专利名称：天仙子药材的指纹图谱及其质量控制方法
技术领域：
本发明属于中药材鉴别方法领域，特别涉及一种天仙子药材的化合物的指纹图谱及其质量控制方法。
背景技术：
天仙子，即Henbane Qlyoscyamus niger L.),为两年生草本,原生于欧洲,西亚， 北亚及北非等地，后传入东亚，北美和澳洲，现许多国家均有栽培，是一种传统的致幻剂。天仙子原植物高0. 3-0. 7m，灰绿色叶子，白色或淡黄色花，具紫色脉纹，种子为深棕色，带有明显难闻气味，因此俗称臭茄。在中国，古代应用天仙子多以种子药用，少数以根入药，现代应用主要以种子入药，而在英国、美国和德国，除种子外，天仙子的干燥叶，花冠和新鲜开花期的全株植物也可入药，英国药典以带花全草入药。中药的天仙子是指爺科植物莨菪Hyoscyamus niger L.的干燥成熟种子,原称 “莨菪子”，又称“横唐”，味辛，性温，有大毒。具有解痉止痛，定喘，安神的功能。主治胃痉挛疼痛、喘咳、癫狂。曾有文献报导天仙子用于治疗气管炎、支气管哮喘、抗休克、改善微循环。 特别在近几年来，在研究使用过程中，进一步发现了它多方面的药理作用和临床功能，主要治疗作用是解除小血管和平滑肌的痉挛，感染性休克，改善微循环，治疗神经痛和癫痫，调节和多种体液因子等，近年来，具研究发现天仙子的一些化合物还具有抗癌活性。《中华本草》和《中药大辞典》记载天仙子广泛分布于全国各地东北、华北、西北及安徽、山东、河南、四川、西藏等地。天仙子有生品、炒制品、醋制品，2010版《中国药典》收载天仙子，但未收录其炮制方法，亦没有对炮制温度和时间等详细炮制工艺参数的规定。目前中国药典规定的检测指标为托烷类生物碱，不具有专属性。单一成分的测定难以代表其整体质量，药材中其它成分的情况不能给与全面反映。为此，就需要借助于色谱指纹图谱技术，建立天仙子较为科学全面的质量评价体系。指纹图谱技术优点是可以全面的反映天仙子复杂的化学成分及其相对比例，有效的表征其质量。同时，炮制使天仙子中的有效成分含量发生了变化，有利于增强疗效，需有其特征性的方法来进行质量控制，否则会影响天仙子的质量、疗效及用药安全性。
发明内容
本发明的目的是提供一种天仙子药材及其炮制品的指纹图谱及其质量控制方法， 建立了天仙子及炒天仙子的质量标准，为今后控制天仙子饮片的临床用药的安全性和有效性奠定了基础。本发明的技术方案如下
I、供试品溶液的制备称取天仙子或其炮制品约lg，加50ml甲醇回流提取I h，滤过， 浓缩，定容至IOml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用；
其中炮制品是指清炒品、醋制品或加水制品；各炮制品的炮制方法如下清炒品取药材适量，将锅预热至160°C，投入药材，拌炒 4-8分钟；醋制品取药材适量，加食用醋闷4小时，药材与食用醋的比例为IOOg药材加入 40mL食用醋，后将锅预热至160°C，投入药材，拌炒4-8分钟；加水制品取药材适量，加水闷4小时，药材与水的比例为IOOg药材加入40mL水，后将锅预热至160°C，投入药材，拌炒 4-8分钟；2、对照品溶液的制备取克罗酰胺对照品适量，加甲醇制成每ml含0.2mg的对照品溶液，备用；
3、色谱条件与系统适用性试验
色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱；流动相以乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脱；流速 I. 00ml/min ;梯度洗脱程序为0-25分钟乙腈-0. 1%磷酸(10:90);25_50分钟乙腈-0. 1%磷酸(30:70);50-85 分钟乙腈-0. 1% 磷酸(37. 5:62. 5);85_90 分钟乙腈-0. 1% 磷酸(45:55); 柱温30°C ;检测波长254nm ;进样量10 ;
