专利名称：制备免疫球蛋白组合物的方法
技术领域：
本发明涉及一种制备病毒安全的免疫球蛋白组合物的方法，以及能够利用此方法制备的抗体制剂和药物组合物。
背景技术：
从人类血浆制备的且适合于静脉内施用的免疫球蛋白组合物在本领域中是已知的，且数十年来在多种疾病的治疗中起着重要作用。免疫球蛋白用于例如治疗人体感染，并且可以分为具有不同生化和生理性质的多种类别。免疫球蛋白G参与抵御病毒抗原，而IgM则主要在抗细菌和抗毒素的免疫应答中具有活性。免疫球蛋白溶液包含占各种百分比的IgG、IgA和IgM，且不同的制剂具有不同的 治疗应用，例如，IgM百分比较高的制剂用于预防或治疗细菌感染。与IgG制剂相比，IgM抗体易于在溶液中聚集。IgM制剂难以稳定化，尤其是在其与血浆浓度相比有所富集且储存在液体溶液中时。免疫球蛋白溶液通常从血浆或血清的组分(例如Cohn组分)中制得。随后对这些组分进行多个纯化步骤来除去包括病毒、变性蛋白、蛋白酶和脂质在内的污染物。用于组分分离的人类血清采集自数千供体，尽管对来源血浆进行了全面检测，但仍可能含有病原体病毒。因此，为了获得安全的用于医药应用的产品，用于使病毒灭活或除去病毒的处理步骤必不可少。用于病毒灭活/去除的若干种技术在本领域中是已知的，例如化学处理、UVC光照射或纳米过滤，实施这些技术是为了确保总体病毒安全性。然而，这些步骤可能对免疫球蛋白的活性具有负面影响；例如，过长的UVC照射时间可以使在最终免疫球蛋白溶液中所获得的天然的具有活性的IgM的产率降低。通过使用生产过程的实验室规模模型验证了这些处理步骤的病毒去除或灭活能力，并且对每个步骤都确定了去除或灭活系数。灭活/去除系数的提高为药物产品增添了额外的病毒安全性。现今，来自主管机构的准则要求在制造源自血浆的药物时至少有两个针对有包膜和无包膜的病毒的有效步骤。除了潜在的病毒以外，还有必要除去例如蛋白酶、蛋白聚集体和变性的免疫球蛋白等其他污染物，从而获得耐受良好的产品。对患者而言，变性的免疫球蛋白尤其是潜在的风险，因为其非特异性地激活补体的能力很高，从而在接受这些变性免疫球蛋白的患者中产生严重的副作用。该抗补体活性(ACA)通过《欧洲药典(EuropeanPharmacopoeia)》中描述的标准化测试来测量。为了(I)在静脉内施用后使患者对产品耐受、(2)确保产品符合有关病毒污染的生物安全性准则、(3)使产物在长期储存过程中稳定和(4)产生所需的化合物混合物/药物组合物，除去所有上述污染物是必须的。已使用经典的Cohn血浆组分分离法或其公知的变形方法(例如Cohn/Oncley，Kistler/Nitschmann)对人IgM溶液进行了初步纯化。使用冷乙醇沉淀法，将IgM组分回收在组分III或组分I/III (亦称为B或B+I)中。已描述了用来从组分III或Ι/III开始对富集有IgM的蛋白溶液进行纯化的方法。EP0013901描述了从组分III开始的纯化方法，包括使用辛酸的步骤、使用β_丙内酯的步骤和使用阴离子交换树脂的吸附步骤。该方法用于生产Penmglobhi ——迄今为止唯一的市售静脉内IgM产品。EP0352500描述了通过以下方法制备具有降低的抗补体活性的用于静脉内应用的IgM浓缩物使用阴离子交换层析、β-丙内酯、UVC光照射，并在升高的温度(40°C 60°C)下进行温育步骤。丙内酯是为了使潜在的病毒灭活而在灭菌步骤中使用的公知化学物质。由于β_丙内酯是可引起蛋白化学修饰的反应性很强的物质，所以免疫球蛋白的抗病毒活性和抗细菌活性也会有大量损失。用该方法制造的制剂因所述化学修饰而在液体溶液中仅在有限的时间内保持稳定。IgM的浓度超过总免疫球蛋白含量的50%。在ΕΡ0413187 (Biotest,生物测试股份公司)和EP0413188 (Biotest,生物测试股份公司)中，已描述了未经丙内酯化学修饰的IgM富集的蛋白溶液的制备。这些方法包括从Cohn组分III或ΙΙ/ΙΙΙ开始对适合的蛋白溶液进行辛酸处理和阴离子交换层析。在专利ΕΡ0413187 (Biotest，生物测试股份公司)中，辛酸处理通过搅拌15分钟来进行，以除去存在于Cohn组分III中的脂质。·由于要向患者静脉内施用大量的免疫球蛋白，所以必须获得可耐受的药物制剂。据已有描述，难以将IgM制剂制备成用于静脉内应用。就天然性质而言，IgM在结合抗原后是补体的强力活化剂。因此，对患者而言，变性的IgM分子的非特异性抗补体活性比变性的IgG分子要危险得多。EP0413187所述的制剂具有低抗补体活性，即O. 6 0.8CH50/mg蛋白，但是必须对其进行稳定化和用β-丙内酯进行病毒灭活。根据针对免疫球蛋白的EP专论，认为低抗补体活性为彡lCH50/mg蛋白。EP0413188B1 (Biotest，生物测试股份公司)描述了为了降低抗补体活性而使用阴离子交换层析来制备用于静脉内施用的富集有IgM的制剂。此外，还描述了在pH 4
