相关的、原因未知的区别性类型的慢性纤维性间质性肺炎。IPF肺的特征在于体系结构破坏、密集瘢痕形成伴随蜂窝样和分散的成纤维细胞病灶(密集的成纤维细胞增殖区域)。IPF具有进行性且通常致命的过程，具有在诊断后2-3年的生存中值。具有IPF的患者通常为50 — 70岁，并且发病率是每年对于女性为7. 4个病例/100，000并且对于男性为10. 7个病例/100，000。发病率、流行率和死亡随着年龄增加。迄今为止，大多数治疗策略已基于消除或抑制炎性组分。没有药理学疗法已证明是在IPF治疗中有效的。在IPF中所有目前可用的治疗试验严重受限于缺乏疾病病因学的明确了解。IPF的发病机理的最初假设是响应未知病原学因子(特发性)的慢性炎症导致伤口愈合应答的组织破坏、起始和传播，且随后导致进行性纤维化。近来提议指示炎症是触发纤维化过程起始所需的，但在疾病进展中起很小作用。与其他形式的慢性间质性肺病例如肉瘤样病和过敏性肺炎形成对比，IPF的特征在于仅有限的炎症。近来，已提出IPF主要是肺泡上皮损伤、异常肺泡伤口修复和重塑的病症。转化生长因子- β I (TGF-β I)是高度多效的细胞因子，其在伤口愈合、胚胎发育和与炎症和增殖相关的疾病状态例如组织纤维化中起基本作用。在成年小鼠中，在肺中的TGF-β过表达导致进行性肺纤维化。认为TGF-β促进肺中的纤维化应答，主要是由于对肺泡上皮细胞增殖的抑制，成纤维细胞增殖的刺激，驻留肺细胞包括上皮细胞的激活，其分化成胶原产生成肌纤维细胞。TGF-β I增强细胞外基质组分的合成且抑制其降解。此外，近期研究暗示TGF-β I可以通过调节促凝血和纤维蛋白溶解活性促成纤维化状况。特别地，已显示TGF-β I在不同细胞群体包括成纤维细胞中上调组织因子(外因性凝血途径的关键起始剂)和纤溶酶原激活物抑制剂(PAI)-1的表达。对于TGF-β I的细胞应答涉及配体与TGF-β受体II型(TPR-1I)的结合，其磷酸化TGF-β受体I型(T0R-1)。激活的TPR-1磷酸化受体结合的Smads (Smad 1、2、3、5和8),促进其与共有介质Smad (Smad 4)的异源二聚化和从细胞质到核的易位。在核内，Smad异源复合物与靶基因的典型smad结合元件(SBE)相互作用，以激活其转录。已显示人Smad 3和Smad 4结合包含CAGA盒的SBE。已在IPF患者的肺中观察到肺泡止血平衡的改变和肺泡内纤维蛋白的过度沉积。在这些条件下观察到的肺泡内纤维蛋白累积出现于在局部产生的促和抗凝血因子之间的失调，结合血浆蛋白质(包括纤维蛋白原)渗漏到肺泡腔内。在具有IPF的患者的支气管肺泡灌洗(BAL)液中增加的促凝血活性伴随减少的纤维蛋白溶解活性。已在肺纤维化的博来霉素动物模型中观察到在肺泡腔中的止血平衡的等同改变。在临床和实验性肺纤维化中，促凝血应答主要可归于与因子Vila相关的组织因子(TF)，而减少的纤维蛋白溶解活性归于通过纤溶酶原激活物抑制剂(PAI) -1对尿激酶型(u-PA)和组织型(t-PA)纤溶酶原激活物的抑制以及通过α 2-纤溶酶抑制剂对纤溶酶的封闭。尽管纤维蛋白是修复过程和正常伤口愈合所需的，但血管外纤维蛋白的持续和过度沉积被认为以几种方式促成纤维化肺病的病理机制。纤维蛋白可以充当促纤维化生长因子的储库。它掺入且灭活肺表面活性物质，对于维持低肺泡表面张力关键的肺脂蛋白复合物。表面活性剂功能障碍导致肺不张和肺顺应性的丧失。此外，表面活性剂系统的失活与通过纤维蛋白的邻近肺泡壁的“胶合”结合，被认为提供成纤维细胞在其上增殖且产生胶原的临时基质。此外，通过调节细胞迁移、细胞粘附和细胞增殖，u-ΡΑ/ΡΑΙ-Ι系统可以促成肺纤维化的发展。此外，多种凝血蛋白酶例如凝血酶、因子Xa和TF/因子-VIIa复合物显示出细胞活性，其还可以促成肺中的纤维化过程。大多数这些功能经由蛋白酶激活受体(PAR)的蛋白酶解激活介导。例如，凝血酶和因子Xa以PAR-1依赖性方式刺激成纤维细胞增殖和前胶原生产。另外，凝血酶经由PAR-1激活来诱导正常肺成纤维细胞分化为成肌纤维细胞。此夕卜，通过凝血酶、因子Xa和TF/因子VIIa复合物的PAR-1激活可以增加促纤维化和促炎细胞因子的表达。PAR-1在肺纤维化中的潜在作用通过近期发现得到强调，证实PAR-1缺陷小鼠被保护不受博来霉素诱导的肺纤维化。在肺纤维化的发展中强调由止血因子介导的细胞效应的重要性的另外证据来自近期观察，指示在纤维蛋白原缺陷小鼠中没有针对博来霉素诱导的肺纤维化的保护。发明概述本发明人惊讶地发现因子XII (FXII)在实验上诱导的肺损伤的纤维化时期过程中起作用。此外，观察到通过ERK1/2途径的药理学封闭和通过FXIIa特异性抑制减弱对肺成纤维细胞增殖的FXII依赖性诱导。这些结果将FXII/FXIIa置于肺纤维化的病理学中的中心位置。因此，能够干扰且封闭FXII激活或FXIIa活性的物质可以适合于封闭肺中的纤维化过程及其临床后果，即此类物质可以适合于通过特异 性抑制FXII/FXIIa的细胞活性来限制肺成纤维细胞增殖。在第一个方面，本发明涉及用于治疗和/或预防纤维增生性间质性肺病例如特发性肺纤维化的因子XII和/或因子XIIa (FXII/FXIIa)的细胞活性的非内源抑制剂。本发明的第二个方面是治疗和/或预防纤维增生性间质性肺病例如特发性肺纤维化的方法，所述方法包括给个体施用药学有效量的FXII和/或FXIIa的细胞活性的非内源抑制剂。在本发明的一个特别方面，治疗包括与治疗间质性肺病的第二种疗法剂或治疗原则的组合治疗。所述第二种疗法原则可以是氧疗法。用于治疗间质性肺病的所述第二种疗法剂可以是皮质类固醇药物、硫唑嘌呤、吡非尼酮、环磷酰胺、乙酰半胱氨酸和/或抗纤维化药(ant1-f ibrotics)0本发明的一个进一步方面是延长患有纤维增生性间质性肺病的患者的生存时间的方法，所述方法包括给所述患者施用药学有效量的FXII和/或FXIIa的细胞活性的非内源抑制剂。本发明的另外一个方面是减少与纤维增生性间质性肺病例如特发性肺纤维化相关的症状的方法，所述方法包括给患者施用药学有效量的FXII和/或FXIIa的细胞活性的非内源抑制剂。本发明的另外一个方面是用于治疗和/或预防纤维增生性间质性肺病例如特发性肺纤维化的药学试剂盒，所述试剂盒包含(I) FXII和/或FXIIa的细胞活性的非内源抑制剂，和(2)用于治疗间质性肺病的其他药物。所述其他药物可以选自皮质类固醇药物、硫唑嘌呤、吡非尼酮、环磷酰胺、乙酰半胱氨酸和抗纤维化药。附图简述