分别精密吸取上述不同供试品溶液各IOW，注入高效液相色谱仪，按上述的色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间。其中，不同产地天仙子供试品溶液中克罗酰胺对照品的保留时间(21号峰)为1， 克罗酰胺对照品色谱峰出现在46分钟左右，计算相对保留时间，对不同产地的图谱进行比较和归属，其中天仙子指纹图谱中共有指纹峰共计30个，相对保留时间为1 (0. 078),2 (0.087)，3 (0.204)，4 (0. 225), 5 (0.243)，6 (0. 282), 7 (0.321)，8 (0.405)，9 (0.447)，
10(0. 555)，11 (0. 599)，12 (0. 655)，13 (0. 696)，14 (0. 723)，15(0. 743)，16 (0. 774)， 17 (0. 786)，18 (0. 812)，19 (0. 893)，20 (0. 973)，21 (I)，22 (I. 035)，23 (I. 074)，24 (I. 288)， 25 (I. 376)，26 (I. 406)，27 (I. 436)，28 (I. 473)，29 (I. 672)，30 (1.725);
不同炮制品天仙子供试品溶液中克罗酰胺对照品的保留时间(26号峰)为1，克罗酰胺对照品色谱峰出现在46分钟左右，计算相对保留时间，天仙子炮制品中指纹图谱中共有指纹峰共计42个，相对保留时间为1(0.078),2(0. 087),3 (0. 109),4(0. 125),5 (0. 144) ,6(0. 169) ,7 (0.204)，8 (0. 225) ,9(0. 243), 10 (0. 282),11(0. 321),12(0. 399),
13(0. 405)，14 (0. 447) , 15(0. 555)，16 (0. 567) , 17(0. 599)，18 (0. 655)，19 (0. 696)， 20 (0. 723)，21 (0. 743)，22 (0. 762)，23(0. 774)，24(0. 786) ,25 (0. 812)，26 (0. 893)， 27 (0. 973) ,28 (1) ,29 (I. 035) ,30 (I. 074), 31 (I. 091) ,32(1. 115) ,33 (1. 146)， 34(1. 288), 35(1. 376) ,36 (I. 406) , 37(1. 436), 38 (I. 473)，39 (I. 569)，40 (I. 614)，41 (I. 672)，42(1. 725)；
天仙子及其炮制品的HPLC指纹图谱及共有峰的标定实验结果提供了天仙子在相同条件下的HPLC图谱相关参数,天仙子药材及炮制品的色谱峰均在90min之内出现,并用对照品溶液标定出克罗酰胺对照品色谱峰。由于克罗酰胺对照品色谱峰出现在46分钟左右， 各样品均存在，时间居中，峰面积较大，为主峰，故选择此峰为内标参照峰，其它特征峰依次标号。共有峰的确定原则为①每个样品中都含有这种成份；②峰形离度>8% ;③各峰相对保留时间的RSD〈5% ;④各峰相对峰面积的RSD〈30%。结果找出较稳定的共有色谱峰。各色谱图中共有峰面积之和均达总面的90%以上。共有峰的提取原则主要共有峰与相邻峰的分离度应达到有效分离，即分离度为
I.2以上，其他共有峰也应达到一定的分离；峰尖到峰谷的距离至少应大于该峰高的2/3以上，如果达不到则两个峰可以合并为一个峰计算。以指纹图谱建立质量标准的优势就在于指纹谱中每个峰具体是何种物质上不明确时，依然能够给出充分的、可靠的信息，用以控制药材质量。因此，在比较主要共有峰时，对于百分面积较小的共有峰应给于足够的重视。运用中药色谱指纹图谱相似度评价计算软件进行各地天仙子及不同炮制品的相似度评价。导入实验数据，设定参照谱，谱峰自动匹配，自动生成对照谱，各样品图谱与对照谱比较及相