4.5且在40°C 60°C、优选50°C 54°C进行热处理以降低抗补体活性。必须将该制剂冻干以确保该制剂持续数月的稳定性。未能显示出液体溶液的长期稳定性。另一种方法描述了在pH 4.0 5.0和在401 621、优选451 551通过利用对IgM制剂的温和热处理(EP0450412，Miles)来减少非特异性补体活化。在该专利申请中，将辛酸添加到Cohn组分III悬浮液中，从而通过离心除去前激肽释放酶活化剂和脂蛋白。但是，该处理会导致IgM的抗原决定簇部分丢失。这可能会使产生新生抗原的风险升高，从而导致人体内免疫原性增加或活性丧失。EP0835880 (US 6136312, ZLB)中已描述了在辛酸沉淀步骤后使用蛋白酶处理(例如，用胃蛋白酶)来制备用于静脉内应用的含IgM的蛋白溶液。蛋白酶处理使免疫球蛋白分子发生部分片段化，从而破坏了 Fab和Fe部分的完整功能活性。因此，经蛋白酶处理的免疫球蛋白不能认为是未经修饰的免疫球蛋白。此外，该制备方法会产生约5%的分子量小于IOOkD的片段。用来进行辛酸处理的已描述的方法(EP0413187和EP0835880)的缺点在于，辛酸处理在除去和灭活无包膜病毒方面并不有效，且不会除去几乎全部的蛋白水解活性。在EP 0345543 (Bayer, Miles)中，公开了用于治疗用途的含有至少33%IgM的高度浓缩的IgM制剂,该制剂基本不含同种凝集素效价(isoagglutinin titre)。在该专利申请中，通过添加辛酸来进行辛酸沉淀，并通过Synsorb亲和层析来除去同种凝集素。最终制剂必须冷冻干燥。总之，如果利用化学手段或酶手段对免疫球蛋白进行修饰，和/或通过层析进一步纯化，和/或进行温和热处理，则可以制造出具有低抗补体活性的含IgM的制剂。但是，产生未修饰的免疫球蛋白制剂的现有技术的方法不能实现针对所有潜在病毒的病毒灭活能力。虽然若干种方法(例如溶剂/去垢剂处理、辛酸处理、纳米过滤和热处理)可有效地灭活或除去有包膜病毒，但是仅有几种已知方法可灭活或除去无包膜病毒，例如细小病毒。这些无包膜病毒大部分都非常小，通常会穿过孔径大于20nm的纳米过滤器。而该孔径对于直径可高达30nm的IgM分子而言过小。无包膜病毒可被例如β-丙内酯等化学物质有效地灭活，但是，这也会产生功能受到破坏的经修饰的免疫球蛋白。另一种有效的处理是UVC照射(ΕΡ1842561，CAF-DCF)。然而，已知的溶剂/去垢剂处理、辛酸处理和温和热处理对无包膜病毒基本没有效果。因此，用现有技术的方法制得的具有低抗补体活性的所有含有未经化学修饰的IgM的制剂对人的使用而言在无包膜病毒(例如细小病毒)方面都不安全。 综上所述，分离出静脉内可耐受的含IgM制剂的现有技术方法具有一定缺点，例如，不能有效地灭活或除去无包膜病毒，在保持溶液中IgM的高产量的同时消除蛋白水解活性方面能力有限。(蛋白水解活性是指存在于制剂中的蛋白酶总和)。由于液体蛋白制剂必须能够长期(例如2年)储存，所以必须消除残余的蛋白酶活性，因为这些活性可以使药物制剂降解。 因此，本发明的目的是克服这些缺点。
发明内容
在第一方面，本发明提供一种从包含免疫球蛋白的血浆组分中制备IgM免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括(a)提供血浆组分，作为含有免疫球蛋白的溶液；(b)将C7 C9的羧酸与所述溶液混合，并用振动搅拌器处理经混合的溶液以使污染性蛋白沉淀；和(C)将沉淀出的蛋白从所述溶液中分离出，以产生含有IgM的免疫球蛋白组合物。申请人:出人意料地发现，在将免疫球蛋白溶液与羧酸混合的步骤中使用振动搅拌器极其有利。该方法步骤使得可以更有效地除去不需要的蛋白(包括蛋白酶)，并且产生了对用来制造免疫球蛋白药物的下游加工步骤更适合的中间产物；该中间产物使得这些下游加工步骤效率更高。特别而言，从步骤(c)获得的含有IgM免疫球蛋白的组合物可以与其他处理步骤组合，例如用温和酸条件进行的处理和用UVC照射进行的处理，从而产生适合于静脉内施用的含有IgM的免疫球蛋白产品或抗体制剂，且所述免疫球蛋白产物或抗体制剂具有以下有利性质(i)未经化学修饰；(ii)是病毒安全的；(iii)具有低蛋白水解活性(并因此在长期储存过程中稳定)；(iv)具有低抗补体活性；和(V)保留了高水平的天然的具有活性的IgM。