图1 :FXI1、FXI和HMWK的mRNA水平在IPF患者的肺中是升高的。(A) FXII, FXI和HMWK mRNA的表达通过RT-PCR在供体和IPF肺组织匀浆物(LH)以及从供体(n=10)和IPF (n=10)肺中分离的肺成纤维细胞和肺泡上皮II型细胞(AT II)中进行评估。给出的是与对于供体样品获得的值比较在IPF样品中的mRNA表达中的倍数增加(对于β -肌动蛋白表达标准化的)。(B)在IPF肺的健康(H)和纤维化(F)区域中FXI1、FXI和HMWK的表达。给出的是与对于供体样品获得的值比较在IPF样品中的mRNA表达中的倍数增加(对于β-肌动蛋白表达标准化的)。(C)结果呈现为平均值土s. e.m. ,*p<0. 05 ;斯氏t检验。ND ；未检测图2 FXII,FXI和HMWK的蛋白质水平在IPF患者的肺匀浆物中是增加的。(A)显示在供体和IPF患者的肺匀浆物中的FXI1、FXI和HMWK表达的代表性免疫印迹。β -肌动蛋白充当上样对照。(B)使用显色底物(B)的FXII活性测定。玉米胰蛋白酶抑制剂用于特异性封闭FXII活性。结果来自10个供体和10个IPF患者。数据呈现为箱形图，其中在每个盒内的水平线代表中值，每个盒的界限代表四分位数间距，并且须代表最大和最小值。通过曼-怀二氏检验来检验统计显著性。指示了显著性水平。图3 :在供体和IPF患者的肺组织中FXI1、FXI和HMWK的表达和定位。对得自供体和IPF患者的石蜡肺组织切片执行免疫组织化学染色。显示了每组的一个代表性IPF患者和五个中的一个对照。指示了条大小。

图4 FXII,FXI和HMWK的mRNA水平在博来霉素处理的小鼠的肺中是升高的。在对照和博来霉素肺匀浆物以及从对照(n=10)和博来霉素攻击的(n=10)小鼠的肺中分离的肺成纤维细胞和肺泡上皮II型细胞(AT II)中的FXI1、FXI和HMWK表达的定量RT-PCR分析。给出的是与对于对照肺获得的值比较在博来霉素肺中的mRNA表达中的倍数增加(对于β-肌动蛋白表达标准化的)。结果呈现为平均值土 s. e.m.，*〃ρ〈0. 0005，** ρ〈0. 005，*ρ〈0· 05 ;斯氏t检验。图5 :在对照和博来霉素攻击的小鼠的肺匀浆物中FXI1、FXI和HMWK增加的蛋白质水平。显示在盐水对照和博来霉素肺的肺匀浆物中的FXI1、FXI和HMWK表达的代表性免疫印迹。β_肌动蛋白充当上样对照。图6 :在对照和博来霉素处理的小鼠的肺中FXI1、FXI和HMWK的表达和定位。显示在来自盐水或博来霉素处理的小鼠的肺中的FXI1、FXI和HMWK免疫定位的代表性组织切片。显示了每组的一个代表性博来霉素小鼠和十个中的一个对照。指示了条大小。图7 =FXI1-/-小鼠被保护不受博来霉素诱导的肺纤维化。在博来霉素攻击后21天(A)野生型和(C) FXI1-/-小鼠的肺的苏木精和伊红染色。在博来霉素攻击后21天(B)野生型和(D) FXI1-/-小鼠的三色染色。绿色指示胶原染色。指示了条大小。(E)存活曲线证实在博来霉素攻击后WT和FXI1-/-小鼠的死亡率，η=20只小鼠/组。通过时序检验的显著性差异，P=O. 007FXI1-/-与WT存活相比较。图8 =FXI1-/-小鼠的肺中的纤维蛋白沉积在博来霉素应用后是未受损的。在博来霉素滴注后3周，来自博来霉素处理的WT和FXI1-/-小鼠的肺组织中的纤维蛋白免疫染色。红色指示纤维蛋白。显微照片选择为举例说明对于每个实验组在肺的异常和正常区域中纤维蛋白沉积的模式和程度。指示了条大小。图9 =FXIIa抑制剂减弱博来霉素诱导的肺纤维化。在(C，G)博来霉素或(A，E)盐水应用后21天时，肺的苏木精和伊红染色。在博来霉素(D，H)或盐水(B，F)滴注后21天时，肺的三色染色。绿色指示胶原染色。指示了条大小。(I)存活曲线证实在博来霉素攻击后WT和FXI1-/-小鼠的死亡率，n=20只小鼠/组。通过时序检验的显著性差异，P=O. 007。(J)在博来霉素或盐水施用后21天的顺应性测量。数据呈现为箱形图，其中在每个盒内的水平线代表中值，每个盒的界限代表四分位数间距，并且须代表最大和最小值。n=5只小鼠/ 组;***Ρ〈0· 05 ;AN0VA，Tukey’ s 事后检验。图10 B1B2-/-小鼠被保护不受博来霉素诱导的肺纤维化。(A)在博来霉素滴注后21天WT和B1B2-/-处理的小鼠的肺的H&E和马森-三色(Masson-Trichrom)染色。绿色指示胶原染色。指示了条大小。(B)存活曲线证实在博来霉素攻击后WT和B1B2-/-小鼠的死亡率，n=20只小鼠/组。通过时序检验的显著性差异，p=0. 86。(C)在博来霉素施用后21后天的顺应性测量。数据呈现为箱形图，其中在每个盒内的水平线代表中值，每个盒的界限代表四分位数间距，并且须代表最大和最小值。n=20只小鼠/组；差异不显著；曼-怀二氏检验。图11 =FXIIa刺激鼠肺成纤维细胞增殖。(A)在暴露于FXIIa的鼠肺成纤维细胞中的[3H]-胸苷掺入。值呈现为在至少3个中的一个实验内执行的四次测定的平均值土SEM。
** P<0. 0005 ； * P<0. 05 ；AN0VA, Tukey’ s 事后检验(B)显示在 6 μ g/ml FXIIa 刺激后 6 小时的鼠肺成纤维细胞中的细胞周期蛋白Dl表达的代表性免疫印迹。β_肌动蛋白充当上样对照。图12 :ρ44/42激酶调节FXII诱导的鼠肺成纤维细胞增殖。(A)鼠肺成纤维细胞用FXIIa处理所示时间点，并且通过蛋白质印迹分析p44/42、JNK、c-jun、p38和Akt激酶的活性和表达。如所示的经由磷特异性抗体检测磷蛋白。经由泛特异性抗体证实相等上样。数据是三次独立实验的代表。(B)在FXIIa刺激前，在用JNK、PI3K、MEK和p38激酶的特异性抑制剂(分别为SP600125、渥曼青霉素、PD98059和SB203580)预处理的鼠肺成纤维细胞中的[3H]-胸苷掺入。值呈现为在至少三个中的一个实验内执行的四次测定的平均值土SEM;
*Ρ〈0· 05 ;AN0VA、Tukey’ s 事后检验。图13 :uPAR介导FXIIa诱导的鼠肺成纤维细胞增殖。(A)在FXIIa刺激前，在用uPAR封闭抗体或IgG同种型对照抗体预处理的鼠肺成纤维细胞中的[3H]-胸苷掺入。(B)在来自uPAR的结构域2的肽(LRG或TCK)或随机肽的存在下，在暴露于FXIIa后的鼠肺成纤维细胞中的[3H]-胸苷掺入。值呈现为在至少三个中的一个实验内执行的四次测定的平均值土SEM ；**P<0. 0005 ;*Ρ〈0· 05 ；AN0VA, Tukey，s 事后检验。图14 uPAR是FXIIa有丝分裂促进活性所需的。(A)在FXIIa刺激后，从野生型(WT)或uPAR缺陷(uPAR-/-)小鼠中分离的鼠肺成纤维细胞中的[3H]-胸苷掺入。TGF^暴露充当阳性对照。CTI，玉米胰蛋白酶抑制剂。值呈现为在至少三个中的一个实验内执行的四次测定的平均值土SEM。**P<0. 0005 ；ANOVA, TukeyJ s事后检验。(B) FXII的免疫沉淀。对于uPAR特异性的抗体与来自用FXIIa刺激或未刺激的细胞的裂解产物一起温育30分钟。使用蛋白A-琼脂糖珠沉淀免疫复合物，并且使用针对FXII的抗体通过蛋白质印迹分析。uPAR充当上样对照。IgG LCh，IgG轻链；IgGHCh, IgG重链。图15 : α 5β I整联蛋白调节FXIIa介导的鼠肺成纤维细胞增殖。(A)在FXIIa刺激前，在用(A) β I或(B) α 5整联蛋白封闭抗体或IgG同种型对照抗体预处理的鼠肺成纤维细胞中的[3H]-胸苷掺入。值呈现为在至少三个中的一个实验内执行的四次测定的平均值土SEM ；***ρ<0. 0005 ；**ρ<0. 005 ；*ρ<0. 05 ；ANOVA, Tukey，s 事后检验。