用于治疗神经疾病的人抗体及其诊断和治疗用途
【专利摘要】提供能够结合并识别CNS中的神经元并引起CNS神经元反应的特异性结合成员、特别是人抗体、特别是重组抗体及其片段。所述抗体可用于神经保护和与神经损害、损伤或变性有关的病况和神经变性疾病的诊断和治疗。本发明的抗体、其可变区或其CDR结构域序列及其片段还可用于与化学疗法、免疫调节剂或神经活性剂和/或与其它抗体或其片段的联合疗法。抗体通过本文提供其序列的抗体IgM12和IgM42举例说明。
【专利说明】用于治疗神经疾病的人抗体及其诊断和治疗用途
[0001]政府支持声明
[0002]本文所述发明全部或部分受国立卫生研究院(National Institutes of Health)(资助号 ROl NS 24180,ROl NS 32129,ROl CA104996、R01CA096859)及全国多发性硬化协会(National Multiple Sclerosis Society)(资助号 CA 1011 A8-3)的支持。美国政府在本发明中享有一定权利。
发明领域
[0003]本发明涉及能够结合并识别CNS中的神经元并能够引起CNS神经元反应的抗体，特别是人天然抗体、来源天然抗体的重组抗体及其片段。这些抗体可用于诊断和治疗与神经损害、损伤或变性有关的病况、神经变性疾病、慢性神经损伤或损害和突发性神经损伤或损害。本发明的抗体、其可变区或其CDR结构域序列及其片段还可用于与化学疗法、免疫调节剂或神经活性剂和/或与其它抗体或其片段组合的疗法中。本发明总的来说涉及中枢神经系统中的神经生长的调节，更具体地说涉及用于改善CNS神经生长的方法和相关作用齐U、构建体和组合物。
发明背景
[0004]神经再生是指神经组织、细胞或细胞产物的再生长或修复。这类机制可包括髓鞘再生、新的神经元、神经胶质、轴突、髓磷脂或突触的产生。神经再生因所涉及的两种功能机制以及再生程度和速度而在周围神经系统(PNS)和中枢神经系统(CNS)间有所不同。
[0005]在损伤后成熟哺 乳动物中枢神经系统(CNS)中的轴突再生非常有限。因此，在脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤、中风和涉及轴突断裂的相关病况之后功能缺陷持续存在。这种情形不同于哺乳动物周围神经系统(PNS)中的情况，周围神经系统中长距离轴突再生和实质性功能恢复可发生在成体中。神经元的胞外分子和内在生长能力两者影响再生的成功。
[0006]成年哺乳动物中，中枢神经系统(CNS)轴突在损伤后不会自发地再生。相比之下，周围神经系统(PNS)轴突容易再生，允许在周围神经损害后恢复功能。Aguayo与同事证实，至少一些成熟CNS神经元当提供有允许的周围神经移植物时保持再生的能力(Richardson PM,McGuinness UM,Aguayo AJ (1980)Nature 284:264-265 ;Richardson PM,Issa VM,Aguayo AJ(1984)J Neurocytol 13:165-182 ;David S,Aguayo AJ(1981)Science214:931-933 ；Benfey M, Aguayo AJ(1982)Nature 296:150-152)。该研究表明对于轴突生长，PNS环境是刺激性的和/或CNS环境是抑制性的。随后的研究鉴定出PNS中的生长促进因子和CNS中的生长抑制因子两者。再生的抑制剂包括CNS髓磷脂中的特定蛋白质和与星形胶质瘢痕有关的分子。另外，CNS中相对于PNS的较慢的碎片清除可妨碍轴突再生。了解影响轴突生长的因素对开发促进CNS再生的治疗剂至关重要。
[0007]在周围神经损伤后，轴突容易再生。与胞体断开的轴突的远端部分进行沃勒变性。这种活性过程导致轴突断裂和分解。碎片被神经胶质细胞(主要为巨噬细胞)除去。近端轴突然后可再生，并且使其目标重新受神经支配，使得功能恢复。
[0008]CNS再生抑制剂的两个主要类别是髓磷脂相关抑制剂(MAI)和硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPG)。这些分子限制轴突再生，并且通过干扰其功能，在成体CNS中实现某种程度的生长。细胞自主性因子也是CNS再生失败的重要决定因素。CNS神经元不会增量调节生长相关基因至与PNS神经元相同的程度。因此甚至在没有抑制剂时，其再生能力也受到限制。提高神经元的内在生长能力允许CNS内适度的轴突再生(Bomze HM等(2001)NatNeurosci4:38-43 ；NeumannS, WoolfCJ (1999) Neuron23:83-91)。
[0009]作为CNS髓磷脂的组分，MAI是由少突胶质细胞表达的蛋白质。MAI体外削弱神经突增生，被认为在CNS损伤后体内限制轴突生长。MAI包括Nogo-A(Chen MS等(2000)Nature403:434-439 ;GrandPreT 等(2000)Nature 403:439-44)、髓憐脂相关糖蛋白(MAG)(McKerracher L 等(1994) Neuron 13:805-811)、少突胶质细胞髓憐脂糖蛋白(OMgp)(Kottis V 等(2002) J Neurochem82:1566-1569)、肝配蛋白-B3 (Benson MD 等(2005) ProcNat Acad Sci USA102:10694-10699)和脑信号蛋白 4D(Sema4D) (Moreau-FauvarqueC 等(2003) JNeurosci23:9229-9239)。这些中的 3 种(Nogo_A、MAG 和 OMgp)与神经元 Nogo-66受体I(NgRl)相互作用从而限制轴突生长。这3种在结构上不相关的配体还对第二种轴突生长抑制性受体(配对免疫球蛋白样受体B(PirB))显示亲和力(Atwal JK等(2008)Science322:967-970)。
[0010]已鉴定出几种识别分子，其充当构成促进和/或抑制神经突生长的基础的分子线索。在神经突增生促进性识别分子中，神经细胞粘附分子LI在介导神经突增生中起突出作用(Schachner M (1990) Seminars in the Neurosciences2:497-507)。LI 依赖性神经突增生受嗜同性(homophilic)相互作用介导。LI促进表达LI的神经突和施万细胞及LI转染的成纤维细胞中的神经突增生(B ixby 等(1982) Proc Natl Acad.Sc1.U.S.A.84:2555-2559 ；Chang 等(1987) JCell Biol 104:355-362 ;Lagenaur 等(1987)Proc Natl Acad SciUSA84:7753-7757 ;Seilheimer 等(1988)J Cell Bioll07:341_351;Kadmon 等(1990)JCell BiolllO:193-208 ;Williams 等(1992)J Cell Biol 119:883-892)。
[0011]神经系统损伤每年影响90，000多人，如果包括脑血管事件例如中风，则人数大更多。据估计，仅脊髓损伤每年就影响10，000人。由于神经损伤这种高的发生率，神经再生和修复(神经组织工程学的分支学科)，正成为致力于发现损伤后恢复神经功能的新方法的快速发展的领域。神经系统被分成两部分:由脑和脊髓组成的中枢神经系统及由脑神经和脊神经连同其相关神经节组成的周围神经系统。虽然周围神经系统具有修复和再生的内在能力，但是相比之下，且就绝大多数而言，中枢神经系统在其自我修复和再生能力方面受到限制。目前还没有可接受并获得批准的在中枢神经系统损伤后恢复人神经功能的治疗法。
[0012]在脊髓损伤(SCI)后，轴突保护和修复作为防止运动神经元损失和永久失能的有效策略仍具有巨大潜力。使用防止损害和促进损伤后轴突修复的靶向营养因子已实现了神经元保护。这些分子主要采用基于体外系统(其集中于靶向特异性小分子神经营养因子)的选择策略而鉴定。虽然这些分子在临床前模型中显示神经保护结果，但是临床试验的结果不太有利。
[0013]使用损伤和疾病的多个模型，证实了天然自体反应性单克隆抗体在CNS细胞中的有益生物功能。使用小鼠单克隆IgM，IN-1，体内证实了神经元存活、轴突再生和功能恢复的抗体介导的促进(Bregman BS 等(1995) Nature378 (6556): 498-501 ；Caroni P, SchwabME(1988)Neuron I (I):85-96)。在CNS损伤前使用脊髓匀浆物(SCH)免疫，获得类似结果(Ellezam B, Bertrand J, Dergham P, McKerracher L(2003)Neurobiol Disl2 (I):1-10 ；Huang DW 等(1999)Neuron24(3):639-647)。
[0014]多发性硬化(MS)是一种慢性、频繁进行性、炎性中枢神经系统(CNS)疾病，其病理学特征在于原发性脱髓鞘，通常没有最初的轴突损伤。MS的病因和发病机制未知。MS的几个免疫学特征及其与某些主要组织相容性复合体等位基因适度相关，引起了 MS是免疫介导的疾病的推测。自身免疫假设得到实验性自身免疫(变应性)脑脊髓炎(EAE)模型的支持，其中将某些髓磷脂组分注射给遗传易感动物导致T细胞介导的CNS脱髓鞘。然而，在MS患者的CNS中未明确鉴定出特异性自身抗原和致病性髓磷脂反应性T细胞，MS也不与其它自身免疫疾病有关。基于流行病学数据的备择假设是环境因素，或许是未鉴定的病毒促成了 CNS中的炎症反应，其导致直接或间接(“旁路对象(bystander)”)的髓磷脂破坏，可能伴有受诱导的自身免疫组分。这种假设得到以下证据的支持:在人和动物两者中若干天然存在的病毒感染可引起脱髓鞘。一个普遍应用的实验性病毒模型由泰勒氏(Theiler's)鼠脑脊髓炎病毒(TMEV)诱导(Dal Canto, M.C.和 Lipton, H.L., Am.J.Path.，88:497-500(1977))。