通过本文所述的方法实现的病毒安全水平是此前不能取得的。此外，使用本发明的方法可获得具有此前未能取得的具有这些特征的组合的含IgM的免疫球蛋白产品或抗体制剂。特别而言，本发明的方法步骤实现了对病毒颗粒的更高水平的灭活和去除，尤其是对抗性非常高的无包膜病毒(例如细小病毒)尤其如此，这些病毒通常不易受到辛酸处理的影响。此外，与常规的搅拌相比，实现了改善的蛋白水解活性去除。这些特征是在保持高产率的未经化学修饰的IgM的同时获得的。上述发现与下述常规观点相反辛酸处理并不是针对无包膜病毒的有效步骤，且改善的病毒安全性必须通过用更严厉的方法(例如β-丙内酯处理)使病毒灭活来实现。此外，为人熟知的是，提高例如辛酸的浓度来完全除去蛋白水解活性会导致IgM的大量损失。本发明的结果通过使用振动模式的混合设备与辛酸处理结合而获得。这特别出人意料，因为已知的是IgM非常易受剪切应力的影响，这种剪切应力会导致不合需要的高抗补体活性。因此，不会想到使用振动混合器来制备IgM组合物，且不会预料到在处理含IgM的溶液期间使用振动混合时会产生如此有利的效果。此外，使用本发明的方法，在使用振动混合设备时增强了通过步骤(C)所实现的分离，例如，通过过滤从步骤(b)获得的经辛酸处理的溶液来进行的澄清化。更容易地实现了分离，从而减少了处理时间和制造成本，且步骤(c)产生了清澈的溶液，这为下游加工提 供了优势。通过对经辛酸处理的含IgM溶液的搅拌后产物进行过滤而得到的常规溶液呈乳白色或不透明。对从步骤(c)获得的含IgM的组合物优选进行用温和酸条件(例如，pH4)处理和UVC照射步骤，从而进一步改善病毒安全性并使最终产品稳定化。由于对从步骤(C)获得的含IgM的免疫球蛋白组合物的澄清化有所增强，因此可以降低UVC的必需照射时间，从而使无包膜病毒的病毒灭活程度大于3或41og1(l。这在UVC处理过程中产生了更高产率的天然的具有活性的IgM。出人意料的是，这些步骤产生了含有未经化学修饰和酶修饰的IgM的溶液，所述溶液具有更高产率的天然的具有活性的IgM，具有低的抗补体活性和低蛋白水解活性，且具有高的抗细菌和抗病毒活性，具有关于有包膜病毒和无包膜病毒的优异的病毒安全性；这对于静脉内施用的药物而言是关键特征。此外，经处理的含IgM溶液具有改善的长期稳定性，其在2°C 8°C下在液体溶液中持续超过12个月均非常稳定。因此，在另一方面，本发明提供能够用上文说明的本发明的方法获得的抗体制剂，以及含有IgM且蛋白水解活性低于8U/1的抗体制剂。特别而言，该抗体制剂适合于人类静脉内施用，且包含IgG、IgA和IgM，其中，总免疫球蛋白的至少5%是IgM。另外，本发明还提供用于医药应用的本发明的抗体制剂。在一个实施方式中，所述抗体制剂用于治疗免疫紊乱性疾病和细菌感染。本发明的另一方面提供一种治疗方法，所述方法包括向患者施用本发明的抗体制剂。现将结合附图
仅以举例方式来更详细地描述本发明。图I提供了本发明的实施方式的总览，其中示出了能够用来形成适合于静脉内施用的抗体制剂的各步骤。突出显示了采用振动混合器设备的辛酸处理步骤、PH4处理和UVC处理。起始材料从人血浆的标准冷乙醇沉淀过程获得。
具体实施例方式如上所述，本发明提供一种从包含免疫球蛋白的血浆组分制备含IgM的免疫球蛋白组合物的方法。适合于制备药物免疫球蛋白组合物的血浆组分及其制造方法在本领域中是公知的。特别而言，如果药物免疫球蛋白组合物用于施用给人，则从人血浆获得血浆组分。血浆组分优选为沉淀的血浆组分，最优选为通过Cohn组分分离方法或其公知的变形方法(例如Kistler-Nitschmann)获得的沉淀的血衆组分。最优选的是，所述组分为冷乙醇组分分离产生的组分Ι/ΠΙ或组分III (亦称为组分B+I或组分B)。血浆组分的免疫球蛋白优选包含至少5%的IgM。步骤(a)包括提供血浆组分，作为含免疫球蛋白的溶液。在许多情况下，包含免疫球蛋白的血浆组分会是固体或半固体形式。因此，该步骤的目的是确保或使得血浆组分的蛋白进入溶液，从而使得所述蛋白处在适合于在步骤(b)中与羧酸混合的状态。该步骤可以包括将血浆组分与适合的缓冲液混合。所述缓冲液优选为低摩尔浓度(即，低于1M)且pH为4. 5 5. 5，例如，pH为5. 05±0. I的O. IM乙酸钠缓冲液。混合可以使用桨叶混合器或振动揽祥器来完成。在步骤(b)中，使用振动搅拌器将步骤(a)中形成的溶液与C7 C9的羧酸混合，从而沉淀出污染性蛋白(例如，蛋白酶、病毒等)。所述羧酸可以具有支链和/或可以包含不会显著改变步骤(b)的效果的取代基。