图16 :TGF-P I上调HLF中的FXII表达。(A，B)如通过(A)实时PCR和(B)蛋白质印迹评估的，在TGF-β I刺激后的HLF中FXII表达的时间过程。实时PCR结果表示为与对于未刺激的细胞获得的值比较在FXII表达中的倍数增加(对于β-肌动蛋白表达标准化的)，并且是平均值±30;11=3;〃？〈0.01。举例说明了三个中的代表性印迹。(C)在(B)中呈现的印迹的密度计分析；〃Ρ〈0. 01。图17 =TGF-β I 诱导 MAPK、Akt 和 Smad3 的磷酸化。(A) HLF 用 TGF-β I 处理所示时间点，并且通过蛋白质印迹分析p44/42、JNK、p38和Akt激酶的活性和表达。如所示的经由磷特异性抗体检测磷蛋白。经由泛特异性抗体证实相等上样。数据是四次独立实验的代表。(B)磷酸-Smad 3的TGF-β I依赖性易位 至核。HLF与TGF-β I 一起温育I小时，随后洗漆，固定且用磷酸-Smad 3抗体染色。箭头指示Smad 3的核定位。原始放大率40' /1. 25-0. 75油-物镜。条大小10 μ m。数据是三次独立实验的代表。(C)磷酸-Smad3的TGF-β I驱动易位至核的蛋白质印迹分析。HLF用TGF-β I处理I小时，制备核提取物且用针对磷酸-Smad 3、核纤层蛋白B和微管蛋白的抗体免疫印迹。核纤层蛋白B和微管蛋白用作上样对照以评估核馏分的纯度。数据是三次独立实验的代表。图18 =Smad 3和JNK激酶调节TGF- β1-诱导的HLF中的FXII表达。(A)在HLF中TGF-β I诱导的FXII表达的蛋白质印记分析。在与TGF-β I —起温育48小时前，HLF用SB431542、SP600125、渥曼青霉素(Wort)、PD98059或SB203580处理I小时。制备细胞裂解产物且检查FXII表达。β-肌动蛋白用作上样对照。举例说明了三个中的代表性印迹。(B)在(A)中呈现的印迹的密度计分析；〃 p〈0. 01 ；***ρ<0. 001。(C，F)通过经由蛋白质印迹针对(C) JNKl或(F)Smad 3的siRNA转染测定在HLF中的敲减(knockdown)效率。数据是三次独立实验的代表。(D，G) (D) JNKl或(G) Smad 3敲减对HLF中TGF-β I诱导的FXII表达的作用。数据是三次独立实验的代表。(Ε，Η)分别为(D)和(G)中呈现的印迹的密度计分析；*Ρ〈0· 05 ；** ρ<0. 01, ***ρ<0. 001。siR,零乱 siRNA ;wort,渥曼青霉素。图19 JNKl激酶不调节Smad3磷酸化和易位至核。(A，B)如所示的，HLF在(A)JNK抑制剂(3 600125)或(8)1^1 1抑制剂(SB431542)的不存在或存在下用TGF-β I处理，并且通过蛋白质印迹分析Smad 3和JNK的活性和表达。数据是四次独立实验的代表。(C)磷酸-Smad 3的TGF-β I驱动易位至核的蛋白质印迹分析。HLF用SB431542或SP600125预处理，并且随后未刺激或用TGF- β I刺激I小时，制备核提取物且用针对磷酸-Smad 3、核纤层蛋白B和微管蛋白的抗体进行免疫印迹。核纤层蛋白B和微管蛋白用作上样对照以评估核馏分的纯度。数据是三次独立实验的代表。图20 =TGF-β I经由位于位置-272上的SBE诱导FXII启动子活性。(A)FXII启动子缺失萤光素酶报道分子构建体的图示。成角的箭头指示转录起始位点。(B)NIH3T3细胞用所示FXII启动子缺失构建体转染且未刺激(白色条)或用TGF-β I刺激(黑色条)。如“实验程序”中所述测量萤光素酶活性。数据代表来自四次独立实验的平均值土SD，各自一式三份地执行P〈0. 01。(C)含有在-272位置上的假定smad结合位点(SBE)的FXII启动子区的图示。PGL3-299C/T代表其中SBE-272通过在位置-273上的C残基替换为T进行突变的构建体。(D)NIH3T3细胞用pGL3-299或pGL3-299C/T构建体进行转染。在未处理(白色条)和TGF-β I处理(黑色条)的细胞中测定萤光素酶活性。数据代表来自四次独立实验的平均值土SD，各自一式三份地执行；〃ρ〈0.01。图21 =TGF-β I经由位于位置-272上的SBE诱导FXII启动子活性。(A)pGL3_299构建体和缺乏SBE-272的构建体(pGL3-183DSBE-272)的图示。(B)NIH3T3细胞用pGL3_299或PGL3-183DSBE-272转染，且在未刺激(白色条)和TGF-β I刺激(黑色条)的细胞中测定萤光素酶活性。数据代表来自三次独立实验的平均值土 SD，各自一式三份地执行；* *p〈0. Ol0 (C)在与TGF- β I 一起温育前，用pGL3-399构建体转染的ΝΙΗ3Τ3细胞用SB431542、SP600125、渥曼青霉素(Wort)、PD98059或SB203580预处理I小时。在未处理(白色条)和TGF-β I处理(黑色条)的细胞中测定萤光素酶活性。数据代表来自三次独立实验的平均值土SD，各自一式三份地执行；*ρ<0. 05 ；**ρ<0.01 ;***ρ〈0·001。wort，渥曼青霉素。图22 =Smad 3-SBE-272相互作用在JNK抑制剂的存在下是被抑制的。(A) HLF是未刺激的或用TGF-β I刺激的，并且使用Smad 3抗体或同种型IgG对照执行ChIP分析。如“实验程序”中所述用免疫沉淀的DNA执行PCR。通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并且通过用溴化乙啶染色检测。数据是三次独立实验的代表。(B)来自未处理或TGF-βΙ处理的细胞的核提取物与生物素化的模板(SBE-283/-258或SBE-283/-258C/T)—起温育，并且通过蛋白质印迹检测Smad 3。数据是三次独立实验的代表。(C)在与TGF-β I —起温育前，HLF用SB431542 或SP600125预处理I小时。使用Smad 3抗体或同种型IgG对照执行ChIP分析。如“实验程序”中所述用免疫沉淀的染色质执行PCR。数据是三次独立实验的代表。(D)在加入TGF-β I前，HLF与SB431542或SP600125 —起预温育I小时。制备核提取物且随后与生物素化的模板(SBE-283/-258)—起温育。通过蛋白质印迹检测Smad 3。数据是三次独立实验的代表。图23 :在小鼠中的实验性肺纤维化中FXII的表达和分布。(A)博来霉素应用用于在小鼠中诱导特发性肺纤维化(IPF)型疾病，并且对处理的动物的支气管肺泡灌洗液中的FXII浓度进行定量。(B)显示了小鼠用博来霉素处理后第14天和第21天时的小鼠肺中的FXII表达(蛋白质印迹分析)。(C)显示了在博来霉素处理的小鼠中与β-肌动蛋白mRNA有关的FXII mRNA的表达，还指示在博来霉素应用后第14天和第21天时的倍数增加。(D，E)证实了在博来霉素处理的小鼠中的组织体系结构和FXII (红色)的分布。图24 =FXII缺陷对小鼠中博来霉素诱导的IPF的影响。(A)显示了在野生型(WT)和FXII缺陷动物中因子XII(红色)的分布。