[0015]MS和其它脱髓鞘或神经变性疾病的现有疗法的有限功效激起了对改善这些疾病的新疗法的兴趣。然而，由于这些疾病显然复杂的发病机理，可能涉及环境和自身免疫两种因素，因此仍存在对这些脱髓鞘病症有效治疗的需要。
[0016]在MS的情况下，脱髓鞘最终导致神经细胞死亡。然而，脱髓鞘后的轴突死亡不是即时的。如果提供合适的支持分子或细胞，神经系统则具有明显的修复能力。保护CNS的轴突有希望成为限制存活轴突的丧失和防止永久失能的有效策略。可通过调节损伤中的潜在神经毒性炎性环境来实现神经保护。正在研究设计以限制兴奋性毒性、抑制一氧化氮或阻断离 子通道的试剂作为保护处于危险中的轴突的方法(Pitt，D.，P.Werner 和 C.S.Raine(2000)Nat Med6:67-70 ;0kuda，Y 等(1997)Journal ofneuroimmunology73:107-116 ；ffaxman, S.G.(2002) J Rehabil Res Dev39:233-242)。这些试剂中的许多是具有已经证实的毒性并全身作用于所有细胞的小分子。
[0017]已鉴定出人单克隆自身抗体，其在中枢神经系统中显示活性，并且与刺激髓鞘再生特别有关。将合乎需要的是，鉴定、表征和开发在CNS中具有活性且具有促进神经再生和/或保护神经元免受疾病、损伤、损害和/或死亡的能力的人单克隆抗体，特别是具有这些活性的重组抗体。本发明针对的正是该目标的完成。
[0018]本文参考文献的引用不应解释为承认所述文献是本发明的现有技术。
[0019]发明概述
[0020]本发明涉及在CNS中具有特定有效性的神经调节剂，所述调节剂包含选自IgM亚型的抗体、其活性片段、其单体、其激动剂及其组合的物质。本发明的神经调节剂或抗体具有以下一个或多个特征:它们保护和/或稳定神经元；它们靶向CNS或神经细胞损害、受损(compromise)或损伤的部位；它们减少或阻止细胞死亡，例如过氧化氢诱导的细胞死亡。
[0021]本发明提供神经元结合单克隆抗体，其具有促进神经突延伸、在神经再生中起作用和/或保护神经元免受损害以用于中枢神经系统的诊断和治疗目的的能力。具体地讲，提供特异性重组抗体，其中所述抗体识别并能够结合神经元，包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞。本文提供重组完全人抗体。本发明的抗体在与神经受损、损害或损伤有关的病况或疾病中具有诊断和治疗用途。
[0022]从总体方面来看，本发明提供针对或能够结合神经元上的一个或多个表位的抗体，所述神经元包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞。从大的方面来看，本发明提供分离的特异性结合成员(binding member),特别是抗体或其片段，包括识别、结合和/或靶向神经元的重组人抗体。本发明提供特异性结合神经元和保护神经元免于细胞死亡并且不会促进髓鞘再生的抗体，特别是人抗体，特别是IgM抗体。本发明的抗体应用于治疗或改善其中神经受损、损伤或损害或处于受损、损伤或损害风险的哺乳动物的疾病或病况，包括应用于脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤(TBI)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发 性硬化(MS)、阿尔茨海默病(Alzheimer’ s disease)、中风、帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷顿舞蹈病(Huntington’s disease)、产前缺氧/围产期缺血、大脑性麻痹、脑病、脊髓病或运动神经元疾病，并且特别应用于神经元和这些疾病中神经能力的保护、存活或维持。在一个具体方面，本发明提供抗体或其片段，其是抗体12或42，特别是血清来源的或重组的IgM12或IgM42。
[0023]在本发明的一个方面，提供包含图5和/或图6中给出的可变区⑶R序列的重组或合成神经元结合抗体。抗体12包含图5中给出的重链⑶R序列⑶R1GGSVSLYY(SEQ IDN0:31)、CDR2GYIYSSGST(SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO:33)及轻链 CDR序列 CDRl QSISSY(SEQ ID N0:34)、CDR2 AAS (SEQ ID NO:35)和 CDR3 QQSYHTPff(SEQ IDNO:36)。抗体 42 包含图 6 中给出的重链 CDR 序列 CDRl GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37)、CDR2INVGGVTT (SEQ ID NO: 38)和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)及轻链 CDR 序列 CDRlQGIG(SEQ ID NO:40)、CDR2TTS(SEQ ID N0:41)和 CDR3QKYNSAPRT(SEQ ID NO:42) ? 因此，以本文鉴定的抗体的CDR为基础的重组抗体可用于靶向和保护神经元，特别是疾病或癌症中的易感、受损、损伤或损害的神经元。
[0024]本发明因此提供特异性结合神经元和保护神经元免于细胞死亡并且不会促进髓鞘再生的分离的人IgM抗体或其片段，其中抗体或片段包含:(a)图5给出的可变重链氨基酸 CDR 结构域序列 CDR1GGSVSLYY(SEQ ID NO:31)、CDR2GYIYSSGST(SEQ ID NO:32)CDR3 ARSASIRGWFD(SEQ ID NO:33)及轻链 CDR 序列 CDR1QSISSY(SEQ ID N0:34)、CDR2AAS(SEQ ID NO:35)和 CDR3QQSYHTPW(SEQ ID NO:36);或(b)图 6 给出的可变重链氨基酸 CDR 结构域序列 CDRl GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37)、CDR2INVGGVTT (SEQ ID NO:38)和 CDR3VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)和轻链 CDR序列 CDRl QGIG (SEQ ID NO: 40)、CDR2TTS (SEQID N0:41)和⑶R3QKYNSAPRT(SEQ ID N0:42)，以用于治疗或改善其中神经受损、损伤或损害或处于受损、损伤或损害风险的哺乳动物的疾病或病况。
[0025]在更具体的方面，本发明的抗体包含包括图5和/或图6给出的抗体12或42的氨基酸序列。本发明的重组抗体IgM12包含图5给出的可变重链序列(SEQ ID NO:1)和轻链序列(SEQ ID NO: 11)。本发明的重组抗体IgM42包含图6给出的可变重链序列(SEQ IDNO: 17)和轻链序列(SEQ ID NO:27)。在本发明的具体方面，重组抗体是包含人重链可变区、恒定区和人J链的完全人重组抗体。本文提供完全人重组IgM12抗体，其包含图5给出的人免疫球蛋白重链(包含可变区(SEQ ID NO:1)或其CDR)、人恒定区、特别是κ序列(SEQID Ν0:3、5、7 和 9)和人 J 链(SEQ ID NO: 15)。
[0026]在又一方面，本发明提供分离抗体或其能够结合抗原的片段，其中所述抗体或其片段包含含有基本如本文或图6中给出的氨基酸序列的多肽结合结构域。本发明提供能够结合神经元的分离人抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区(SEQ IDNO: 17)或其⑶R和轻链可变区(SEQ ID NO: 27)或其⑶R，或包含基本如本文或图6中给出的氨基酸序列。
[0027]在又一方面，本发明提供分离的完全人抗体或其能够结合抗原的片段，其中所述抗体或其片段包含含有基本如本文和图5中给出的氨基酸序列的多肽结合结构域。本发明提供能够结合神经元的分离的完全人抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区(SEQ ID NO:1)或其CDR及轻链可变区(SEQ ID NO: 11)或其CDR，或包含基本如本文和图5中给出的氨基酸序列。本发明特别提供分离的人IgM抗体或其活性片段，其包含图5给出的可变重链氨基酸 CDR 结构域序列 CDRl GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31)、CDR2GYIYSSGST (SEQID N0:32)和 CDR3 ARSASIRGWFD(SEQ ID NO:33)及轻链 CDR 序列 CDRl QSISSY(SEQ IDNO:34) ,CDR2AAS(SEQ ID NO:35)和 CDR3QQSYHTPW(SEQ ID NO: 36)。在一个具体方面，本发明提供分离的完全人重组IgM抗体或其活性片段，其包含可变重链氨基酸⑶R结构域序列CDRl GGSVSLYY(SEQ ID N0:31)、CDR2 GYIYSSGST(SEQ ID N0:32)和CDR3 ARSASIRGffFD(SEQID NO:33)及轻链CDR序列CDRl QSISSY(SEQ ID N0:34)、CDR2 AAS(SEQ ID N0:35)和CDR3QQSYHTPff (SEQ ID NO: 36)、人恒定区和SEQ ID NO: 15所示的人J链序列。