所述羧酸优选为辛酸。该酸优选以至少O. 075kg/kg血衆组分的浓度添加,最多以O. 2kg/kg的浓度添加。该酸更优选以O. 8kg/kg O. 15kg/kg血衆组分添加，最优选以O. 09kg/kg O. 13kg/kg添加。可以用任何便利的摩尔浓度的酸来提供正确的浓度。可以使用适合用于化工/制药工业的任何类型的市售振动搅拌器。适合的振动搅拌器的实例可以从Graber+Pfenninger GmbH获得。特别而言,“Labormode 11 Typ I”振动混合器可以用于实验室规模的实验，而“Industriemixer Typ 4”可以用于生产规模的制备。可以根据制造商的操作说明来使用振动混合器，特别是在被制造商描述为适合于混合含蛋白的溶液的设置下进行使用。例如，振动混合器通常可以在低于IOOHz下以小于IOmm的振幅工作，例如，本发明人在使用230V电源时在50Hz下使用“Labormode 11 Typ I”进行了实验室规模的振动混合。混合过程的振动振幅为O 3_不等，而对于IgM的制备，优选使用3mm。使用了直径为23mm 65mm的搅拌器板来进行实验室规模的实验。对于生产规模，使用了直径为395mm的搅拌器板(孔直径为13. 5mm和16mm)。在步骤(b)中，经混合的溶液的pH优选为4. 5 5. 5，更优选为4. 8 5. 3。该步骤可以在乙酸钠缓冲液中进行，例如，用约O. IM的乙酸钠缓冲液。执行步骤(b)的温度优选为10°C 35°C，更优选为14°C 30°C。对使用振动搅拌器的混合时间没有特别限制，但优选为30分钟至3小时，更优选为40分钟 110分钟。低于30分钟的温育时间可以降低病毒灭活水平。在步骤(b)的一个实施方式中，将磷酸三钙与步骤(b)中的溶液混合。优选其以
O.01kg/kg 0. 02kg/kg血衆组分添加(在血衆组分为固体或半固体形式时)。磷酸三隹丐可以与羧酸同时添加、分开添加或依次添加。在优选实施方式中，磷酸三钙在添加羧酸后至少20分钟添加。在步骤(C)中，将在步骤(b)中沉淀出的污染性蛋白从溶液中分离出，从而产生含有IgM的免疫球蛋白组合物(即，含免疫球蛋白的溶液)。对该分离步骤没有特别限制，可以用本领域中已知的任何适合的方法来执行该分离步骤。然而，该分离步骤优选使用过滤，更优选使用超滤来执行，因此，步骤(C)的产物是经过滤的溶液。如上所述，本发明的方法在生产方面具有优势，因为其显示出更高效地沉淀出了污染性蛋白，且步骤(C)因此更容易进行。当对步骤(b)产生的混合物进行分离时，获得了透明清晰的溶液，即含IgM的免疫球蛋白组合物。因此过滤更快且更容易。需要进一步的加工步骤来将从步骤(C)获得的含IgM的免疫球蛋白组合物转化为适合于静脉内施用的免疫球蛋白制剂。因此，在优选实施方式中，本发明的方法包括下述额外步骤以温和的酸条件处理从步骤(c)获得的含IgM的免疫球蛋白组合物，并进一步对经酸处理的组合物进行UVC照 射。在用温和酸条件进行处理时，在pH为3. 5 4. 5、优选为3. 8 4. 2下温育从步骤(c)获得的含IgM的免疫球蛋白组合物，从而形成经温育的溶液。温和酸条件可以通过向含IgM的免疫球蛋白组合物中添加适合的酸来获得,例如,可以通过添加O. 2M的HCl来调节pH。该温育步骤优选在32°C 42°C下、更优选在35°C 39°C下进行。温育时间优选为2小时至24小时，更优选为9小时至16小时。在照射步骤中，对于从上述温和酸处理中获得的经温育的溶液用UVC光进行处理，从而形成经UVC照射的溶液。该步骤可以使用市售的设备来进行,例如IjVivatecw设备(Bayer Technology Services)。为了使潜在的病毒和蛋白酶进一步灭活,优选以200J/m2 500J/m2、更特别以200J/m2 300J/m2在254 ± IOnm处理所述经温育的溶液。已注意至IJ，通常要求的在温和条件下的UVC处理仅对通过振动混合进行的辛酸处理后本发明所获得的水澄清滤液可行。标准搅拌技术所通常得到的更乳白或更不透明的溶液会需要更长的照射时间，这将导致IgM活性的更多变性及更低的病毒灭活率。除了温和酸处理和UVC照射外，用来获得静脉内施用的免疫球蛋白制剂的额外步骤还可以可选地包括一个或多个过滤步骤。在一个实施方式中，可以使处理中的蛋白溶液吸附到DEAE-交联葡聚糖凝胶上，随后通过深度过滤使之与交联葡聚糖凝胶分离。例如，可以进一步在pH 5. 8下以75mg/kg蛋白DEAE交联葡聚糖凝胶对所述蛋白溶液进行分批吸附，从而除去不需要的伴随性血浆铜蓝蛋白。