此外，记录了胶原沉积的分布。注在FXII缺陷小鼠中，肺组织体系结构几乎不受影响且类似生理学情况，不可见主要胶原沉积。(B)对于博来霉素处理的组记录了与FXII缺陷小鼠相比较，野生型小鼠的存活曲线(Kaplan-Meier曲线)。(C)记录了博来霉素处理的野生型或FXII缺陷小鼠的肺功能的顺应性，指示FXII缺陷小鼠不受IPF情况的几乎完全保护。(D，E)与野生型组相比较，隔膜厚度以及胶原含量在博来霉素处理的FXII缺陷小鼠中是不扩大的。图25 =FXIIa抑制剂“玉米胰蛋白酶抑制剂”(CTI)的施用在小鼠中保护不受博来霉素诱导的IPF情况。(A)在博来霉素施用后，未处理的野生型小鼠显示出显著增加的FXII表达以及胶原沉积，而CTI处理的小鼠在很大程度上被保护不受肺重塑和胶原沉积。(B)存活曲线(Kaplan-Meier曲线)指示接受FXII抑制剂CTI的博来霉素处理的小鼠被显著保护不受IPF型肺纤维化。(C)在接受CTI的处理组中，肺顺应性得到显著改善。(D，E)通过博来霉素应用引起的在隔膜厚度和胶原含量中的增加在小鼠的治疗性CTI组中得到显著阻止。发明详述本发明涉及用于治疗和/或预防间质性肺病的方法，所述方法包括给受试者施用药学有效量的FXII/FXIIa的细胞活性的非内源抑制剂，即施用此类抑制剂预防和/或限制肺成纤维细胞的增殖。同样地，本发明涉及非内源细胞FXII抑制剂用于制造用于治疗和/或预防间质性肺病的药物中的用途。因子XIIFXII是作为单链78kD酶原在肝中产生的多肽。在激活后，FXII转化为由重和轻链组成的两链形式。重链含有下述结构域引导肽、纤连蛋白II型结构域、表皮生长因子(EGF)结构域、纤连蛋白I型结构域、kringle结构域和富含脯氨酸的结构域,其对于FXII是独特的。轻链含有对于丝氨酸蛋白酶一般的催化结构域，由此FXII具有与丝氨酸蛋白酶家族的其他成员相似的结构域组构，例如组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活物(u-PA)或因子VII激活的蛋白酶。重链含有沿着纤连蛋白I型区关于位于氨基末端上的带负电表面的结合区，并且可能位于第二个EGF样结构域或kringle结构域上。在轻链中的FXII活性位点由典型催化三分子组成，包括His40、Asp89和Serl91残基。这个位点还是关于主要内因性凝血途径抑制剂，Cl抑制剂的靶。FXII通过激肽释放酶的切割或其自体活化导致FXII酶原中 结合的Arg353-Val354的分裂，导致活性a XIIa形式的生成，其含有由二硫键连接的重和轻链。在aXIIa形式中两个另外肽键的水解生成30kDi3XIIa，含有轻链和重链的截短片段。a XHa能够结合带负电的表面且激活FXI和前激肽释放酶(ΡΚ)。β XIIa不具有表面结合能力但可以激活ΡΚ。如本文使用的，术语“因子XII”或“FXII”指因子XII的上述形式中的任何。特别地，该术语包括激活型因子XIIa (FXIIa)。间质性肺病间质性肺病(ILD)也称为弥漫性实质性肺病(DPLD)，指影响间质组织(在肺的气囊周围的组织和腔)的一组肺病。它涉及肺泡上皮、肺毛细血管内皮、基膜、血管周和淋巴周围周组织。在本申请的意义上的ILD特别涉及肺成纤维细胞增殖且因此使用术语“纤维增生性ILD”。这种肺成纤维细胞增殖应通过本发明进行治疗和/或预防。优选地，依照本发明待治疗的ILD是肺纤维化。最优选地，肺纤维化是特发性肺纤维化。特发性肺纤维化(IPF)定义为局限于肺且与普通型间质性肺炎(UIP)的组织学模式相关的、原因未知的区别性类型的慢性纤维性间质性肺炎。IPF肺的特征在于体系结构破坏、密集瘢痕形成伴随蜂窝样和分散的成纤维细胞病灶(密集的成纤维细胞增殖区域)。FXII的细胞活性的非内源抑制剂
术语“FXII的细胞活性的非内源抑制剂”或“非内源细胞FXII抑制剂”指能够减少FXII和/或FXIIa的细胞活性或其量的任何非内源化合物。在本发明的意义上的FXII抑制剂包括干扰FXIIa的催化活性的化合物。进一步包括的是能够在体内减少FXII或FXIIa的量的化合物。此类抑制剂包括能够减少FXII的表达的化合物。进一步地，包括的是干扰FXII转化成FXIIa的抑制剂。此类抑制剂将FXII和/或FXIIa的生物学功能减少至少50%、优选至少75%、更优选至少90%且更加优选至少95%例如至少98%或甚至至少99%。生物学功能指示FXII/FXIIa的任何已知细胞效应。所述细胞功能的例子是对细胞特别是肺成纤维细胞或平滑肌细胞的增殖和/或促有丝分裂作用。在本发明的意义上上的“非内源”抑制剂是在其中FXII/FXIIa应被抑制的物种中并非天然存在的FXII/FXIIa抑制剂。FXII/FXIIa的内源抑制剂是例如抗凝血酶、Cl抑制齐U、α -1蛋白酶抑制剂。本发明的非内源FXII/FXIIa抑制剂比内源FXII/FXIIa抑制剂特异得多，即根据本发明的抑制剂对于FXII/FXIIa是非常特异性的。这种特异性可以表示为例如获得FXII/FXIIa活性的50%减少所需的特异性抑制剂与FXII/FXIIa的摩尔比。这称为在本发明的意义上的摩尔抑制比。O. 5的摩尔抑制比意指加入lpmol FXII/FXIIa中的O. 5pmol抑制剂导致FXII/FXIIa活性的50%减少。本发明的特定的即非内源抑制剂是具有小于或等于10、或者优选小于或等于5或者更优选小于或等于2或者更加优选小于或等于I例如小于或等于O. 5的摩尔抑制比的抑制剂。用于测定FXIIa 的催化活性的测试在 Kannemeier C, Shibamiya A, Nakazawa F,Trusheim H，Ruppert C，Markart P，Song Y，Tzima E，Kennerknecht E,NiepmannM,BruehlML, Sedding D，Massberg S，Giinther A，Engelmann B，Preissner KT. Extracellular RNAconstitutes a natural procoagulant cofactor in blood coagulation. Proc Natl AcadSci USA. 104:6388-6393,2007中描述。简言之，将FXIIa样品和显色底物肽混合，并且在光度计中在405nm处随着时间过去跟踪对硝基苯胺的释放。如果化合物能够在那个测定中以显著方式将催化活性减少优选至少10%、更优选至少25%、最优选至少50%例如至少75%或甚至至少90%，那么它作为F XIIa的催化特别是酶促活性的抑制剂是合适的。用于测定FXII转化成FXIIa的程度的测试通过在显色肽测定中跟踪FXIIa的增力口，以与上文描述相似的方式进行描述。如果化合物根据那个测定能够将这种转化抑制至显著程度；优选地，受抑制剂影响的转化中的减少是至少10%、更优选至少25%、最优选至少50%，那么化合物作为干扰FXII转化成FXIIa的抑制剂是合适的。