专利名称：一种TAT结构域修饰的neurogenin2融合蛋白制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及ー种用于治疗中枢神经系统(central nervous system, CNS)损伤及退化性疾病的融合蛋白及其制备方法。
背景技术：
创伤、中风、脑出血、脊髓损伤、神经退行性疾病(如PD、AD等)具有高死亡率和高致残率的特点，如何降低神经功能受损程度、使受损神经元功能得到改善，提高患者的生存质量，对患者及其家庭、社会都有重要意义，是ー个世界性的难题。目前，对于CNS损伤及退行性疾病引起的神经功能障碍尚无有效治疗药物。因此，寻找新型有效的治疗CNS损伤及 退行性疾病药物已成为研究的热点之一。以往普遍认为成年哺乳动物CNS损伤引起的神经功能障碍难以恢复的主要原因是神经元不能再生。近年来，在这方面的研究已有突破性进展。德国慕尼黑大学、亥姆霍兹慕尼黑中心组成的ー个研究小组宣布在脑细胞再生研究方面取得新进展使用特殊的转录因子可使大脑皮层的星形胶质细胞转化为功能性神经细胞。在幼鼠大脑皮层来源的的本来不具有形成神经元能力的星形胶质细胞中转染特殊的转录因子基因，可促使其转变为神经元。新形成的神经元在特殊转录因子的影响下可进ー步形成功能性突触，释放出兴奋性或兴奋性的递质。不仅可使发育的星形胶质细胞发生转变，而且因受损而被激活的成熟大脑中的星形胶质细胞也能发生这种转变。这ー发现使研究人员相信有望找到用脑中现有的星形胶质细胞“更新”因伤或疾病而受损的脑细胞的方法。这一成果将有助于老年痴呆症或中风等疾病新的治疗方法的研究。neurognin2位于2号染色体,隶属于同源盒转录因子家族，neurognin2是ー种神经转录因子。给予这种特殊的转录因子可使大脑皮层的星形胶质细胞转化为功能性兴奋性的神经细胞。neim)gnin2可以顺序特异性的结合DNA，调控大脑的发育，促进神经元的分化，决定皮层GABA神经元的分化命运，调节胚胎期骨骼的发育，海马的形成，胚胎期颅骨的形态发生，牙本质的生成以及嗅球的形成。如Dev Biol, A screen for down streameffectors of Neurogenin2 in the embryonic neocortex,2004 Sep 15;273 (2)373-89，的研究报道。但尚未有分子生物学方法大量获得神经转录因子neur0gnin2，并将其用于中枢神经系统损伤及退化性疾病治疗的报道。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有技术的不足，本发明提供一种能够穿透血脑屏障(BBB)并用于治疗中枢神经系统损伤及退化性疾病的TAT结构域修饰的neurognin2融合蛋白。本发明提供的所述融合蛋白是由人类免疫缺陷病毒反式激活转导蛋白TAT的蛋白转导结构域(protein transduction domain, PTD)修饰neurognin2形成的融合蛋白。所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO: I。
本发明的另ー目的是提供所述TAT修饰的neurognin2融合蛋白的制备方法，所述方法包括步骤
(1)选取含所述蛋白转导结构域PTD的TAT，且其两端分别含有限制性内切酶Afc0I和Xho I位点序列的pTAT-HA表达载体；
(2)从Genebank获取neurognin2基因序列,然后通过原核表达优化基因序列；
(3)合成原核表达优化后的neurognin2目的基因片断,序列两端分别含有AfcoI和ZAoI的酶切位点，并装载到PUC57载体中，形成pUC57-neurognin2载体；
(4)用限制性内切酶AfcoI和沿ο I分别酶切pTAT-HA和pUC57_neurognin2载体，前者回收线性载体，后者回收neurognin2片段； (5)将所述前后酶切产物用T4连接酶连接，通过克隆筛选得到pTAT-neurognin2重组表达质粒载体；
(6)所述重组表达质粒转化大肠杆菌DE3感受态细胞；