[0028]在其它方面，本发明提供包含编码上述神经元结合多肽或抗体的序列的分离核酸和制备本发明的多肽或抗体的方法，所述方法包括在引起所述多肽或抗体表达的条件下表达所述核酸，并回收多肽或抗体。在一个这样的方面，提供编码具有图5或图6给出的氨基酸序列的抗体可变区序列的核酸或提供具有图5或图6给出的CDR结构域序列的抗体。一方面，提供包含图5或图6的核酸序列的核酸。在又一方面，提供编码图5或图6给出的重链可变区VH或轻链可 变区VL的核酸。本发明还涉及编码本发明抗体的重组DNA分子或克隆基因或其简并变体；优选核酸分子，特别是编码抗体VH和VL、特别是CDR区序列的重组DNA分子或克隆基因，其具有图5或图6所示序列或能够编码图5或图6所示序列。在优选的方面，本发明提供编码IgM12的重链(SEQ ID NO:2)和轻链可变区序列(SEQ IDNO: 12)的核酸，以及编码IgM42的重链(SEQ ID NO: 18)和轻链可变区序列(SEQ ID NO: 28)的核酸。在本发明的一个方面，提供核酸，其编码包含可变重链氨基酸CDR结构域序列CDR1GGSVSLYY(SEQ ID NO:31)、CDR2GYIYSSGST(SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASIRGWFD(SEQID NO: 33)及轻链 CDR 序列 CDRl QSISSY(SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35)
⑶R3 QQSYHTPff(SEQ ID NO:36)的抗体或其片段。在又一方面，核酸还编码人恒定区和人J链，特别是SEQ ID N0:15的J链。在本发明的一个方面，提供核酸，其编码包含可变重链氨基酸 CDR 结构域序列 CDRl GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2INVGGVTT (SEQ ID NO: 38)和CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)及轻链 CDR 序列 CDRl QGIG (SEQ ID N0:40)、CDR2TTS (SEQ ID N0:41)和 CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO:42)的抗体或其片段。在又一方面，核酸还编码人恒定区和人J链，特别是SEQ ID NO: 15的J链。
[0029]包含本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可用于治疗、预防或诊断人或动物体的方法，例如哺乳动物中的神经保护方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的本发明的抗体、其片段和重组抗体。包含本发明的⑶R结构域序列的重组抗体或其片段可用于哺乳动物中的神经保护方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的本发明的抗体、其片段和重组抗体。
[0030]本发明的作用剂，特别是重组抗体或其片段可在预防、治疗或改善能够、可能或的确导致CNS损伤的神经损伤、损害或受损和并发症的方法中用作神经保护剂。当涉及或关联神经元的结构、功能或存活丧失(包括脑损伤或创伤、脊髓损伤(SCI)、神经损伤、头损伤、其中脑供血减少或受损的病况、脑感染性疾病、神经变性疾病)时，本发明的治疗或预防方法是可适用的。按照本发明的方法治疗、预防或改善的示例性的这类疾病或病况包括脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤(TBI)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病、中风、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、产前缺氧/围产期缺血和/或大脑性麻痹、脑病、脊髓病和运动神经元疾病。本发明因此涉及治疗或改善其中神经受损、损伤或损害或者其中神经或神经元易于受损、损伤或损害或者有受损、损伤或损害风险的哺乳动物的疾病或病况的方法，所述方法包括给予选自IgM12和IgM42的重组抗体或完全人抗体或其片段。
[0031 ] 在本发明的一个方面，在其中神经受损、损伤或损害情况的疾病或病况下或者在其中神经或神经元易于受损、损伤或损害或者有受损、损伤或损害风险的情况下，包含本发明的可变区序列的抗体、其片段和重组抗体可用于方法中或以组合物给予以改进或稳定神经功能或运动功能。在一个具体方面，抗体或其片段在疾病或病况的早期或初始阶段使用或给予，或在疾病或病况的进程或持续时间内重复，以利于或维持神经系统功能或运动功能的改进或稳定，包括或选自运动(例如步行)或认知功能(例如回忆或再认)。
[0032]本发明的方法可包括给予不止一种抗体或片段，包括抗体IgM12和42的组合。在本发明的一个方面，提供包括给予一种或多种抗体或其片段的方法，其中抗体包含(a)可变重链氨基酸 CDR 结构域序列 CDRl GGSVSLYY (SEQ ID N0:31)、CDR2 GYIYSSGST (SEQID NO:32)和 CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33)及轻链 CDR 序列 CDRl QSISSY (SEQ IDN0:34)、CDR2 AAS (SEQ I D NO: 35)和 CDR3QQSYHTPW(SEQ ID NO: 36)，或(b)可变重链氨基酸 CDR 结构域序列 CDRl GFTFSTYA (SEQ ID N0:37)、CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO:38)和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)及轻链 CDR 序列 CDRl QGIG (SEQ ID NO: 40)、CDR2 TTS (SEQ ID N0:41)和 CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO:42) ? 在又一个这类方法中，抗体IgM12和/或抗体IgM42的一种或多种可与另一种CNS活性抗体组合，特别包括抗体rHIgM22和/或rHIgM46的一种或多种。rHIgM22抗体包含SEQ ID NO:43和44所示氨基酸序列，或这些SEQ ID的⑶R。rHIgM46抗体包含SEQ ID NO:45和46所示氨基酸序列，或这些SEQ ID的⑶R。因此，抗体IgM12和/或抗体IgM42的一种或多种可与一种或多种包含以下的髓鞘再生抗体组合:(a)包含⑶Rl序列SSGMH、⑶R2序列V(I) ISYDGSRKYYADSVKG和CDR3序列GVTGSPTLDY的重链可变区CDR及包含CDRl序列SGSSSNIGNNFVS、CDR2序列DITKRPS 和 CDR3 序列 G (E) TWDSSLSAVV 的轻链可变区 CDR ;或(b)包含 CDRl 序列 SGFTFSSYW、CDR2序列IKKDGSEK和CDR3序列ARPNCGGDCYLPWYFD的重链可变区CDR及包含CDRl序列QSVLYSSNNKNY、CDR2序列YWAS和CDR3序列QQYYNTPQA的轻链可变区CDR。抗体的组合可在不同的时间和以不同的量或浓度共同或连续给予。可使用双特异性或多特异性抗体。在一个具体的这样的方面，通过联合给药或通过相隔短的持续时间或较长持续时间(包括数小时、数天或数周)的连续给药，将抗体12和/或42与抗体22和/或46和/或具有IgM22或IgM46的⑶R区⑶R1XDR2和⑶R3序列的抗体组合给予。在一个这样的具体方面，通过联合或连续给药，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合给予用于治疗或改善涉及神经变性的疾病或病况，特别包括脱髓鞘。在又一个这样的方面，通过联合或连续给药，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合给予用于治疗或改善脱髓鞘疾病或病况。在一个具体方面，通过联合或连续给药，将抗体12和/或42与抗体22和/或46组合给予用于治疗或改善多发性硬化。在一个这样的方面，在MS疾病的可测量临床方面，实现髓鞘再生和神经保护的联合作用，包括协同作用。
[0033]鉴于本发明作用剂的神经保护和/或神经变性能力，本发明还涉及产生和刺激神经元增殖的体外方法，包括皮质神经元、海马神经元、小脑颗粒细胞和视网膜神经节细胞的增殖。这类增殖的神经元可适于移植和神经细胞治疗方案和方法。