描述了测定FXII和/或FXIIa的量的方法，其中FXII/FXIIa的总量使用FXII特异性抗体通过酶联免疫吸附测定(ELISA)进行定量，并且通过经由SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析样品测定被激活的FXII的部分，随后为蛋白质印迹以定量蛋白质条带模式。此类方法包括蛋白质检测的已知方法例如ELISA和其他免疫学技术。抗FXII 抗体针对FXII和/或FXIIa的抗体可以用于抑制FXIIa的功能。此类抗体包括例如抗FXII抗体，包括多和单克隆抗体。抗体还可以是保留抑制活性的相同或模拟的片段，例如如公开于美国专利6，613，890特别是第4 一 8栏中的淀粉样蛋白前体蛋白的Kunitz蛋白酶抑制剂结构域的类似物。蛋白酶抑制剂抑制FXIIa活性的有效方法是使用特异性、非内源蛋白酶抑制剂例如丝氨酸蛋白酶抑制剂。例子包括抑肽酶，Z-Pro-Pro-醛-二甲基乙酸酯，DX88 (Dyax Inc.,300Technology Square, Cambridge, MA 02139, USA ;引用于Williams A.和 BairdLG.，Transfus Apheresis Sc1. 2003Dec :29 (3) :255-8)，脯氨酰寡肽酶的抑制剂例如Fmoc-Ala-Pyr-CN，玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI )，牛胰胰蛋白酶抑制剂突变体和Pro-Phe-Arg-氣甲基-丽(PCK )。其他合适的抑制剂可以是如由H.1sawa等人(J Biol Chem277:27651-27658,2002)公开的Hamadarin。合适的玉米胰蛋白酶抑制剂及其生产方法公开于Z. Y. Chen等人(Appl Environm Microbiol65:1320-1324，1999和同处引用的参考文献19)中。引用的所有参考文献包括其在本申请中的完整内容通过引用合并。最后但并非最不重要的，例如经由使用FXII各自的FXIIa抑制作为选择基于其上的测定分离的小分子，以及其在上文或下文描述的各自用途是本发明的部分。这些小分子FXIIa抑制剂可以在FXII的晶体结构的基础上进行设计。因此，几个FXII结构域或轻链可以在表达系统中重组表达，所述表达系统例如大肠杆菌(E. coli )、酵母或哺乳动物细胞。随后使用如对于FXII底物FXI描述的标准程序纯化且结晶蛋白质(Jin L等人J Biol Chem. 280:4704-4712,2005)。与大肠杆菌素(ecotin)突变体复合的FXIa催化结构域的晶体结构揭示底物样相互作用。备选地，可以包括小分子丝氨酸蛋白酶抑制剂以稳定FXII结构。近来，FXII/FXIIa的新型抑制剂在昆虫中发现来自骚扰锥蝽(Triatomainfestans)(一种吸血昆虫)的中肠的 Infestin 结构域 3-4 (Infestin 3-4)和 Infestin结构域 4( Infestin_4)(Campos ITN 等人 2002.1nfestin, a thrombin inhibitor presentin Triatoma infestans midgut, a Chagas' disease vector gene cloning, expressionand characterization of the inhibitor.1nsect Biochem. Mol. Biol.32:991-997 ；Campos ITN 等人 2004.1dentification and characterization of a novel factorXIIa inhibitor in the hematophagous insect, Triatoma infestans (Hemiptera Reduviidae). FEBS Lett. 577:512-516)。这些蛋白质称为Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的有力FXIIa抑制剂，将活化部分促凝血酶原激酶时间延长约三倍。在国际专利申请 W02008/098720 中，描述了 Infestin 3-4 和 Infestin-4 以及Infestin 4的白蛋白融合蛋白(rHA-1nfestin_4)作为FXIIa的有力抑制剂的用途以及这些分子本身。此外，与Infestin-4具有极高相似性的人蛋白质描述为SPINK-1，在胰腺中表达的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(也称为胰分泌性胰蛋白酶抑制剂，PSTD0基于野生型SPINK-1序列，已描述了三种不同的突变体，伴随与Infestin-4具有增加的同源性的SPINK-1序列。成熟SPINK-1野生型蛋白质的氨基酸序列、三种突变体和Infestin-4作为SEQ ID NO 29-33给出。在一个实施方案中，本发明的FXII抑制剂包含来自SPINK-1的突变型Kazal抑制剂，其中抑制剂具有对Infestin-4增加的同源性。术语“具有增加的各自增加的同源性的SPINK-1突变体”指含有与Infestin-4具有超过20个等同氨基酸的突变体，或保守置换代替同一性意指保守置换代替等同氨基酸。优选地，所述突变型Kazal抑制剂与被抑制的FXIIa的接触位点来自Kazal型抑制剂Infestin的结构域4。W02008/098720的完整描述在此通过引用合并入本申请。因此，infestin或其片段、或者 Infestin 3-4 或 Infestin-4、或来自 SPINK-1 的所述突变型Kazal抑制剂，其中抑制剂与Infestin-4具有增加的同源性，和如下所述的融合蛋白rHA-1nfestin-4是根据本发明的FXII/FXIIa的细胞活性的合适非内源抑制剂。换言之,在一个实施方案中，本申请提供了包含Infestin结构域4, Infestin-4的FXII抑制剂。在一个实施方案中，FXII抑制剂包含Infestin-4的变体。在另一个实施方案中，FXII抑制剂包含Infestin结构域4，和任选的Infestin结构域1、2和/或3 ;这些蛋白质已知是FXII的有力抑制剂。提供了 Infestin-4的野生型多肽序列(SEQ ID NO:33)。如本文使用的，术语“变体”指具有氨基酸突变的多肽，其中“突变”定义为对于野生型Infestin-4序列的置换、缺失或添加，其中此类变化不改变多肽抑制FXII的功能能力。术语“变体”包括野生型或突变型Infestin-4序列的片段。此类变体的进一步例子在下文提供。在一个实施方案中，Infestin-4变体包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13，和导致与野生型Infestin-4序列的差异在N末端氨基酸外的至少一个并直到五个氨基酸突变，或六个保守的半胱氨酸残基和与野生型Infestin-4序列至少70%的同源性。