(7)诱导蛋白表达。进ー步，所述方法还包括步骤
(8)TAT-neurognin2融合蛋白的亲和纯化；
(9)TAT-neurognin2融合蛋白的鉴定。所述pTAT-HA中蛋白转导结构域PTD的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。本发明的第三个目的是，提供ー种用于表达上述融合蛋白的pTAT-neurognin2重组质粒表达载体。所述重组质粒经过DNA测序分析正确后，转化到大肠杆菌BL21 (DE3)菌株中，挑选5 8个阳性的菌落克隆在氨苄抗性的LB培养基中，用IPTG预诱导表达TAT-neurognin2融合蛋白；表达后的全菌蛋白用SDS-PAGE、考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在16 22°C，0. 2mM IPTG条件下大量表达蛋白。诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过Ni离子螯合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白于-70°C保存，经蛋白免疫印记实验和蛋白质N端测序证明，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。本发明的第四个目的是，提供所述的TAT-neurognin2融合蛋白在制备治疗CNS损伤或神经退行性疾病药物中的应用。本发明的有益效果在干
I.首次将来源于人类免疫缺陷病毒Hiv-I的TAT的蛋白转导域与neurognin2融合，构建pTAT-neurognin2重组质粒,经表达、纯化，可大量获得能够诱导星形胶质细胞转分化为具有生物活性神经元的TAT-neurognin2融合蛋白，且制备成本低、活性高。2. TAT-neurognin2融合蛋白具有TAT融合蛋白系统利于蛋白传送的特点，打破了蛋白质通常只能通过细胞表面受体和信号转导途径将所携帯的生物信息传递到细胞内的规律，有效解决了大分子蛋白质不能穿透血脑屏障(BBB)的问题，所得到的TAT-neurognin2融合蛋白不仅保留了 TAT的穿透力，而且不影响外源neurognin2蛋白的活力，使TAT-neurognin2融合蛋白在临床应用治疗脑损伤疾病中具有广阔的前景。3. TAT-neurognin2融合蛋白，在哺乳动物细胞水平上可作为蛋白药物，用于CNS损伤的治疗。
图I为SDS-PAGE分析的TAT_neurognin2融合蛋白表达和纯化图示；
图2为TAT-neurognin2融合蛋白穿过细胞膜转导入PC12细胞内的图示；
图3是TAT-neurognin2融合穿过血脑屏障转导入脑组织内示意图。腹腔注射40 nmol的TAT_neurognin2和No-TAT_neurognin2后I h, 4h和12 h,小鼠的大脑取出行免疫突光染色分析。箭头表示免疫突光阳性细胞，Scale bars=100 μ m ；
图4是TAT-neurognin2促进AS细胞向神经元转分化的图示。上左图为培养的星形胶质细胞(AS细胞)；上中图为加入TAT-neurognin2融合蛋白于AS细胞中培养12天后，AS细胞的突起回缩,开始向神经元分化；上右图 为TAT-neurognin2融合蛋白与AS细胞共培养20天后，出现明显的神经元形态的细胞；下图为TAT-neurognin2融合蛋白与AS细胞 共培养28天后，典型的神经元出现。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。实施例I :本发明TAT_neurognin2融合蛋白的制备 I.获得pTAT-neurognin2重组表达质粒载体；
(1)选取含限制性内切酶AfcoI和ぬο I位点，并含所述蛋白转导结构域PTD的pTAT-HA表达载体；
(2)从Genebank获取neurognin2基因序列,然后通过原核表达优化基因序列；