[0034]本发明的诊断效用延伸到本发明的抗体在表征CNS神经损伤或损害或者筛查或评价涉及神经损伤、损害或死亡(包括坏死性或凋亡性死亡)的疾病或病况中的测定法和方法中的用途，包括体外和体内诊断和成像测定法。在免疫测定中，可制备控制量的抗体等，并用酶、特异性结合配偶体、配体、染料、荧光标签和/或放射性元素标记抗体，然后可弓I入细胞样品中。在标记材料或其结合配偶体有机会与样品中的部位起反应后，所得质量可通过已知技术检查，这随所连接的标记的性质而变化。在体内诊断或成像应用中，可制备抗体或其神经元结合片段，并用酶、特异性结合配偶体、配体、染料、荧光标签和/或放射性元素标记所述抗体或其神经元结合片段，然后可引入动物中。在标记材料或其结合配偶体有机会与动物内的部位起反应后，可通过已知技术检查动物，这随所连接的标记的性质而变化。
[0035]放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于体外诊断技术和体内放射性成像技术。在本发明的又一个方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，特别是放射性免疫缀合物，可用于放射性免疫疗法，特别作为用于神经损伤修复、神经变性恢复、癌症或CNS肿瘤疗法的放射性标记的抗体，或在某些情况下备选地用于受损害神经组织或神经元的切 除。在体内方面，抗体或其神经元结合片段是标记的，并在手术或手术技术(包括立体定位术或最小侵入性技术)之前、期间或之后给予动物，用于定位神经损伤或评价其余受损害或受损伤的神经组织的目的。在一个这样的方面，放射性标记的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，可用于放射免疫导向手术技术，其中它们可在靶向、鉴定或除去这类细胞的手术之前、期间或之后，鉴定和表明受损、受损害、受损伤或濒死神经细胞或神经元或神经组织的存在情况和/或位置。
[0036]免疫缀合物或抗体融合蛋白包括在本发明中，其中本发明的特异性结合成员，特别是抗体及其片段，与其它分子或作用剂缀合或连接，所述其它分子或作用剂还包括但不限于与神经活性药物、化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂或药物缀合的结合成员。
[0037]本发明包括可以试验试剂盒的形式制备的测定系统用于定量分析例如受损害、受损或受损伤神经元的存在程度或定量测定样品中的神经元。系统或试验试剂盒可包括通过本文所述的放射性技术和/或酶技术之一，使标记与抗体偶联而制备的标记组分，以及一种或多种其它的免疫化学试剂，任选其中至少一种是游离或固定的组分或其结合配偶体。[0038]可在药物组合物中制备本发明的抗体，且在一个具体的实施方案中为包含本文图5和图6提供的重链和/或轻链序列的重组抗体，或其活性片段和来源于其中、特别包含图5和图6所述CDR区序列的单链、重组或合成抗体，所述药物组合物包括合适的溶媒、载体或稀释剂，用于在其中疗法是适宜的情况下给予，以例如治疗或改善涉及神经元受损、损害、损伤或死亡的病况或疾病。这类药物组合物还可包括通过本领域已知方法(例如聚乙二醇化)调节抗体或片段的半衰期的方法。这类药物组合物还可包含其它抗体或治疗剂。
[0039]本发明还包括与其它分子或作用剂共价连接或否则缔合的抗体及其片段。这些其它分子或作用剂包括但不限于具有截然不同的识别特征的分子(包括抗体或抗体片段)、毒素、配体、神经活性剂和化疗剂。另一方面，本发明的抗体或片段可用来靶向或导向治疗分子或其它作用剂，例如使分子或作用剂靶向神经元，例如靶向皮质神经元、海马神经元、视网膜神经节细胞或小脑颗粒细胞，包括伤口部位、缺血部位、肿瘤部位、炎症区域或神经变性病灶。
[0040]从接下来的参照下列说明性附图和随附权利要求书进行的详述来看，其它目的和优势对本领域技术人员而言将是显而易见的。 附图简述
[0041]图1:与多种类型的神经元表面结合的人IgM。sHIgM42(A)和rHIgM12(C)与共表达神经丝(NF) (B和D)的活的皮质神经元表面结合。在培养基中与lOyg/mllgM温育10分钟时间内，将细胞保持在冰上。将细胞固定，洗涤，用抗人μ链Fab’2-FITC第二 Ab检测人IgM。内部NF以特有的节段模式存在。使皮质细胞在聚鸟氨酸包被的盖玻片上的神经基础B27培养基中生长6天。并非所有的皮质神经元均表达NF，但是IgM与培养物中的所有神经元结合。rHIgM12(E绿色)和sHIgM42 (F绿色)与共表达神经丝(NF，红色)的活的小鼠海马神经元表面结合。使海马神经元在聚赖氨酸包被塑料上的神经基础B27培养基中生长I周。使自人颞叶切除而分离的细胞在DMEM/F12/N2/B27中生长21天。rHIgM12与也是β III微管蛋白阳性(F，得自PiOmega的抗β III)的细胞表面结合(G)。
[0042]图2.人IgM以截然不同的模式标记小脑颗粒细胞表面。使在培养I天的大鼠小脑颗粒细胞与IOy g/ml人血清来源的IgM、sHIgM12或sHIgM42在培养基中在冰上活着温育15分钟。在用4%低聚甲醛洗涤和固定后，使细胞在室温下与FITC缀合的抗人μ链抗体一起温育，并使用免疫荧光显微镜成像。使用这两种抗体的神经元膜标记的模式不同。神经突膜的短区被sHIgM12结合，导致清楚的点状模式。神经突膜的较大区被sHIgM42结合，导致节段模式。放大倍数为400x。
[0043]图3.神经元结合性人IgM、rHIgM12和sHIgM42保护培养中的皮质神经元免于过氧化物诱导的细胞死亡。培养3天的小鼠神经元用含或不含10 μ g/ml人IgM的500nMH202或盐水处理30分钟。细胞用新鲜的神经基础B27培养基洗涤，24小时后，使用FLICA胱天蛋白酶-3测定试剂盒(Immunochemistry Technologies935),检测一式三份处理的96孔中胱天蛋白酶-3的表达。条形柱表示免于胱天蛋白酶3活化的保护％。
[0044]图4表示用于产生重组抗体的可扩增载体。这是用于产生基于sHIgM22(rHIgM22)的重组抗体的载体图，该载体经修饰以产生重组IgM12和IgM42。对于在CHO细胞中表达，VH启动子用ElA启动子置换。CX轻链恒定区用K轻链恒定区C K置换。[0045]图5表示重组载体中的IgM12抗体氨基酸和核酸序列。重链氨基酸序列和编码核酸序列呈灰色，提供并标出Vh的每一个和恒定区序列CH1、CH2、CH3和CH4。轻链氨基酸序列和编码核酸序列呈紫色，标出可变VL和恒定CL(K)序列。注释了重链和轻链可变区的CDR区序列。在氨基酸和核酸序列中标示了人J链。
[0046]图6表示重组载体中的IgM42抗体氨基酸和核酸序列。重链氨基酸序列和编码核酸序列呈灰色，提供并标出Vh的每一个和恒定区序列CH1、CH2、CH3和CH4。轻链氨基酸序列和编码核酸序列呈紫色，标出了可变VL和恒定CL(K)序列两者。注释了重链和轻链可变区的⑶R区序列。
[0047]图7.重组rHIgM12改进患TMEV诱导性疾病的小鼠中的缺陷。在100 μ gsHIgM12的单一 1.p.剂量后3周，平均每小时自发性夜间活动(当小鼠有正常活动性时)改变。在TMEV感染后90天各组5只SJL小鼠用rHIgM12 (红色条形柱)或对照人IgM (黑色条形柱)治疗，在AccuScan活动监测箱中按组每周监测3天。将3个夜间时段内的每小时夜间水平活动的平均值土SEM与IgM治疗前3个夜晚的夜间活动进行比较。在单剂量的rHIgM12治疗后3周-7周存在与治疗前水平相比夜间活动增加(P〈0.01)，但用对照治疗后无增加。对未感染年龄匹配小鼠的运动水平作图用于比较(绿色条形柱)。
[0048]图8.在小鼠脑干采集的MRS光谱。上组图表示从中采集信号的三维像素。定位该目标区域使用解剖界标。极短MRI扫描用来获取3个正交平面的图像以定位脑干内的2.5mm3立方体(上组图)。小鼠脑干的300MHz，IH光谱(下组图)。容易鉴定出胆碱(Cho)、肌酸(Cr)和N-乙酰基-天冬氨酸(NAA)峰。光谱参照水(4.7ppm)。
[0049]图9.脑干NAA水平降低与轴突丧失增加有关。用TMEV感染后0_270天，对10只SJL小鼠进行了前瞻性研究。获得每只小鼠脑干的MRS，并测定NAA浓度(上)。在病毒感染后90天(通过横切面的直接计数显示大轴突丧失的点)，在达到统计显著性下降的所有小鼠中记录到NAA逐渐降低(2)。在疾病持续期间，NAA水平保持低下。未感染小鼠(黑色条形柱)、感染后90天(灰色) 和270天(白色)以T6水平统计的绝对轴突(下)。
[0050]图10.在单剂量的人IgM后脑干中的NAA。TMEV感染后90天，当NAA水平开始下降，且可检出大轴突丧失时，1.P.给予各组10-15只SJL小鼠单次100 μ g剂量的sHIgM12、sHIgM42、对照人IgM或盐水(PBS)。在治疗前和治疗后5周和10周，收集脑干的MRS。由这些光谱计算NAA水平。在sHIgMl2和sHIgM42治疗组中，与治疗前水平相比，NAA在5周后(P=0.005，P=0.029)和在10周(Ρ〈0.001，P=0.037)增加。在用对照试剂治疗的各组小鼠中是稳定的或趋于向下。该图表示脑干三维像素NAA水平的平均值+/-SEM。