互比较，可得各地天仙子相似度结果及天仙子与炮制品天仙子相似度结果。天仙子炮制前后的HPLC指纹图谱有明显的差别，主要表现在极性较大和极性较小的部位，其中具特征规律的有以下3个方面①清炒后新增加了 2个色谱峰，醋制后新增加了 3个色谱峰；②原来在生品中含量小的成分炮制后显著增加，分别为3 (0. 109)，I (0. 321)，14 (0. 447)，15 (0. 555)，17 (0. 599)，19 (0. 696)，20 (0. 723)，23 (0. 774)，
24(0. 786), 25 (0. 812), 26 (0. 893), 29 (I. 035) ,30 (I. 074), 31 (1. 091) ,32(1. 115), 33(1. 146) ,35(1. 376) ,36 (I. 406) ,37(1. 436), 38 (I. 473)，39 (I. 569);③原来在生品中含量较大的成分炮制后显著降低，为42(1. 725)。
图I不同产地天仙子指纹图谱高效液相色谱图2天仙子各炮制品指纹图谱高效液相色谱图。
具体实施例方式以下实施例子进一步解释本发明的内容，但并不用以限制本发明。实施例I
1、供试品溶液的制备分别称取8个产地天仙子约IgjP50ml甲醇回流提取I h,滤过，浓缩，定容至IOml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用；
2、对照品溶液的制备取克罗酰胺对照品适量，加甲醇制成每ml含0.2mg的对照品溶液，备用；
3、色谱条件与系统适用性试验
高效液相色谱仪岛津LC-20A高效液相色谱仪(SH)-IOA检测器，LC-20A泵，SIL-20A 自动进样器，CT0-20A柱温箱，CBM-20A系统控制器，LC Solution LC工作站)色谱柱 DiamonsiI (迪马)-C18 (5 u m, 150X4. 6 mm);流动相:以乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脱；流速
1.00ml/min ;梯度洗脱程序为0-25分钟乙腈-0. 1%磷酸(10:90);25_50分钟乙腈-0. 1%磷 @1(30:70)； 50-85 分钟乙腈-0. 1% 磷酸(37. 5:62. 5 ) ; 85-90 分钟乙腈-0. 1% 磷酸(45:55)； 柱温30°C ;检测波长254nm ;进样量10 ;
分别精密吸取上述不同产地供试品溶液各10沿，注入高效液相色谱仪，按上述的色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间，以供试品溶液中克罗酰胺对照品的保留时间 (21号峰)为1，克罗酰胺对照品色谱峰出现在46分钟左右，计算相对保留时间，对不同产地的图谱进行比较和归属，其中天仙子指纹图谱中共有指纹峰共计30个，相对保留时间为I (0.078),2 (0. 087) ,3 (0. 204) ,4 (0. 225), 5 (0. 243) ,6 (0.282)，7 (0. 321) ,8 (0. 405) ,9 (0. 447) , 10 (0. 555), 11 (0. 599), 12 (0. 655), 13 (0.696)，
14(0. 723)，15 (0. 743)，16 (0. 774)，17 (0. 786)，18 (0. 812)，19 (0. 893)，20 (0. 973) ,21 (1), 22(1. 035) ,23(1. 074) ,24(1. 288) ,25(1. 376), 26 (I. 406) ,27 (I. 436), 28 (I. 473) ,29 (I. 672)，30 (I. 725)；对8个产地的天仙子药材指纹图谱进行了测定，经过计算比较得到各自的指纹图谱的相似度，结果表明，除两个样品外，其余样品的相似度均在0. 90 I之间，表明各样品的相似情况良好。性状鉴别表明，云南和安徽两个样品中分别混有不合格药材和一定量的伪品， 结果相似度均小于0. 90。可见，用该法分析未知样品时，只需测得该样品的色谱指纹图谱， 计算未知样品与共有模式间的相似度，即可对样品进行鉴定、分类和评价。实验结果提示，6 个产地的天仙子药材具有较高的相似度。相似度计算结果见表I。表I不同产地HPLC指纹图谱相似度计算结果