在特别优选的实施方式中，使从温和酸处理中获得的经温育的溶液对DEAE-交联葡聚糖凝胶进行吸附，随后通过深度过滤使之与交联葡聚糖凝胶分离，然后进行UVC照射处理。在另一个实施方式中，处理中的免疫球蛋白溶液可以通过纳米过滤器来过滤。在处理过程中的各个阶段，可以使用孔径为75±5nm 35±5nm的过滤器或具有75nm 35nm标称孔径的过滤器(例如Pall Ultipor DV50)。(举例而言,50nm的标称孔径意味着对大小为50nm以上的病毒的截留率彡41og10)。在优选实施方式中，使从上文所述的DEAE-交联葡聚糖凝胶步骤中获得的溶液过滤通过O. 2 μ m过滤器，随后再进行UVC照射。在另一优选实施方式中，对UVC照射后得到的免疫球蛋白溶液进行纳米过滤，优选通过孔径为40nm 50nm的过滤器。优选的是，该步骤应当在无菌条件下进行。由上述方法获得的最终抗体制剂(即，经处理的含IgM的免疫球蛋白溶液)可以直接在无菌条件下填充到容器中。作为另一选择，可以将该抗体制剂与稳定剂(例如甘氨酸)配制在一起。特别而言，可以将该制剂配制在pH为4 5. 5、优选为4. I 4. 5的含甘氨酸的缓冲液中。还可以将该抗体制剂稀释至蛋白浓度为40g/L 80g/L、优选为55g/L 70g/L。本发明的方法优选不包括涉及对制剂中的抗体的化学修饰、对抗体的酶修饰或对抗体的热处理(例如,在40°C以上的温度对抗体进行10分钟以上的处理)中的一项或多项的步骤。更特别而言，本发明的方法不包括使抗体与β_丙内酯和/或胃蛋白酶接触的步骤。本发明还提供通过上述方法获得的免疫球蛋白制剂或抗体制剂。该免疫球蛋白制剂为多克隆的，且包含至少5%IgM、优选包含至少15%IgM且更优选包含至少20%IgM。其他免疫球蛋白为IgG和IgA。优选的是，该免疫球蛋白制剂包含5% 30% (更优选15% 30%)的IgM、5% 30%(更优选15% 30%)的IgA和40% 70%(更优选45% 70%)的IgG。在最优选的产品中，IgG含量为约50%，IgM和IgA的含量各自为约25%。这些值是指 占IgG+IgA+IgM之和的百分比，例如IgM占IgG+IgA+IgM之和的百分比。但是，也可以用公知的方法(例如阴离子交换层析)来进一步富集IgM。这些值可以通过浊度测定法或通过《欧洲药典(Ph. Eur.)》(当前版本(2010)2. 9. 17)的免疫沉淀来确定。特别而言，该免疫球蛋白制剂中的免疫球蛋白未经化学修饰。该免疫球蛋白制剂在其制造过程中未用化学物质(例如β_丙内酯)进行处理来对产品进行灭菌。类似地，该制剂未用添加的蛋白酶(例如胃蛋白酶)进行处理来对产品进行灭菌。因此，该免疫球蛋白基本为天然状态。该抗体制剂的蛋白水解活性低于现有技术中描述的抗体制剂。特别而言，当该制剂储存在2°C 8°C下时，在其中检测不到蛋白水解活性。蛋白水解活性可以用本领域中已知的标准化测试方法来测量，例如使用下文实施例6中所述的显色底物的方法。在此类方法中，蛋白水解活性通过以下方法来估算于37°C将显色底物(特别是对至少一种丝氨酸蛋白酶敏感的显色底物)与抗体制剂样品(通常稀释在缓冲液中以达到测定的线性范围)混合，随后使用分光光度计监测吸收动力学。该样品的蛋白水解活性通过使用等式C(U/L)=SX AAbs/分钟XF(C=蛋白水解活性；S=与显色底物的特定吸收变化相关的转换因子；F=稀释因子)由起始吸收差(AAbs/分钟)计算得到。根据制造商的操作说明来使用该底物。特别而言，蛋白水解活性可以通过以下步骤来估算(a)将 25mg 底物 S-2288 (Chromogenix)溶解在 7. 2ml 注射用水中；(b)将抗体制剂样品稀释在缓冲液(IOOmM Tris. HCl，pH 8. 4，106mM NaCl)中，以达到测定的线性范围，并将温度调节至37°C ；(c)将经稀释的抗体制剂与已溶解的底物以等量(例如200 μ I)混合；(d)使用分光光度计在405nm处于37°C测量吸收动力学I分钟 3分钟；(e)通过使用等式C(U/L) =313X AAbs/分钟XF(C=蛋白水解活性；F=稀释因子)由起始吸收差(AAbs/分钟)计算出样品的蛋白水解活性。该方法的定量测定极限是8U/1 ;使用本发明的抗体制剂的样品，检测不到蛋白水解活性。因此，本发明的最终产品中的蛋白水解活性水平低于8U/1。与本领域已知的制剂一样，本发明的抗体制剂可以储存在5 ± 3°C下。然而，由于用本发明的方法进行了高效的纯化，该抗体制剂的稳定性极佳。液体形式的最终产品在2°C 8°C下稳定至少3个月、优选至少6个月且最优选至少两年,这意味着在HPSEC测定中IgM的片段化或聚合不超过5%，蛋白水解活性没有增加，针对大肠杆菌的IgM抗体活性和针对肺炎球菌糖(Pneumococcus saccharide)的IgM抗体活性的下降不超过25%,且抗补体活性的增加不超过25%，保持低于lCH50/mg蛋白。此外，用相同的标准估算，通过本发明的方法产生的液体形式的最终产品在室温(23°C 27°C)下稳定至少3个月、优选至少6个月且最优选至少一年。