[0051]图11.与神经元结合的人IgM不改变脱髓鞘、髓鞘再生或炎症。各组5只慢性TMEV感染小鼠用单次100 μ g剂量的人IgM治疗。在治疗后10周，所有组包括相同程度的脊髓炎症(黑色条形柱)和脱髓鞘(红色条形柱)。如所预期的一样，用少突胶质细胞结合性IgM、rHIgM22治疗的小鼠，显示较多髓鞘再生(绿色条形柱)。sHIgM12和sHIgM42不促进脊髓髓鞘再生。这表明体内有保护轴突的多种方式。
[0052]图12.静脉内注射后⑶-1小鼠循环中的神经元结合性人IgM的血清半衰期。夹心ELISA用来定量测定48小时内小鼠血清的人μ链的衰变。碱性磷酸酶底物(Sigmal04)的0D405平均值获自该方法。绘制每组3只小鼠的血清和标准误差。
[0053]图13.35S标记的rHIgM12进入TMEV感染和未感染SJL小鼠的脑和脊髓。将35S标记的rHIgM121.p.给予5个月TMEV感染的和年龄匹配的未感染SJL小鼠。4小时后，一对小鼠用盐水灌注，急速收获组织，称重，用剃刀切碎，并与IOml闪烁液(Ultima Gold LSC)混合。在24小时时重复相同步骤。48小时后，使组织增溶，将小瓶在Beckman闪烁计数器中计数I分钟。对每只小鼠的全脑和脊髓总计数绘图。小瓶中无组织的背景计数为12个计数。
[0054]图14.神经元结合性人IgM体内靶向脊髓病变。腹膜内给予患慢性TMEV诱导的脊髓脱髓鞘的小鼠1.0mg sHIgM42(A)、rHIgM12(B)或对照人单克隆IgM(C)。4小时后，小鼠用4%低聚甲醛灌注，取出脊髓，冷冻切片，使用针对人μ链的FITC缀合的Fab’ 2片段(Jackson Immnoresearch)免疫标记。来自接受sHIgM42或rHIgM12的小鼠的脊髓在病变中含有人IgM。病变中几乎未发现对照人IgM。下组图为Η/E染色以显现炎性细胞和病变。我们得出的结论是，在TMEV模型中某些人IgM可穿过BBB。
[0055]图15.神经元结合性人IgM定位于脊髓病变中神经丝(NF)轴突。腹膜内给予患慢性TMEV诱导的脊髓脱髓鞘的小鼠l.0mg IgM，4小时后处死。将脊髓纵向冷冻切片，用FITC缀合的抗人μ链Fab’ 2片段(绿色)和抗-NF (SM1-32和34，红色)免疫标记，接着用TRICT缀合的第二抗体免疫标记。合并的共焦图像证实sHIgM42(A)与长NF+纤维(B)共定位，在(C)中合并。rHIgM12(D，绿色)也与NF+结构(D，红色)例如横切轴突纤维束共定位。
[0056]图16.rHIgM12和sHIgM42不会使EAE临床评分变差。1.V.给予患MOG肽诱导的EAE的各组10只C57BL6小鼠单次100 μ g剂量的rHIgM12、sHIgM42、对照人IgM或盐水，在每只小鼠达到I的临床评分(尾无力)时，每隔一天进行监测直到免疫后28天。图为每个治疗组的平均临床评分的平均值+/-SEM。平均临床评分的秩ANOVA ο (ANOVA on ranks)表明组间无差异(P=0.14)。
[0057]图17.rHIgM12和sHIgM42不加重EAE脊髓病理。在图13的研究结束时，取出脊髓，切成Imm块,从每3个的连续 块中切取横切面,用erichrome染色以显现病理。不知情地对10个横切面/小鼠(40象限(quadrant))进行分级。炎症(P=0.825)或脱髓鞘(P=0.766)
在组间无差异。
[0058]图18.rHIgM12促进神经突增生
[0059]使E15海马神经元在聚-D-赖氨酸(PDL) (A)或rHIgM12 (B)硝化纤维包被的盖玻片上生长。接种(plating)细胞后12小时，将这些神经元固定，并用β3_微管蛋白抗体(Al和BI，绿色)和德克萨期红鬼笔环肽(Α2和Β2)染色。Α3-Β3是Α1-Α2和Β1-Β2的重叠，其中核用DAPI (蓝色)染色。C、D和E显示总的(C，p=0.0056)、最长(D，p〈0.0001)和次最长(E，p=0.0782)神经突长度的测量值。与具有多个对称神经突的接种在对照PDL基质上神经元相比(72%与18%)，在rHIgM12上生长的神经元带有较少神经突(F，p〈0.0001),且大多数为3期神经元(G)。统计分析显示平均值土 SEM(非配对t检验)。
[0060]图19.rHIgM12驱动轴突形成
[0061]海马神经元在接种在PDL(A)、H)L+层粘连蛋白(B)或rHIgM12(C)的基质上后12小时用Taul (Al-Cl，绿色)或MAP2(A2-C2，蓝色)染色。A3-C3是Al-Cl和2-C2的重叠，将F-肌动蛋白(红色)用德克萨期红鬼笔环肽标记。D-F显示在通过短划线标示的Al-Cl中，沿自胞体到生长锥的最长神经突的相对Taul强度。Taul染色不对称地富集在于rHIgM12和层粘连蛋白基质两者中生长的3期神经元中的最长神经突远部。
[0062]图20.rHIgM12结合识别神经元膜
[0063]在固定后，将DIV3海马神经元用rHIgM12、霍乱毒素B(CTB，Alexa Fluor 594)和非律平三重染色(A)。rHIgM12(Al)均匀地标记神经元表面，其模式类似于分别用CTB或非律平标记的GMl (A2)或胆固醇(A3)的模式。然而，用rHIgM12在37°C下处理30分钟后，膜结合的rHIgM12在神经元表面聚集(Bl-Cl)。用rHIgM12处理导致胆固醇(B2)和GMl (C2)两者的群聚，其与聚集的rHIgM12共定位(B3-C3)。B和C底部的下组图是方框标示区域的更高放大倍数，表明生长锥区中聚集的rHIgM12(绿色)与群聚的胆固醇(蓝色)或GMl (红色)共定位。
[0064]图21.rHIgM12与神经元膜微域中的GMl共定位
[0065]A.DIVl海马神经元首先用4%低聚甲醛固定，然后经rHIgM12染色。rHIgM12标记较小的点结构(punctum structure)。B.将活的DIVl海马神经元冷却到4°C达30分钟,然后用rHIgM12标记，接着用抗β-1I1-微管蛋白抗体染色(在固定后)。rHIgM12使神经元表面上大得多的点结构染 色。C.活的DIV3海马神经元用甲基-β-环糊精在37°C下处理30分钟以消耗胆固醇，然后冷却至4°C。固定的神经元然后用rHIgM12(绿色)和霍乱毒素B (红色)染色。rHIgM12与较大的点(其与由霍乱毒素B标记的GMl共定位)结合。下组图显示方框标示区域的更高放大倍数。
[0066]图22.rHIgM12与脂筏结合
[0067]使活的DIV7皮质神经元在4°C下与rHIgM12或对照IgM抗体结合30分钟。A.神经元在抗体结合后洗涤3次，在含有0.5%NP-40的缓冲液中裂解。裂解液通过在4°C下微量离心分离，上清液和沉淀两者用抗人IgM第二抗体进行印迹法。与不与神经元结合并洗掉的对照IgM抗体相比，rHIgM12在沉淀和上清液两者中均有分布。下组图显示加载等量的蛋白质的各个考马斯染色凝胶。B.在含有l%TritonX-100的缓冲液中裂解的神经元在4°C下以蔗糖梯度通过超速离心分级分离。相继针对rHIgM12、窖蛋白-1、运铁蛋白受体、β 3-微管蛋白(B3-Tub)和β-肌动蛋白，用特异性抗体对所得流分进行印迹法。rHIgM12对位于含有窖蛋白-1和β 3-微管蛋白的低密度流分。较高密度流分含有运铁蛋白受体、β 3-微管蛋白和肌动蛋白。一些rHIgM12定位于去污剂不溶性沉淀，所述沉淀主要由微管蛋白中富含的细胞骨架蛋白组成。大部分肌动蛋白进入去污剂可溶性较高密度流分。
[0068]图23.rHIgM12与微管缔合
[0069]A.首先将DIVl海马神经元在37°C下用rHIgM12处理30分钟，然后用含有4%低聚甲醛和0.l%TritonX-100的缓冲液同时固定并提取，接着针对rHIgM12 (绿色)、β 3-微管蛋白(蓝色)和F-肌动蛋白(红色)进行染色。rHIgM12结合去污剂不溶性分子，所述去污剂不溶性分子与沿神经突干(neurite shaft) (A2和4)和在生长锥中心域的束状微管共定位，但不与位于生长锥周围的F-肌动蛋白共定位(A3和4)。B.使DIV7皮质神经元先结合rHIgM12，然后在0.5%NP-40中裂解。对上清液进行免疫共沉淀。rHIgM12和β 3-微管蛋白两者彼此免疫共沉淀。
[0070]图24.提出的rHIgM12促进轴突形成的机制
[0071]A.神经元膜含有後微域(raft microdomain)和非後微域(nonraftmicrodomain)两种。在神经元膜均匀分布的筏微域分隔成两个库。它们之一与微管缔合。B.rHIgM12的结合诱导筏微域群聚，这促进了微管稳定并锚定神经元膜。C.在神经突增生期间，通过与rHIgM12相互作用，生长锥探测环境，而筏微域群聚。结果，微管稳定于rHIgM12接触部位并锚定神经元膜，这促进图3和图6中观察的生长锥周围至中心域转换，其中施用bath的rHIgM12在生长锥中心域聚集。
[0072]图25.rHIgM12不与微管蛋白直接缔合
[0073]A.N2A成神经细胞瘤细胞用rHIgM12(Al，绿色)和β3_微管蛋白(Α2，红色)染色。核用DAPI (A3，蓝色)标记。Ν2Α细胞是rHIgM12染色阴性的，但表达β3-微管蛋白。B.将Ν2Α细胞裂解液的上清液与rHIgM12 —起温育，与rHIgM12缔合的分子被蛋白质-L琼脂糖拉下(pulled down),并进行蛋白质印迹法。rHIgM12不与沉淀缔合。β3_微管蛋白不被rHIgM12拉下，但在上清液中检出。
[0074]图26.rHIgM12拉下肌动蛋白，但不与F-肌动蛋白共定位