权利要求
1.一种天仙子药材的指纹图谱，其特征在于天仙子指纹图谱中共有指纹峰共计 30个，以克罗酰胺为特征峰，克罗酰胺的保留时间为1，指纹峰的相对保留时间依次为 I (0. 078),2 (0. 087) ,3 (0. 204) , 4 (0. 225) , 5 (0. 243) , 6 (0. 282) , 7 (0.321)，8(0. 405) ,9 (0. 447)，10(0. 555)，11 (0. 599)，12 (0. 655)，13 (0. 696) , 14(0. 723), 15 (0. 743)，16 (0. 774)，17 (0. 786)，18 (0. 812)，19 (0. 893)，20 (0. 973) ,21 (1) ,22 (I. 035)，23(I. 074), 24 (I. 288), 25 (I. 376), 26 (I. 406)，27 (I. 436)，28 (I. 473)，29 (I. 672)，30 (I. 725)。
2.一种天仙子药材的指纹图谱，其特征在于天仙子炮制品中指纹图谱中共有指纹峰共计42个，以克罗酰胺为特征峰，克罗酰胺的保留时间为1，指纹峰相对保留时间依次为 I (0. 078),2(0. 087) ,3 (0. 109), 4(0. 125) ,5 (0.144)，6 (0.169)，7 (0.204)，8 (0.225)，9(0. 243)，10 (0. 282) ,11(0. 321)，12 (0. 399)，13 (0. 405)，14 (0. 447)，15 (0. 555)，16 (0. 567)，17 (0. 599)，18 (0. 655)，19 (0. 696)，20 (0. 723) ,21 (0. 743)，22 (0. 762)，23 (0. 774)， 24(0. 786) ,25 (0. 812)，26 (0. 893)，27 (0. 973)，28 ⑴，29 (I. 035)，30 (I. 074)， 31(1.091) ,32(1. 115) ,33(1. 146) ,34(1. 288) ,35(1. 376), 36 (I. 406) ,37(1. 436), 38 (I. 473)，39 (I. 569)，40 (I. 614)，41 (I. 672) ,42(1. 725)
3.根据权利要求2所述的一种天仙子药材的指纹图谱，其特征在于所述的天仙子炮制品为清炒品、醋制品或加水制品，其中清炒品的是指取天仙子药材适量，将锅预热至160°C， 投入药材，拌炒4-8分钟；醋制品是指取天仙子药材适量，加食用醋闷4小时，药材与食用醋的比例为IOOg药材加入40mL食用醋，后将锅预热至160°C，投入药材，拌炒4_8分钟；加水制品是指取天仙子药材适量，加水闷4小时，药材与水的比例为IOOg药材加入40mL水，后将锅预热至160°C，投入药材，拌炒4-8分钟。
4.一种天仙子药材的质量控制方法，其特征在于(1)供试品溶液的制备称取天仙子或其炮制品约lg，加50ml甲醇回流提取I小时，滤过，浓缩，定容至IOml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，备用；(2)对照品溶液的制备取克罗酰胺对照品适量，加甲醇制成每ml含0.2mg的对照品溶液，备用；(3)色谱条件与系统适用性试验色谱柱十八烷基硅烷键合硅胶(ODS)柱；流动相以乙腈-0. 1%磷酸梯度洗脱；流速 I. 00ml/min ;梯度洗脱程序为0-25分钟乙腈-0. 1%磷酸(10:90);25_50分钟乙腈-0. 1%磷酸(30:70);50-85 分钟乙腈-0. 1% 磷酸(37. 5:62. 5);85_90 分钟乙腈-0. 