Infestin-4序列的N末端氨基酸2_13对于结合FXII可以是重要的，基于关于与凝血酶结合的有关抑制剂长红锥蝽(Rhodnius prolixus) (PDB :1 TS0)的结构数据分析,和与胰凝乳蛋白酶结合的SPINK-1的分析，其共享在N末端区域中的接触位点累积的共同特征。因此，在一个实施方案中，Infestin-4的变体包含野生型Infestin-4序列的氨基酸2_13的保守N末端区域，和导致与野生型Infestin-4序列的差异在这些保守N末端氨基酸外的至少一个并直到五个氨基酸突变。突变可以是置换、缺失或添加。如本文使用的，术语“在所述N末端氨基酸外”指沿着变体的多肽链除包含序列VRNPCACFRNYV的氨基酸的邻接段(即来自野生型Infestin-4序列的氨基酸2_13)外的任何氨基酸。在另一个实施方案中，Infestin-4变体包含六个保守的半胱氨酸残基且与野生型Infestin-4序列具有至少70%的同源性。在一个实施方案中，六个保守的半胱氨酸残基是在野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48上 的氨基酸。在一个实施方案中，变体包含最终保守的半胱氨酸。在其他实施方案中，由于在Infestin-4变体中的插入或缺失，半胱氨酸残基的确切位置和与彼此的相对位置可以与野生型Infestin-4序列的位置6、8、16、27、31和48不同。然而，在这些实施方案中，Infestin-4变体包含所有六个半胱氨酸,并且可以与野生型Infestin-4序列共享 70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同源性。在实施方案中，Infestin-4的变体的特征在于它抑制FXII。抑制FXII的功能活性可以例如通过体外和/或体内表征进行评估，包括测试FXII酶活性的抑制、延长的凝血时间即活化的部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)的直接测定，或估计凝血的体内方法。Infestin-4变体的进一步例子是下文描述的SPINK-1突变体。一个实施方案涉及用于在人中的治疗用途的FXII抑制剂。可以采用与Infestin-4具有高相似性的人蛋白质。例如,与Infestin-4具有最高相似性的人蛋白质是SPINK-1，在胰腺中表达的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂(也称为胰腺分泌性胰蛋白酶抑制齐IJ，PSTI)。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族是丝氨酸蛋白酶抑制剂的众多家族之一。来自不同物种的许多蛋白质已得到描述(Laskowski M和Kato 1,49Ann. Rev. Biochem. 593-626,1980)。在Infestin-4和SPINK-1之间的氨基酸序列相似性在图12中概括。基于野生型SPINK-1序列(SEQ ID NO :29)，可以生成不同变体，以便增加SPINK-1序列与Infestin-4的同源性。短语“与Infestin-4增加的同源性”指由此对SPINK-1作出氨基酸突变的过程，以使SPINK-1序列更接近于Infestin-4序列。在一个实施方案中，SPINK-1是突变的，以包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13 ;给出多肽序列且称为Kl (SEQ ID NO :30)。如上所述，Infestin-4序列的N末端部分被认为对于FXII抑制功能是重要的。因此，在一个实施方案中，突变的SPINK-1的变体还包含野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13，和导致与野生型SPINK-1序列的差异在所述N末端氨基酸外的至少一个并直到五个氨基酸突变，并且其增加变体与野生型Infestin-4序列的同源性。在另一个实施方案中，突变的SPINK-1的变体包含六个保守的半胱氨酸残基且与野生型SPINK-1序列具有至少70%的同源性。突变可以是置换、缺失或添加。如上定义的，术语“在所述N末端氨基酸外”指沿着变体的多肽链除包含序列VRNPCACFRNYV的氨基酸的邻接段(即来自野生型Infestin-4序列的氨基酸2_13)外的任何氨基酸。术语“变体”包括所述突变的SPINK-1序列的片段。在一个实施方案中，六个保守的半胱氨酸残基可以是在野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56上的氨基酸。在一个实施方案中，变体包含最终保守的半胱氨酸。在另一个实施方案中，由于在SPINK-1变体中的插入或缺失，半胱氨酸的确切位置和与彼此的相对位置可以与野生型SPINK-1序列的位置9、16、24、35、38和56不同。然而，在这些实施方案中，SPINK-1变体包含所有六个半胱氨酸。在实施方案中，SPINK-1变体的特征还在于它抑制FXII。给出此类SPINK-1变体的例子且命名为K2和K3 (分别为SEQ ID NO :31和32)。在SPINK-1变体K2和K3中，制备在N末端外的进一步氨基酸置换，以便增加与Infestin-4的同源性，其中变体的特 征还在于它们抑制FXII活性。参见W02008/098720。在SPINK-1变体K3的情况下，制备五个氨基酸置换，以增加与Infestin-4的同源性。因此，在实施方案中，SPINK-1 变体可以与野生型 SPINK-1 序列共享 70%、75%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 同源性。具有延长半衰期的抑制剂本发明的一个优选实施方案是基于具有延长半衰期的Infestin同系物或其片段的FXII/FXIIa抑制剂，特别是Infestin-4和经修饰的哺乳动物Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的使用。因为Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂是相当小的蛋白质，所以可以预期如对于其他小蛋白质公开的快速肾清除率(Werle M.和Bernkop-Schnurch A. 2006. Strategiesto improve plasma half-life time of peptide and protein drugs. Amino Acids30:351-367)。克服多肽化合物的短血浆半衰期的一种方法是反复地或经由连续输注将其注射。优选地，多肽自身的固有血浆半衰期是增加的。因此优选使用融合至半衰期延长蛋白质(HLEP)的FXII抑制剂，特别是丝氨酸蛋白酶抑制剂。如本文使用的HLEP选自白蛋白、白蛋白家族成员、免疫球蛋白G的恒定区及其片段，和在生理条件下能够结合白蛋白、白蛋白家族成员以及免疫球蛋白恒定区的部分的多肽。作为特异性例子，白蛋白和免疫球蛋白及其片段或衍生物已描述为HLEP。Ballance等人(W001/79271)描述了许多不同治疗性多肽的融合多肽，当融合至人血清白蛋白时，其预期具有体内增加的功能半衰期和延长的保存期限。