[0075]A.在固定后，先将DIVl活的海马神经元在4°C下用rHIgM12(Al，绿色)染色，将F-肌动蛋白(A2，红色)用德克萨期红鬼笔环肽标记。在生长锥区，F-肌动蛋白收缩，且在中心域富集，而rHIgM12使生长锥表面上点结构均匀染色，这就标记了生长锥的最边缘。B.少量肌动蛋白被rHIgM12拉下，3种所测的抗肌动蛋白抗体无一在免疫沉淀反应中起作用。位于与β 3-微管蛋白类似位置的条带是用空心箭头标示的IgG重链。
[0076]图27 (a)细胞膜将在有数千纳米孔(大小为200nm)穿孔的薄金膜上重构。(b)悬浮金膜与两侧的缓冲溶液接触。
[0077]图28.与神经元结合的人抗体促进神经突延伸。将神经元接种在用人IgM包被的基质上，使之生长24小时后，用抗神经丝进行免疫标记。与非许可性人IgM(B)相比，sHIgM42诱导增生(A)。
[0078]图29.与神经元结合的人抗体使膜域群聚。在(TC下进行体细胞(soma)和轴突上的均匀免疫标记(A)。当细胞升温至15°C达15分钟时，sHIgM42定位在轴突细胞表面上更多的分散斑块上(B)。
[0079]图30.促进神经突延伸的人抗体体内靶向损伤部位。将抗体1.p.给予患有慢性SCI的小鼠，4小时后取出脊髓，在脊髓横切面中检测人IgM。来自给予抗体的小鼠的脊髓受损区显示结合带荧光标签的抗人IgM的平行纤维(A)。来自给予对照人IgM的小鼠的脊髓受损区不含人IgM(B)。
[0080]图31.脊髓挤压伤。显微照片显示来自对照小鼠(A)或SgFejota夹压迫后30天小鼠(B)的H&E染色脊髓的典型外观。压伤与广泛炎性细胞浸润、运动神经元丧失有关。
[0081]图32.TMEV感染小鼠自发性夜间活动的实例。A)在64天时间内水平活动原始完整记录。多夜间活动和少昼间活动易于理解。因为小鼠正常在夜间活动，因此我们选择夜间活动用于分析^PM-6AM)。然而，通过目视检查水平(B)或垂直(C)活动中的未过滤压缩记录，可能难以鉴定真实的长期改变。
[0082]图33.单次1.p.剂量的神经元结合抗体(rHIgM12)改善慢性感染SJL小鼠的水平活动。在90dpi将3组(5只SJL小鼠)放入AccuScan活动监测箱。在8天时间内收集基线测量。在治疗后，在8周内连接监测小鼠。组图A、C和E相当于水平活动，B、D和F相当于垂直活动。A、B)作为每天的箱(bins)提供的平均夜间活动，表明仅在rHIgM12治疗组的水平活动有改善；C)高斯滤波(GB=2天)和E)标准化Z值的6阶多项式拟合得出rHIgM12治疗小鼠中清楚明显的改善。B、D和F)垂直活动不受任何治疗影响。活动(垂直标度)是每小时光束中断次数。参数GB可解释为半高时滤波器半宽的值(单位:天)。随着GB值增加，标准差降低。给出每天的逐点95%置信带。
[0083]图34.通过使用预测模型值在90dpi进行3种治疗的比较。在治疗之前和之后每天进行统计分析。与对照IgM治疗和盐水治疗小鼠相比,在治疗后第7天(p=0.045)和第11天(p=0.042)，rHIgM12治疗小鼠的水平夜间活动分别显著偏离/改善(用黑色箭头标示)。给出每天的逐点95%置信带。
[0084]图35.当在疾病早期给予时rHIgM12改善SJL小鼠的水平和垂直两种活动。在45dpi将5只SJL小鼠3组放置在AccuScan活动监测箱中。在8天时间内收集基线测量。在治疗后，在8周内连接监测小鼠。组图A、C、E和G相当于水平活动，B、D、F和H相当于垂直活动。A、B)水平和垂直活动的原始未滤过记录；C、D)作为每天的箱(bins)提供的平均夜间活动；E、F)高斯滤波(GB=2天)；和G、H)标准化Z值的6阶多项式拟合显示rHIgM12治疗组中水平和垂直两种活动皆改善。对照IgM治疗组和盐水治疗组显示整个研究中运动活动水平相似。给出每天的逐点95%置信带。
[0085]图36.通过使用预测模型值在45dpi进行3种治疗的比较。在治疗之前和之后每天进行统计分析。A、C)与对照IgM治疗和盐水治疗小鼠相比，治疗后第13天(p=0.015)和第9天(p=0.036)，rHIgM12治疗小鼠的水平夜间活动分别显著偏离。B、D)治疗后第14天(p=0.019)和第6天(p=0.037)，rHIgM12治疗小鼠的垂直(直立)活动分别偏离/改善。黑色箭头表示开始显著改善的日期。给出每天的逐点95%置信带。
[0086]图37.正常未感染SJL小鼠具有不受任何治疗影响的高度可变的自发活动。将5只未感染SJL小鼠3组放入AccuScan活动监测箱。在8天时间内收集基线测量。在治疗后，在8周内连接监测小鼠。任何治疗都不引起水平(A、C、E和G)或垂直(B、D、F和H)活动改变。给出每天的逐点95%置信带。
[0087]图38.单剂量的人抗体延长S0D1G86R突变型转基因小鼠的存活。在55日龄时，小鼠用单剂量的rHIgM12或PBS治疗。一些小鼠则未治疗。跟踪小鼠直到漸死，然后处死用于病理学。一些小鼠死于疾病。所有小鼠在死亡前都有极度的体重减轻。使用Kaplan-Meir曲线绘制存活率，使用非参数Mantel-Cox检验确定统计显著性。与PBS治疗或未治疗小鼠相比，用rHIgM12治疗的小鼠中存活率提高，P=0.008。所有分析和治疗以不知情方式进行，使得做出处死小鼠决定的研究人员不了解治疗组。在该分析中研究了共45只小鼠。同窝野生型SOD+/+小鼠具有正常的存活率且无体重减轻(数据未显示)。
[0088]图39表示在50日龄时给予单次200 μ g剂量的rHIgM12的小鼠与给予PBS的对照小鼠中，G86R SODl小鼠的体重减轻随时间而变化。给予rHIgM12的小鼠显示在单次抗体注射后，在60天时间内较少体重减轻。
[0089]图40.S0D1G86R突变型转基因小鼠中单剂量的人抗体减少脊髓轴突变性。在55日龄时，小鼠用单次250μ g剂量的rHIgM12或PBS治疗。一些小鼠则未治疗。在位于胸正中水平的脊髓中，统计变性轴突特有的髓磷脂螺环(whorl)的数目。与PBS治疗(P=0.003，T检验)和未治疗小鼠相比，用rHIgM12治疗的SODl突变型小鼠的变性轴突数减少。注意，与SODl+/+突变体小鼠相比，野生型SOD-/-小鼠脊髓中的变性轴突数最少。在处死时，小鼠用Trump固定液(4%甲醒,0.1%戍二醒(gluataraldehyde))灌注,将脊髓切成Imm块。将骨髓块包埋在Araldite塑料中，来自T6水平的I微米切片用对苯二胺染色以显现髓磷脂环绕(wrapping)。显示野生型SOD-/-(右上)和SODl+/+突变型(右下)的脊髓切片。
[0090]图41.单剂量的人抗体保护S0D1G86R突变型转基因小鼠脊髓中的前角和后角神经元两者。在55日龄时，小鼠用rHIgM12或PBS治疗。一些小鼠则未治疗。在胸中正水平处脊髓的石蜡切片中，统计用特异性标记神经元的抗NeuN抗体染色的前角和后角细胞数目。rHIgM12治疗小鼠中前角和后角细胞的数目比用PBS治疗的小鼠或未治疗小鼠显著较多(P=0.0025和P=0.018，通过T检验)。用rHgM12治疗的SOD突变体小鼠的前角和后角细胞的数目与野生型SOD-/-小鼠中观察到的数目类似。
[0091]图42.重组人抗体rHIgM12与各物种的神经元结合。
[0092]小鼠皮质神经元(A、B、C、D)、小鼠海马神经元(E、F)和人皮质神经元(G、H)用rHIgM12(A、C、E和G)活染，相同细胞用抗神经丝抗体(B、D)或β微管蛋白(F、G)共标记。rHIgM12用带荧光标签的第二抗体检测。
[0093]发明详沭
[0094]按照本发明，可采用技术人员所掌握的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这类技术在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等，"Molecular Cloning:ALaboratory Manual"(1989) ;〃Current Protocols in Molecular Biology^ 第 1-1II卷[Ausube I, R.M.主编(1994)] ;"Cell Biology:A Laboratory Handbook"第 1-1II 卷[J.E.Celis 主编(1994)) ] ,Current Protocols in Immunology〃第 1-1II 卷[Coligan, J.E.主编(1994)] ;"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait 主编.1984) ,NucleicAcid Hybridization^[B.D.Hames 和 S.J.Higgins 主编(1985)] ,Transcription AndTranslation"[B.D.Hames 和 S.J.Higgins 主编(1984)] ;"Animal Cell Culture^[R.1.Freshney 主编(1986)] !"Immobilized Cells And Enzymes"[IRLPress, (1986)]；B.Perbal, 〃APractical Guide To Molecular Cloning"(1984)。
[0095]因此，下列术语如果在本文中出现，则将具有如下给出的定义。
[0096]A.术语