1% 磷酸(45:55); 柱温30°C ;检测波长254nm ;进样量10 ;分别精密吸取上述不同的供试品溶液各10沿，注入高效液相色谱仪，按上述的色谱条件进行测定，记录色谱峰的保留时间，其中，不同产地供试品溶液中克罗酰胺对照品的保留时间(21号峰)为1，克罗酰胺对照品色谱峰出现在46分钟左右，计算相对保留时间，对不同产地的图谱进行比较和归属，其中天仙子指纹图谱中共有指纹峰共计30个，相对保留时间为1 (0. 078),2 (0. 087) ,3 (0. 204) ,4 (0. 225), 5 (0. 243) ,6 (0. 282), 7 (0.321)，8(0. 405) ,9 (0. 447), 10(0. 555) , 11 (0. 599), 12 (0. 655)，13 (0. 696) , 14(0. 723), 15 (0. 743)，16 (0. 774)，17 (0. 786)，18 (0. 812)，19 (0. 893)，20 (0. 973) ,21 (1) ,22 (I. 035)，23(I. 074), 24 (I. 288), 25 (I. 376), 26 (I. 406)，27 (I. 436)，28 (I. 473)，29 (I. 672)，30(I. 725)；不同炮制品供试品溶液中克罗酰胺对照品的保留时间(26号峰)为1，克罗酰胺对照品色谱峰出现在46分钟左右，计算相对保留时间，天仙子炮制品中指纹图谱中共有指纹峰共计 42 个，相对保留时间为I (0. 078),2(0. 087)，3 (0. 109) ,4(0. 125)，5 (0.144)，6 (0.169)，7 (0.204)，8 (0. 225) ,9(0. 243), 10 (0. 282),11(0. 321),12(0. 399), 13 (0. 405)，14(0. 447)，15(0. 555)，16(0. 567)，17(0. 599)，18(0. 655)，19(0. 696)， 20 (0. 723)，21 (0. 743) , 22 (0. 762) ,23 (0. 774) ,24(0. 786) ,25 (0. 812) ,26 (0. 893)， 27 (0. 973) ,28 (1) ,29 (I. 035) ,30 (1.074)，31 (I. 091) ,32(1. 115) ,33 (1. 146) 34(1.288)，35(1. 376),36 (I. 406) ,37(1. 436), 38 (I. 473), 39 (I. 569) ,40 (I. 614) ,41 (1.672)，42(1.725)。
5.根据权利要求4所述的一种天仙子药材的的质量控制方法，其特征在于所述的天仙子炮制品为清炒品、醋制品或加水制品，其中清炒品的是指取天仙子药材适量，将锅预热至 160°C，投入药材，拌炒4-8分钟；醋制品是指取天仙子药材适量，加食用醋闷4小时，药材与食用醋的比例为IOOg药材加入40mL食用醋，后将锅预热至160°C，投入药材，拌炒4-8 分钟；加水制品是指取天仙子药材适量，加水闷4小时，药材与水的比例为IOOg药材加入 40mL水，后将锅预热至160°C，投入药材，拌炒4_8分钟。
全文摘要
本发明公开了一种天仙子药材的指纹图谱及其质量控制方法，属中药材鉴别方法领域。本发明提供一种天仙子药材及其炮制品的指纹图谱及其质量控制方法，天仙子指纹图谱中以克罗酰胺为特征峰，天仙子指纹图谱共有指纹峰的共计30个，天仙子炮制品中以克罗酰胺为特征峰，指纹图谱中共有指纹峰的共计42个，本发明的色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶柱；流动相以乙腈-0.1%磷酸梯度洗脱建立天仙子的质量标准，为今后控制天仙子饮片的临床用药的安全性和有效性奠定了基础。
文档编号A61P11/14GK102621243SQ201210082259
公开日2012年8月1日 申请日期2012年3月27日 优先权日2012年3月27日
发明者李军, 杨丹, 门启鸣 申请人:大连市食品药品检验所