(3)合成原核表达优化后的neurognin2目的基因片断,序列两端分别含有AfcoI和ZAoI的酶切位点，并装载到pUC57载体中，形成pUC57-neurognin2质粒载体；
(4)利用NcoI和ZAo I两种酶将pTAT-HA表达载体和pUC57_neurognin2目的片段质粒载体双酶切成相同的粘性末端。酶切反应条件37 0C lh-16h ,65で灭活20min;
(5)利用T4连接酶将酶切后的载体和目的片段连接。连接反应条件室温(25°C)IOmin,通过克隆筛选得到pTAT_neurognin2重组表达质粒载体。2、大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)
(O挑取大肠杆菌DE3单个菌落于5 ml无Amp的LB培养基，37°C培养过夜；
(2)以2%的体积比扩大培养2.5 h，至细菌对数生长期(OD值约为O. 4)；
(3)4°C条件下，3000r/min 离心 IOmin 收菌；
(4)倒出培养液，将管倒置Imin以使最后的痕量培养液流尽；
(5)加入TSS溶液重悬混匀；
(6)超净台上冰上分装，-70°C保存。3、转化
重组表达质粒转化DE3感受态细胞
(1)将含Amp的LB平板培养基37°C预热30min ；
(2)取20μ I重组质粒加入100 μ I BL21感受态细胞中冰浴5 min，然后均匀涂布在含I :1000 Amp的LB平板上，在37°C孵箱孵育过夜，直至长出细菌单克隆。
4、融合蛋白的诱导表达
(1)挑取单克隆菌株到5ml含Amp (100 mg/L)的LB培养基中，37°C振荡培养过夜，次日取出Iml菌液，其余4ml加入IPTG (1:1000)诱导4 h，使目的蛋白表达。再取出Iml诱导后的菌液；
(2)运用煮沸法裂解细菌、释放蛋白；
(3)SDS-PAGE电泳鉴定蛋白有无表达及表达在IPTG诱导前后的差别；表达后的全菌蛋白用考马斯亮兰R250染色，确定诱导表达的条件和阳性菌落克隆，然后在16 22°C，O. 2mMIPTG条件下大量表达蛋白。5、融合蛋白的亲和纯化
(1)去细菌裂解产物上清，用22μ m滤膜过滤； (2)用100ml洗涤液平衡Ni-NTA柱，将过滤后的上清上样，流速控制为20-30 ml/h ；
(3)用100ml洗涤缓冲液洗涤融合蛋白，以除去非特异性结合的杂蛋白；
(4)用适当体积的洗脱缓冲液洗脱融合蛋白。6、融合蛋白的鉴定
诱导表达蛋白的细菌经过超声破碎菌体，释放出目的蛋白后，经过Ni离子整合的亲和层析柱纯化，纯化后的蛋白存放在_70 C的冰箱中，经蛋白免疫印记实验和蛋白质N端测序证明，其氨基酸序列如SEQ. NO. I所示。7、融合蛋白的定量測定
(1)用BCA法进行蛋白定量；
(2)SDS-PAGE凝胶在考马斯亮兰液中染色I h后，用脱色液脱色充分脱色直至背景无色，用薄层扫描仪分析纯化蛋白的纯度。8、融合蛋白的纯度分析
用细菌裂解缓冲液充分悬浮细菌，冰浴下超声、裂解物冷冻离心，收集包涵体。用6mol/L的盐酸呱溶解包涵体，离心收集上清。O. 22 μ m滤膜过滤，用镍离子亲和层析柱层祈，用250 mmol/L咪唑溶液进行洗脱，收集洗脱峰。SDS-PAGE分析纯化蛋白，薄层灰度扫描结果显示纯化后的蛋白纯度为95. 3%。实施例2 :本发明TAT_neurognin2融合蛋白转导功能的鉴定
1、TAT-neurognin2融合蛋白跨膜转导的鉴定(如图3所示)；
2、TAT-neurognin2融合蛋白穿过血脑屏障的鉴定(如图4所示)；
本发明通过小鼠腹腔注射TAT-neurognin2蛋白，6小时后，麻醉小鼠取大脑，冰冻切片，采用免疫突光组织化学分析TAT-neurognin2融合蛋白穿过血脑屏障的转导作用，结果显示TAT-neurognin2融合蛋白可穿过血脑屏障，进入脑实质内，而注射No-TAT-neurognin21融合蛋白的小鼠脑组织均为阴性反应,说明TAT可介导蛋白质通过血脑屏障转导入脑组织，表明TAT-neurognin2融合蛋白具有细胞膜转导作用。实施例3 :本发明TAT_neurognin2融合蛋白体外诱导AS细胞向神经元分化的作用