[0097]术语“特异性结合成员”描述了彼此具有结合特异性的一对分子的成员。特异性结合对的成员可以是天然来源的或者完全或部分合成产生的。该分子对的一个成员在其表面上具有区域或腔，或其表面上具有组分，与分子对的另一个成员的特定空间和极性组构特异性结合，因此与分子对的另一个成员的特定空间和极性组构互补。因此该对的成员具有彼此特异性结合的性质。特异性结合对的类型的实例为抗原-抗体、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受体、受体-配体、酶-底物。本申请涉及抗原-抗体型反应。
[0098]术语“抗体”描述了不管是天然的还是部分或完全合成产生的免疫球蛋白。该术语还涵盖具有结合结构域的任何多肽或蛋白质，所述结合结构域是抗体结合结构域或与抗体结合结构域同源。该术语还考虑CDR移植抗体。“抗体”是任何免疫球蛋白，包括结合特定表位的抗体及其片段。该术语包括多克隆、单克隆和嵌合抗体，最后提及的更详细描述于美国专利号4，816，397和4，816，567。该术语“抗体”包括野生型免疫球蛋白(Ig)分子，一般包含4条全长多肽链，2条重(H)链和2条轻(L)链，或其等同的Ig同源物(例如只包含重链的骆骑(cameI id)纳米抗体)；包括其保持Ig分子的基本表位结合特征的全长功能性突变体、变体或衍生物，并且包括双重特异性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体和双重可变结构域抗体；免疫球蛋白分子可为任何类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亚类(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)。还包括在术语“抗体”含义内的有任何“抗体片段”。
[0099]“抗体片段”意指包含至少一个不是全长的多肽链的分子，包括(i)Fab片段，其是由可变轻链(VL)、可变重链(VH)、恒定轻链(CL)和恒定重链I(CHl)结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，其是包含在铰链区通过二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)Fab (Fd)片段的重链部分，其由VH和CHl结构域组成；(iv)可变片段(Fv)片段，其由抗体单臂的VL和VH结构域组成，(V)结构域抗体(dAb)片段，其包含单一可变结构域(Ward, E.S.等，Nature341, 544-546 (1989)) ； (vi)骆马它抗体；(vii)分离的互补决定区(OTR) ; (viii)其中VH结构域和VL结构域通过肽接头连接的单链Fv片段，所述接头允许两个结构域缔合形成抗原结合部位(Bird等，Science, 242,423-426,1988 ；Huston等，PNASUSA，85，5879-5883，1988) ； (ix)双链抗体，其是二价双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单一多肽链上表达，但是使用太短的接头使得在相同链上的两个结构域之间无法配对，从而迫使结构域与另一条链的互补性结构域配对，并产生两个抗原结合部位(W094/13804 ；P.Holliger 等 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA906444-6448，(1993));和(x)线性抗体，其包含串联Fv区段对(VH-CH1-VH-CH1)，它与互补性轻链多肽一起形成抗原结合区对；(xi)多价抗体片段(scFv 二聚体、三聚体和/或四聚体(Power和Hudson, JImmunol.Methods242:193-2049(2000));以及(xii)单独或以任何组合的重链和/或轻链的其它非全长部分或其突变体、变体或衍生物。
[0100]因为抗体可以多种方式修饰，因此术语“抗体”应解释为涵盖任何特异性结合成员或具备具有所需特异性的结合结构域的物质。因此，该术语涵盖抗体片段、衍生物、抗体的功能性等同物和同源物，包括包含不论是天然还是完全或部分合成的免疫球蛋白结合结构域的任何多肽。因此包括包含与另一多肽融合的免疫球蛋白结合结构域或等同物的嵌合分子。嵌合抗体的克隆和表达描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023和美国专利号4，816，397和 4，816，567。
[0101]“抗体结合部位” 是由轻链或重链和特异性结合抗原的轻链可变区和超变区构成的抗体分子的结构部分。
[0102]本文所用的呈其不同语法形式的短语“抗体分子”考虑完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分两者。
[0103]示例性的抗体分子是完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和含有抗原互补位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本领域已知的那些部分，如Fab、Fab’、F(ab’ )2和F(v)，所述部分优选用于本文所述治疗方法。
[0104]抗体还可以是双特异性的，其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合成员，另一个结合结构域具有不同的特异性，例如募集效应子功能等。本发明的双特异性抗体包括其中抗体的一个结合结构域是本发明的特异性结合成员(包括其片段)，另一个结合结构域是截然不同的抗体或其片段，包括截然不同的抗癌或抗肿瘤特异性抗体的结合结构域。另一个结合结构域可以是识别或靶向特定细胞类型的抗体，如神经或神经胶质细胞特异性抗体。在本发明的双特异性抗体中，本发明抗体的一个结合结构域可与识别特定细胞受体和/或以特定方式调节细胞的其它结合结构域或分子结合，所述其它结合结构域或分子例如免疫调节剂(例如白介素)、生长调节剂或细胞因子(例如肿瘤坏死因子(TNF)，特别是2002年2月13日提交的U.S.S.N.60/355, 838所示TNF双特异性形式，该文献以其整体结合到本文中)或毒素(例如蓖麻毒蛋白)或抗有丝分裂剂或抗凋亡剂或因子。因此，本发明的抗FAP抗体可用来使作用剂、标记、其它分子或化合物或抗体导向或靶向间质部位，特别是伤口愈合、炎症、癌症或肿瘤的区域。
[0105]呈其不同语法形式的短语“单克隆抗体”是指只具有一种能够与特定抗原进行免疫反应的抗体结合部位的抗体。因此单克隆抗体通常对与之起免疫反应的任何抗原显示单一结合亲和力。单克隆抗体还可含有具有多个抗体结合部位的抗体分子，其对不同的抗原各有免疫特异性；例如双特异性(嵌合)单克隆抗体。
[0106]术语“抗原结合结构域”描述了包含与抗原的部分或全部特异性结合和互补的区域的抗体部分。如果抗原大，则抗体可只与抗原的特定部分结合，该部分称为表位。可通过一个或多个抗体可变结构域提供抗原结合结构域。优选抗原结合结构域包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)。
[0107]本发明的免疫缀合物或抗体融合蛋白(其中用于本发明的抗体、抗体分子或其片段与其它分子或作用剂缀合或连接)还包括但不限于与以下缀合的这类抗体、分子或片段:化学消融剂、毒素、免疫调节剂、细胞因子、细胞毒性剂、化疗剂、抗微生物剂或肽、细胞壁和/或细胞膜破碎剂或药物。
[0108]术语“特异性”可用来指其中特异性结合对的一个成员对不是其特异性结合配偶体的分子将不显示任何明显结合的情形。在例如抗原结合结构域对多种抗原携带的特定表位有特异性时，该术语同样适用，在此情况下携带抗原结合结构域的特异性结合成员将能够与携带所述表位的各种抗原结合。
[0109]术语“包含”一般以包括的含义使用，也就是说允许一种或多种特征或组分存在。
[0110]术语“基本由… …组成”是指不与较大产物共价连接的限定残基数的产物，特别是肽序列。然而，在上述本发明的肽的情况下，本领域技术人员应了解，可考虑肽的N端或C端的少量修饰，例如添加保护基等的末端化学修饰，例如C端的酰胺化。
[0111]术语“分离的”是指其中本发明的特异性结合成员或编码这类结合成员的核酸按照本发明可呈现的状态。成员和核酸将不含或基本不含它们与之天然缔合的物质，例如它们与之存在于其天然环境或其中制备它们的环境(例如细胞培养)(当这类制备通过体外或体内实施的重组DNA技术时)中的其它多肽或核酸。成员和核酸可用稀释剂或辅助剂配制，并且仍用于待分离的实际目的——例如如果用来包被微量滴定板，成员通常将与明胶或其它载体混合以用于免疫测定法，或当用于诊断或治疗时，将与药学上可接受的载体或稀释剂混合。
[0112]本文所用“pg”意指皮克，“ng”意指毫微克，“ug”或“ μ g”意指微克，“mg”意指毫克，“ul ”或“ μ I ”意指微升，“ml ”意指意指毫升，“ I ”意指升。