本发明的方法还提供了比现有技术的方法更高水平的病毒去除，从而获得了比现有技术的抗体制剂更安全的抗体制剂，特别是就有活性的无包膜病毒(例如细小病毒)而言尤其如此。本发明的方法能够除去/灭活病毒，特别是无包膜病毒，其除去/灭活程度超过31og1(l、优选超过41og1(l且最优选超过51og1(l。由此得到了基本不含病毒、特别是基本不含无包膜病毒(即，病毒安全)的抗体制剂。另外，本发明的方法能够在不显著影响活性IgM的量或抗体制剂的抗补体活性的情况下实现上述水平的病毒颗粒去除/灭活。因此，能够获得在有包膜病毒和无包膜病毒方面均为病毒安全的抗体制剂，其包含至少15%、更优选至少20%的水平的IgM，且抗补体活性彡lCH50/mg蛋白。本发明的抗体制剂适合于医药应用，并且可以用于治疗免疫紊乱性疾病和感染，特别是IgM缺陷疾病和细菌感染。与多价免疫球蛋白G制剂相比，可用本发明的方法制备的用于静脉内施用的富集有人IgM的多价免疫球蛋白制剂包含更高的针对临床相关的革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌的抗体效价、更高的针对革兰氏阴性细菌的内毒素和革兰氏阴性及革兰氏阳性细菌的外毒素的抗体效价。特别而言，本发明的抗体制剂适合于向患者静脉内施用，特别适合于对人进行静脉内注射。本发明还提供患者的治疗方法，所述治疗方法包括向该患者施用本发明的抗体制剂的步骤。特别而言，所述患者可以患有免疫紊乱性疾病或细菌感染。 现将仅以示例方式来进一步描述本发明。对用于确定抗补体活性的测试方法的说明根据《欧洲药典》中所描述的方法(方法2. 6. 17，欧洲药典，第6版，2008)来进行确定抗补体活性的测定。补体使经过溶血素预处理的绵羊红血球发生溶血。凭借样品中的补体结合性抗体，溶血得到了抑制。确定了被Img免疫球蛋白结合(灭活)了的补体的量。将一定量的免疫球蛋白(IOmg)与豚鼠的补体混合，并对游离的补体进行滴定。将抗补体活性表示为相对于参照溶液中所用补体的已用补体。补体活性的溶血单位(CH5tl)是导致最佳缓冲条件中的5 X IO8个红血球总量中的2. 5 X IO8个最佳制备的红血球发生溶血的补体的量。最佳制备的红血球(8ml来自绵羊的稳定化红血球，用白明胶-巴比妥缓冲液清洗了三次，最后将Iml红血球沉积物悬浮在24ml白明胶-巴比妥缓冲液中)通过以下方法制得将20ml红血球悬浮液与20ml溶血素(调节至2MHE/ml_最小溶血单位)混合,并于37°C温育15分钟。将IOmg当量的免疫球蛋白稀释在白明胶-巴比妥缓冲液(1L pH 7. 3的巴比妥缓冲液含Ig白明胶，5倍的巴比妥缓冲溶液83克氯化钠、10. 192g巴比妥钠于2升水中，pH
7.3)中。将200 μ I补体100CH5(l/ml添加至Iml的最终体积中。将试管在37°C下振荡温育I小时。稀释样品，并针对最佳制备的红血球对样品进行滴定。在37°C下温育I小时后，离心样品，并使用分光光度计在541nm处确定光密度。实施例I一从组分I/III制备富集有IgM的制剂将源自人血浆的冷乙醇组分分离过程的180kg Cohn组分I/III悬浮在720L O. IM的乙酸钠缓冲液(pH 5. 05)中，并在达到悬浮液温度(22±4°C )后混合15分钟 30分钟。通过在室温下添加19. 8kg辛酸(O. 110kg/kg所用的糊状物I/III)来对上述溶液进行处理，随后用振动混合器(V \^1'011化狀1'"\规格4, Graber+Pfenniger GmbH,将振动混合器调节至2 3级)将蛋白溶液进一步混合80分钟。历时30分钟缓慢添加辛酸。