治疗性蛋白质可以直接或经由肽接头融合至白蛋白部分，并且描述了 C和N末端融合物。术语人血清白蛋白(HSA)和人白蛋白(HA)在本申请中是可互换使用的。术语“白蛋白”和“血清白蛋白”是更广泛的，并且包含人血清白蛋白(及其片段和变体)以及来自其他物种的白蛋白(及其片段和变体)。 如本文使用的，“白蛋白”共同指白蛋白多肽或氨基酸序列，或具有白蛋白的一种或多种功能活性(例如生物学活性)的白蛋白片段或变体。特别地，“白蛋白”指人白蛋白或其片段，尤其是如本文SEQ ID No:34中所示的成熟形式的人白蛋白，或来自其他脊椎动物的白蛋白或其片段，或这些分子或其片段的类似物或变体。白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含如上所述的HA序列的全长，或可以包括其能够稳定或延长治疗活性的一个或多个片段。此类片段可以是长度10个或更多个氨基酸，或可以包括来自HA序列的约15、20、25、30、50个或更多个邻接氨基酸，或可以包括HA的特异性结构域的部分或全部。可以根据本发明使用的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以是正常HA的变体。本发明的融合蛋白的治疗性多肽部分还可以是如本文描述的相应治疗性多肽的变体。术语“变体”包括保守或非保守的插入、缺失和置换，其中此类变化基本上不改变活性位点或活性结构域，其赋予治疗性多肽的治疗活性。特别地，可以根据本发明使用的白蛋白融合蛋白可以包括人白蛋白的天然存在的多态变体和人白蛋白的片段。白蛋白可以来自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人、猴、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白包括但不限于来自母鸡和鲑鱼的白蛋白。白蛋白连接的多肽的白蛋白部分可以来自与治疗性多肽部分不同的动物。可以根据本发明使用的白蛋白融合蛋白的白蛋白部分可以包含HA的至少一个亚结构域或结构域或其保守修饰。一般来说，白蛋白片段或变体将是至少20、优选至少40、最优选超过70个氨基酸长。白蛋白变体可以优选由 白蛋白的至少一个完整结构域或所述结构域的片段组成，或备选地包含白蛋白的至少一个完整结构域或所述结构域的片段,例如结构域1(SEQ ID NO 34的氨基酸 1_194)、2(SEQ ID NO 34 的氨基酸 195_387)、3(SEQ ID NO 34 的氨基酸388-585)、1+2 (SEQ ID NO 34 的 1-387)、2+3 (SEQ ID N034 的 195-585)或 1+3 (SEQ ID NO 34 的氨基酸1-194+SEQ ID NO 34的氨基酸388-585)。每个结构域自身由两个同源亚结构域构成，即 1-105、120-194、195-291、316-387、388-491 和 512-585，伴随包含残基 Lysl06_Glull9、Glu292-Val315和Glu492_Ala511的弹性亚结构域间接头区。除白蛋白外，甲胎蛋白，白蛋白家族的另一个成员，已声称在体内延长附着的治疗性多肽的半衰期(W02005/024044)。蛋白质的白蛋白家族，进化上相关的血清转运蛋白，由白蛋白、甲胎蛋白(AFP ;Beattie & Dugaiczyk 1982. Structure and evolutionof human alpha-fetoprotein deduced from partial sequence of cloned cDNA. Gene20:415-422)、afamin (AFM ;Lichenstein 等人 1994. Afamin is a new member of thealbumin, alpha-fetoprotein, and vitamin D—binding protein gene family. J. Biol.Chem. 269:18149-18154)和维生素 D 结合蛋白(DBP;Cooke & David 1985. Serum vitaminD—binding protein is a third member of the albumin and alpha fetoprotein genefamily. J. Clin.1nvest. 76:2420-2424)组成。它们的基因代表与人、小鼠和大鼠中的相同染色体区具有结构和功能相似性映射的多基因簇。白蛋白家族成员的结构相似性暗示其作为HLEP的可用性。因此本发明的另一个实施方案是使用此类白蛋白家族成员、其片段和变体作为HLEP。术语“变体”包括保守或非保守的插入、缺失和置换，其中此类变化基本上不改变活性位点或活性结构域，其赋予治疗性多肽的治疗活性。白蛋白家族成员可以包含各蛋白质AFP、AFM和DBP的全长，或可以包括其能够稳定化或延长治疗活性的一个或多个片段。此类片段可以是长度10个或更多个氨基酸，或可以包括各蛋白质序列的约15、20、25、30、50个或更多个邻接氨基酸，或可以包括各自蛋白质的特异性结构域的部分或全部。本发明的白蛋白家族成员融合蛋白可以包括AFP、AFM和DBP的天然存在的多态变体。蛋白质可以来自任何脊椎动物，尤其是任何哺乳动物，例如人、猴、牛、绵羊或猪。非哺乳动物白蛋白家族成员包括但不限于来自母鸡和鲑鱼的那种。IgG和不含抗原结合结构域的IgG片段也可以用作HLEP。治疗性多肽部分优选经由抗体的铰链区或肽接头连接至IgG或IgG片段，其甚至可以是可切割的。几个专利和专利申请描述了治疗性蛋白质与免疫球蛋白恒定区的融合，以延长治疗性蛋白质的体内半衰期。US2004/0087778和W02005/001025描述了 Fe结构域或免疫球蛋白恒定区的至少部分与增加肽的半衰期的生物学活性肽的融合蛋白，其否则将在体内快速降解。描述了 Fc-1FN-β融合蛋白，其实现增强的生物学活性、延长的循环半衰期和更大的可溶性(W02006/000448 )。公开了具有延长的血清半衰期和增加的体内效力的Fc-EPO蛋白质(TO2005/063808)，以及与 G-CSF (W02003/076567)、胰高血糖素样肽-1 (GLP-1)(W02005/000892)、凝血因子(W02004/101740)和白细胞介素-10 (US6, 403，077)的 Fe 融合物，都具有半衰期延长性质。因此，此类免疫球蛋白序列优选其Fe片段和变体可以用作HLEP。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂如Infestin-4和对于FXIIa具有增强的抑制特异性的经修饰的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂如SPI NK-1突变体可以融合至作为HLEP的Fe结构域或免疫球蛋白恒定区的至少部分，且在大肠杆菌、酵母、昆虫、植物或脊椎动物细胞或转基因动物中表达。