[0113]本文可使用术语“抗体”、“神经元结合性抗体”、“IgM12抗体”、“IgM42抗体”、“抗体 12”、“抗体 42”、“ sHIgMl2”、“ sHIgM42”、“rHIgMl2”、“rHIgM42” 和未特别列出的任何变体，并且如整个本申请和权利要求书所用的是指蛋白质性物质，包括单一蛋白质或多种蛋白质，并延伸至具有本文所述和图5和图6提供的氨基酸序列数据及本文和权利要求书中给出的活性概况的蛋白质。特别是IgM12抗体、抗体12、rHI gMl 2具体是指包含图5所示序列的多肽或抗体或片段，特别是重组抗体或片段。IgM12抗体、抗体12、rHIgM12具体是指包含SEQIDNO:31-33所示重链可变区CDR序列和SEQIDN0:34-36所示轻链可变区CDR序列的多肽或抗体或片段，特别是重组抗体或片段。IgM12抗体、抗体12、rHI gMl 2包括具有SEQIDN0:1的重链可变区序列和SEQIDNO: 11的轻链可变区序列的抗体。特别是IgM42抗体、抗体42、rHIgM42具体是指包含图6所示序列的多肽或抗体或片段，特别是重组抗体或片段。IgM42抗体、抗体42、rHIgM42具体是指包含SEQIDN0:37-39所示重链可变区⑶R序列和SEQIDN0:40-42所示轻链可变区⑶R序列的多肽或抗体或片段，特别是重组抗体或片段。IgM42抗体、抗体42、rHIgM42包括具有SEQIDN0:17的重链可变区序列和SEQIDN0:27的轻链可变区序列的抗体。因此，同样考虑显示基本等同的活性或改变的活性的蛋白质。这些修饰可以是有意的，例如通过位点定向诱变获得的修饰，或可以是意外的，例如在是复合体或其指定亚基的产生者的宿主中通过突变所获得的修饰。此外，术语“抗体”、“神经元结合性抗体”、“IgMl2 抗体”、“IgM42 抗体”、“抗体 12”、“抗体 42”、“sHIgM12”、“sHIgM42”、“rHIgM12”、“rHIgM42”在其范围内欲包括本文明确记载的蛋白质以及所有基本同源的类似物和等位基因变异。
[0114]本文所述氨基酸残基优选呈“L”异构体。然而，呈“D”异构体的残基可取代任何L-氨基酸残基，只要多肽保持免疫球蛋白-结合所需的功能性质。NH2是指存在于多肽氨基端的游离氨基。COOH是指存在于多肽羧基端的游离羧基。与标准多肽命名J.Biol.Chem.，243:3552-59 (1969) 一致，下面显示氨基酸残基的缩写。
[0115]对应表:
[0116]对应表
[0117]
【权利要求】
1.一种分离的人IgM抗体或其片段，所述抗体或其片段特异性结合神经元，保护神经元免于细胞死亡，并且不促进髓鞘再生，其中所述抗体或片段包含下列序列: (a)图5给出的可变重链氨基酸CDR结构域序列CDRlGGSVSLYY (SEQ ID N0:31)、CDR2GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32)和 CDR3 ARSASIRGffFD (SEQ ID NO: 33)及轻链 CDR 序列 CDRlQSISSY (SEQ ID NO:34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35)和 CDR3 QQSYHTPff (SEQ ID NO:36)；或者 (b)图6给出的可变重链氨基酸CDR结构域序列CDRlGFTFSTYA (SEQ ID NO:37)、CDR2 INVGGVTT (SEQ ID N0:38)和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)及轻链 CDR序列 CDRl QGIG (SEQ ID N0:40)、CDR2 TTS (SEQ ID N0:41)和 CDR3 QKYNSAPRT (SEQ IDNO:42)， 所述抗体或其片段用于治疗或改善其中神经受损、损伤或损害或有其风险的哺乳动物的疾病或病况。
2.权利要求1的分离抗体，其包含SEQID NO:1所示可变重链氨基酸序列和SEQ IDNO: 11所示可变轻链氨基酸序列或包含SEQ ID NO: 17所示可变重链氨基酸序列和SEQ IDNO:27所示可变轻链氨基酸序列。
3.权利要求1的分离抗体或其片段，其包含可变重链氨基酸CDR结构域序列CDRlGFTFSTYA (SEQ ID N0:37)、CDR2 I NVGGVTT (SEQ ID N0:38)和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF(SEQ ID NO:39)及轻链 CDR 序列 CDRl QGIG (SEQ ID N0:40)、CDR2 TTS (SEQ ID N0:41)和 CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO:42)。
4.权利要求3的分离抗体，其包含图6中给出的SEQID NO: 17所示可变重链氨基酸序列和SEQ ID NO:27所示可变轻链氨基酸序列。
5.权利要求1、3或4的分离抗体，其是重组抗体rHIgM42。
6.权利要求3的分离抗体或其片段，其是包含重链和轻链可变区的抗体或抗体片段或者其高度同源的变体，所述重链和轻链可变区含有选自氨基酸序列SEQ ID NO: 17和27的氨基酸序列，其中所述变体保持神经元结合和神经保护活性。
7.权利要求1的分离抗体或其片段，其包含可变重链氨基酸CDR结构域序列CDRlGGSVSLYY (SEQ ID N0:31)、CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASIRGffFD (SEQID NO:33)及轻链 CDR 序列 CDRl QSISSY (SEQ ID N0:34)、CDR2 AAS (SEQ ID NO:35)和CDR3 QQSYHTPff (SEQ ID NO:36)。
8.权利要求1或7的分离抗体，其还包含人J链序列。
9.权利要求8的抗体，其中所述J链包含SEQID NO: 15所示氨基酸序列。
10.权利要求7或8的抗体，其包含SEQID NO:1所示可变重链氨基酸序列和SEQ IDNO: 11所示可变轻链氨基酸序列。
11.权利要求1、7、8或10的分离重组抗体，其是重组抗体rHIgM12。
12.权利要求7的分离抗体或其片段，其是包含重链和轻链可变区的抗体完全人抗体或或其片段或者其高度同源的变体，所述重链和轻链可变区含有选自氨基酸序列SEQ IDNO:1和11的氨基酸序列，其中所述变体保持神经元结合和神经保护活性。
13.用于以下疾病的权利要求1-12中任一项的分离抗体或其片段:脊髓损伤(SCI)、创伤性脑损伤(TBI)、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、多发性硬化(MS)、阿尔茨海默病、中风、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、产前缺氧/围产期缺血、大脑性麻痹、脑病、脊髓病或运动神经元疾病。
14.权利要求1的分离抗体，其与髓鞘再生抗体组合配制用于治疗或改善其中枢神经系统神经受损、损伤或损害或有其风险的哺乳动物的疾病或病况。
15.权利要求14的分离抗体，其中组合的髓鞘再生抗体选自IgM22和IgM46。
16.权利要求15的抗体，其中组合的髓鞘再生抗体包含SEQID NO:43和44所示重链和轻链可变区序列，或包含SEQ ID NO:45和46所示重链和轻链可变区序列。
17.用可检测标记或功能标记标记的权利要求1-12中任一项的抗体。
18.权利要求17的抗体，其中所述标记是酶、特异性结合配偶体、配体、染料、荧光标签和/或放射性元素。
19.一种分离核酸，其包含编码权利要求1-12中任一项的抗体或片段的序列。
20.一种制备权利要求1-12中任一项限定的抗体或片段的方法，所述方法包括在引起所述抗体或片段表达的条件下表达权利要求17的核酸，和回收所述抗体或片段。
21.一种药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项限定的抗体或片段和药学上可接受的溶媒、载体或稀释剂。
22.一种用于治疗或改善动物受试者的神经细胞损伤、损害或死亡的药盒，所述药盒包含权利要求21的药物组合物的药物剂型和含有一种或多种其它神经活性剂或治疗剂、抗炎剂、神经递质释放调节剂、神 经受体配体或激动剂或拮抗剂、钙通道作用剂、免疫调节剂或其它CNS反应性抗体的单独的药物剂型。
23.权利要求22的药盒，其中所述其它CNS反应性抗体是选自IgM22和/或IgM46的髓鞘再生抗体。
24.一种用于检测患有导致CNS损害的疾病、病况或并发症的哺乳动物的神经损伤、死亡或损害的存在情况或程度的方法，所述方法包括: A.使来自其中疑似存在神经损伤、死亡或损害的哺乳动物的生物样品与权利要求1-12中任一项的抗体或片段在允许所述抗体或片段与所述样品中的神经元结合发生的条件下接触；和 B.检测来自所述样品的所述神经元与抗体间是否发生结合或者测定来自所述样品的所述神经元与抗体已发生结合的量； 其中检出结合表明在所述样品中存在神经细胞损伤、死亡或损害，而结合的量表明神经细胞损伤、死亡或损害的相对量。
25.一种用于靶向并测定哺乳动物CNS中的神经元损伤、死亡或损害或者有其风险的细胞的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物可检测标记量的权利要求1-12中任一项的抗体，并测定所述哺乳动物CNS中标记的量和/或其位置。
【文档编号】A61K39/395GK103429260SQ201180061125
【公开日】2013年12月4日 申请日期:2011年10月19日 优先权日:2010年10月19日
【发明者】M.罗德里格斯, A.E.沃林顿, L.R.皮斯 申请人:梅奥医学教育和研究基金会