添加约3kg磷酸三I丐((Ca3(PO4)2),随后再混合蛋白溶液至少15分钟。利用过滤器压力通过澄清过滤来除去沉淀。进行另外的0.2μπι过滤，并用IOkD膜对蛋白溶液进行超滤。以0.04Μ NaCl溶液为背景对蛋白溶液进行渗滤，之后将蛋白溶液调节至蛋白浓度为40g/L。在使用注射用水进行1+1稀释后,在pH 4. 0±0. I下处理蛋白溶液。pH调节通过使用IM HCl来进行，并于37°C ±2°C温育蛋白溶液9小时。在pH 4下温育之后，用IM NaOH将蛋白溶液调节至PH 5.8。对于所得到的蛋白溶液，通过分批添加DEAE交联葡聚糖凝胶(75g DEAE交联葡聚糖凝胶/kg蛋白)来进行进一步纯化。在搅拌下于室温温育蛋白溶液60分钟以上。通过澄清过滤来除去DEAE交联葡聚糖凝胶。对蛋白溶液进行O. 2μπι过滤。使蛋白溶液过滤通过O. Iym过滤器和Pall，Ultipor VF DV50，20〃过滤器。使用流动通过式UVivatec 处理设备(Bayer Technology Services/Sartorius Stedim)以240J/m2的UVC剂量在254nm处对滤液进行进一步的UVC光处理。使用制造商的操作说明来计算通过UVC反应器的流速。通过超滤将经照射的蛋白溶液浓缩至蛋白浓度为50g/l 70g/l，并对其进行渗滤(IOkD膜，使用O. 32M pH=4. 3的甘氨酸缓冲液)。使最终产物过滤通过O. 2 μ m过滤器，并在2°C 8°C储存。实施例2—对辛酸处理步骤中的条件的研究对于辛酸处理，使用实施例I中描述的方法检测了以下实验范围，并且还测试了其相互间的组合(结果未示出)。-辛酸量0.09kg/kg O. 13kg/kg(与每kg所用组分I/III对应的辛酸量)(I2OmM I8OmM 辛酸)-辛酸处理的pHpH4. 8 5· 3-反应的温度范围14°C 30°C-温育时间40分钟 110分钟所有经检测的条件都产生了易于澄清以用于后续处理的中间体，并且蛋白水解活性从悬浮的Cohn组分I/III中的数千U/L发生了大幅度下降。这些中间体产生了蛋白水解活性低于8U/1 (按下文实施例6所述进行计算得到)的最终产品，8U/1为定量测定的极限。实施例3—通过使用振动混合器的病毒消减一对使用和不使用振动混合器的辛酸处理确定病毒去除系数
在pH 5. 05和22°C下，对250ml悬浮的组分I/III进行30分钟的匀质。将2. 6ml病毒原液掺入上述悬浮液中。添加辛酸(110g/kg)，并使用振动混合器匀质60分钟。在平行实验中，通过标准搅拌对同样的混合物进行匀质。60分钟后，添加磷酸三钙(O. 15g/kg辛酸)，并搅拌悬浮液15分钟。通过使用滤片进行深度过滤来使悬浮液澄清。滤片用70ml 80ml缓冲液预先冲洗过。过滤后，用80ml缓冲液冲洗滤器。将滤液和洗液合并，并提取样品进行病毒滴定。在针对SV40、Reo和PPV的适合的指示细胞(CV-1、CCL. 7. I和PK13)上确定了在添加辛酸前和进行过滤后所采集的样品中的病毒效价。最后，按照目前用于病毒验证研究的准则计算出去除系数。在病毒验证研究中，诸如SV40和Reo等无包膜病毒分别以大于41og1(l和大于51og10的量级被有效去除。此外，超过31og1(l的PPV被去除。这些值比在无振动混合的标准搅拌条件下进行相同的辛酸处理时高出超过10倍至1000倍。表I :对使用及不使用振动混合器时辛酸处理的病毒消减系数(Iogltl)的比较。
权利要求
1.一种从包含免疫球蛋白的血浆组分中制备含有IgM的免疫球蛋白组合物的方法，所述方法包括 (a)提供血浆组分，作为含有免疫球蛋白的溶液； (b)将C7 C9的羧酸与所述溶液混合，并用振动搅拌器处理经混合的溶液以使污染性蛋白沉淀；和 (c)将沉淀出的蛋白从所述溶液中分离出，以产生所述含有IgM的免疫球蛋白组合物。
2.如权利要求I所述的方法，其中，在步骤(b)中所述C7 C9的羧酸的浓度为至少O. 075kg/kg血浆组分。
3.如权利要求I或2所述的方法，其中，在步骤(b)中所述经混合的溶液的pH为4.5 5.5o
4.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中所述经混合的溶液的温度为10°C 35°C。
5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在步骤(b)中将所述C7 C9的羧酸与含有免疫球蛋白的所述溶液温育至少30分钟。
6.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述C7 C9的羧酸是辛酸。