SPINK-K2-FC融合蛋白示例性显示于SEQ ID No 53中。根据本发明，优选的FXII抑制剂是融合蛋白，将Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂如Infestin-4和经修饰的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂如SPINK-1突变体或其片段或变体连接至HLEP或其片段或变体的N或C末端，从而使得与未连接至HLEP的相应Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂相比较，所形成的融合蛋白具有增加的体内半衰期。间插肽接头可以引入治疗性多肽和HLEP之间。如果HLEP例如通过立体阻碍干扰治疗性多肽的比活性，那么可以引入可切割接头。用于接头切割的优选酶是内因性凝血途径的凝血蛋白酶，FXIIa、FXIa、FIXa, FVIIIa或FXa，其中最优选的切割酶是FXIIa。Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂家族是丝氨酸蛋白酶抑制剂的众多家族之一。来自不同物种的许多蛋白质已得到描述(Laskowski M和Kato1. 1980. Protein inhibitors ofproteinases. Ann. Rev. Biochem. 49 :593-626)。在上文定义内的“Infestin-4和经修饰的Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂”包括具有天然氨基酸序列或SEQ ID 30-33或49-52的多肽。然而，此类定义还包括具有轻微修饰的氨基酸序列的多肽，例如包括末端氨基酸缺失或添加的经修饰的N末端或C末端，只要这些多肽基本上保留各自Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的活性。在上文定义内的“Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂”还包括天然等位基因变异，其可以从一个个体到另一个存在且出现。在上文定义内的“Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂”进一步包括Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂的变体。此类变体在一个或多个氨基酸残基中不同于野生型序列。此类差异的例子可以包括通过一个或多个氨基酸残基(例如1- 10个氨基酸残基)的N和/或C末端平截，或在N和/或C末端上的一个或多个额外残基添加，以及保守氨基酸置换，即在具有相似特征的氨基酸组内执行的置换，例如(I)小氨基酸、(2)酸性氨基酸、(3)极性氨基酸、(4)碱性氨基酸、(5)疏水性氨基酸和(6)芳香族氨基酸。此类保守置换的例子显示于表I中。表1:
权利要求
1.用于治疗和/或预防纤维增生性间质性肺病的因子XII和/或因子XIIa(FXII/FXIIa)的细胞活性的非内源抑制剂。
2.权利要求1的抑制剂，其是能够抑制因子XIIa的催化活性的化合物。
3.权利要求1的抑制剂，其是能够减少或取消细胞中因子XII的表达的化合物。
4.权利要求1的抑制剂，其是能够抑制因子XII转化成因子XIIa的化合物。
5.权利要求1- 4的抑制剂，其是丝氨酸蛋白酶抑制剂。
6.权利要求1- 5的抑制剂，其选自 (i)野生型Infestin-4多肽序列(SEQID NO 33)或其变体，其中变体包含 Ca)野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2-13,和导致与所述野生型Infestin-4序列的差异在所述N末端氨基酸外的至少一个并直到五个氨基酸突变； 和/或 (b)来自所述野生型Infestin-4序列的六个保守的半胱氨酸残基和与所述野生型Infestin-4序列至少70%的同源性； (ii)SPINK-l(SEQ ID NO:29)，其是突变的以包括所述野生型Infestin-4多肽序列的N末端氨基酸2-13或所述突变的SPINK-1的变体，其中变体包含 a)所述野生型Infestin-4序列的N末端氨基酸2_13;和导致与所述野生型SPINK-1序列的差异在所述N末端氨基酸外的至少一个并直到五个氨基酸突变，并且其增加所述变体与所述野生型Infestin-4序列的同源性； 和/或 b)来自所述野生型SPINK-1序列的六个保守的半胱氨酸残基和与野生型SPINK-1序列至少70%的同源性；(iii)SPINK K1、K2 或 K3 (SEQ ID NO :30、31 或 32)； (iv)抑肽酶、玉米胰蛋白酶抑制剂(CTI)、牛胰胰蛋白酶抑制剂的突变体、和Pro-Phe-Arg-氣甲基丽(PCK)； (V)能够结合所述FXII/FXIIa的抗体。
7.权利要求6的抑制剂，其中所述抑制剂连接至半衰期增强多肽，其中所述半衰期增强肽任选是白蛋白、afamin、甲胎蛋白或维生素D结合蛋白、人白蛋白或其变体、免疫球蛋白或其变体、IgG的Fe。
8.权利要求7的抑制剂，其中所述半衰期增强多肽经由接头连接至所述FXII抑制剂。
9.权利要求8的抑制剂，其中所述接头是 (i)可切割的； (i i )可通过内因性、外因性或普通凝血途径的凝血蛋白酶切割的； (iii)可通过FXIIa切割的。
10.前述权利要求中任一项的抑制剂，其中所述纤维增生性间质性肺病是肺纤维化。
11.权利要求10的抑制剂，其中所述肺纤维化是特发性肺纤维化。
12.前述权利要求中任一项的抑制剂，其中所述治疗包括与第二种疗法的组合治疗，所述第二种疗法包含皮质类固醇药物、吡非尼酮、硫唑嘌呤、环磷酰胺、乙酰半胱氨酸、抗纤维化药和/或氧疗法的施用。
13.一种治疗和/或预防纤维增生性间质性肺病的方法，其包括给个体施用药学有效量的FXII/FXIIa的细胞活性的非内源抑制剂。
14.一种延长患有纤维增生性间质性肺病的患者的生存时间的方法，其包括给所述患者施用药学有效量的FXII/FXIIa的细胞活性的非内源抑制剂。
15.权利要求13- 14中任一项的抑制剂的使用方法，其中所述纤维增生性间质性肺病是特发性肺纤维化。
16.一种用于治疗间质性肺病的药物试剂盒，其包含FXII/FXIIa的细胞活性的非内源抑制剂和用于治疗和/或预防纤维增生性间质性肺病的其他药物。
17.权利要求16的药物试剂盒，其中用于治疗和/或预防纤维增生性间质性肺病的所述其他药物选自皮质类固醇药物、硫唑嘌呤、吡非尼酮、环磷酰胺、乙酰半胱氨酸和抗纤维化药。
全文摘要
本发明提供了用于治疗间质性肺病的方法，其包括给个体施用有效量的凝血因子XII的抑制剂。本发明进一步提供了用于那种治疗的用途和药物试剂盒。
文档编号A61K38/00GK103068845SQ201180017178
公开日2013年4月24日 申请日期2011年4月1日 优先权日2010年4月1日
发明者E·亚布隆斯卡, K·普雷斯纳, M·维格雷卡 申请人:尤斯图斯-李比希-吉森大学