7.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述血浆组分的免疫球蛋白包含至少5% 的 IgM。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述血浆组分是Cohn组分Ι/III或者Kistler/Nitschmann 组分 B 或 B+I 的沉淀物。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中，步骤(c)包括超滤，并且所述免疫球蛋白组合物包含经过滤的溶液。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，所述方法还包括在pH3. 5 4. 5温育来自步骤(c)的所述含有IgM的免疫球蛋白组合物以形成经温育的溶液的步骤。
11.如权利要求10所述的方法，其中，温育来自步骤(c)的所述含有IgM的免疫球蛋白组合物的所述步骤在32°C 42°C进行。
12.如权利要求10或11所述的方法，所述方法还包括使所述经温育的溶液对DEAE-交联葡聚糖凝胶进行吸附的步骤，和通过深度过滤将所述DEAE-交联葡聚糖凝胶与所述溶液分尚的步骤。
13.如权利要求12所述的方法，所述方法还包括对来自所述深度过滤的滤液进行纳米过滤的步骤。
14.如权利要求13所述的方法，其中，所述纳米过滤用具有35nm 75nm标称孔径、优选具有40nm 50nm标称孔径的过滤器进行。
15.如权利要求10 14中任一项所述的方法，所述方法还包括用UVC照射对权利要求10或11中的所述经温育的溶液或者权利要求12 14中任一项中的滤液进行处理以形成经UVC照射的溶液的步骤。
16.如权利要求15所述的方法，其中，用200J/m2 500J/m2、优选200J/m2 300J/m2的UVC照射来处理所述经温育的溶液或所述滤液。
17.如权利要求15或16所述的方法，所述方法还包括在无菌条件下过滤所述经UVC照射的溶液以产生适于静脉内施用的抗体制剂的步骤。
18.如权利要求17所述的方法，所述方法还包括将所述抗体制剂配制在pH为4 5.5的含甘氨酸的缓冲液中。
19.如权利要求15 18中任一项所述的方法，所述方法还包括在无菌条件下将权利要求15或16中的所述经UVC照射的溶液或者权利要求17或18中的所述抗体制剂填充到容器中的步骤。
20.如权利要求15 19中任一项所述的方法，其中，权利要求15或16中的所述经UVC照射的溶液或者权利要求17或18中的所述抗体制剂具有低于8U/1的蛋白水解活性。
21.如权利要求15 20中任一项所述的方法，所述方法提供对无包膜病毒的大于31og10的去除。
22.—种抗体制剂，所述抗体制剂包含能够用权利要求17 21中任一项所述的方法获得的免疫球蛋白。
23.—种适合于人类静脉内施用的抗体制剂,所述抗体制剂包含免疫球蛋白IgG、IgA和IgM，具有低于8U/1的蛋白水解活性，并且其中总免疫球蛋白的至少5%是IgM。
24.如权利要求23所述的含有IgM的抗体制剂，所述抗体制剂在2°C 8°C储存时稳定至少2年。
25.如权利要求22 24中任一项所述的抗体制剂，其中，所述制剂含有至少15%的IgM。
26.如权利要求25所述的抗体制剂，其中，所述制剂含有至少20%的IgM。
27.如权利要求26所述的抗体制剂，其中，所述制剂含有20% 30%的IgM。
28.如权利要求22 27中任一项所述的抗体制剂，所述制剂还包含稳定剂。
29.如权利要求28所述的抗体制剂，其中，所述稳定剂是甘氨酸。
30.如权利要求22 29中任一项所述的抗体制剂，其中，所述免疫球蛋白未受到化学修饰。
31.一种含有IgM的免疫球蛋白组合物，所述免疫球蛋白组合物能够通过权利要求I 9中任一项所述的方法获得。
32.如权利要求22 30中任一项所述的抗体制剂，所述抗体制剂用于医药应用。
33.如权利要求32所述的抗体制剂，所述抗体制剂用于治疗免疫紊乱性疾病和细菌感染。
34.如权利要求33所述的抗体制剂，其中，所述免疫紊乱性疾病是IgM缺陷疾病。
35.权利要求22 30中任一项所述的抗体制剂在制造用于治疗免疫紊乱性疾病和细菌感染的药物中的应用。
36.一种患者的治疗方法，所述治疗方法包括施用权利要求22 30中任一项所述的抗体制剂。
37.如权利要求36所述的治疗方法，其中，所述患者患有免疫紊乱性疾病或细菌感染。
全文摘要
本发明提供一种从包含免疫球蛋白的血浆中制备免疫球蛋白组合物的方法，以及用该方法制得的抗体制剂。
文档编号A61L2/10GK102939111SQ201180029338
公开日2013年2月20日 申请日期2011年4月21日 优先权日2010年4月22日
发明者W·莫勒尔, D·鲁德尼克, O·曼尼格, M·罗德梅尔, H·德切特穆勒尔, E·费尔切塞格 申请人:生物测试股份公司