I、小鼠星形胶质细胞的培养
取出生后7天的昆明小鼠大脑皮层，加入D-Hanks液的培养皿中，用虹膜剪反复剪碎组织至糜状，将组织吸入15ml离心管中，加入O. 125%胰蛋白酶(Sigma)37°C水浴20分钟，在离心管中加入血清終止消化，圆头滴管轻柔吹打，静置10分钟，小心吸取上清液，将上清液加入预先采用多聚赖氨酸(25 μ g/ml)包被的培养瓶中，加入含10%血清(Gibico)的DMEM/H2，第三天半量换液，之后每三天细胞换液，12-15天，当细胞基本长满时将细胞放入摇床中300 rpm 15-19小时进行纯化，纯化后加入新培养液，三天后换液，待用。2、TAT_neurognin2诱导小鼠星形胶质细胞向神经元转分化
取分离并纯化星形胶质细胞，种植于活细胞工作站专用的细胞培养皿中，待星形胶质细胞贴壁后，加入终浓度为40nmol的TAT-LBD_Ngn2，分别与培养12天、20天、28天观察。期间每4天更换培养基一次。本发明将TAT-neurognin2加入到培养的星形胶质细 胞中，12天后,可诱导星形胶质细胞开始向神经元细胞转分化。本发明所述TAT-neurognin2融合蛋白保留了 neurognin2对诱导星形胶质细胞转分化为神经元的活性，具有转导效率高、透过BBB的优点，可用于包括脑缺血缺氧、脑出血、脑创伤、脊髄损伤等多种神经元损伤的治疗。
权利要求
1.ー种TAT结构域修饰的神经转录因子neurogenin2融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白是由人类免疫缺陷病毒反式激活转导蛋白TAT的蛋白转导结构域PTD修饰神经转录因子neurogenin2形成的融合蛋白。
2.按照权利要求I所述修饰的神经转录因子neurogenin2融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
3.按照权利要求I所述修饰的神经转录因子neurogenin2融合蛋白的制备方法,其特征在于，所述方法包括步骤 (1)选取含所述蛋白转导结构域PTD的TAT，且其两端分别含有限制性内切酶AfcoI和Xho I位点序列的pTAT-HA表达载体； (2)从Genebank获取神经转录因子neurogenin2基因序列,然后通过原核表达优化基因序列； (3)合成原核表达优化后的神经转录因子neUr0genin2目的基因片断，序列两端分别含有Afco I和ZAo I酶切位点序列，并装载到pUC57载体中，形成pUC57- neurogenin2载体； (4)用限制性内切酶AfcoI和沿o I分别酶切所述pTAT-HA和pUC57- neurogenin2载体，前者回收线性载体，后者回收neurogenin2片段； (5)将所述前后酶切产物用T4连接酶连接，通过克隆筛选得到pTAT-neurogenin2表达载体； (6)所述重组表达质粒转化大肠杆菌DE3感受态细胞； (7)诱导蛋白表达。
4.按照权利要求3所述修饰的神经转录因子neurogenin2融合蛋白的制备方法,其特征在于，所述方法还包括步骤 (8)TAT- neurogenin2融合蛋白的亲和纯化； (9)TAT- neurogenin2融合蛋白的鉴定。
5.按照权利要求3所述修饰的神经转录因子neurogenin2融合蛋白的制备方法,其特征在于，所述pTAT-HA中蛋白转导结构域PTD的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
6.一种用于表达权利要求I所述融合蛋白的pTAT- neurogenin2重组质粒表达载体。
7.按照权利要求I所述修饰的神经转录因子neurogenin2融合蛋白在制备治疗CNS损伤或神经退行性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种TAT结构域修饰的神经转录因子neurogenin2融合蛋白及其制备方法和用途。具体是由人类免疫缺陷病毒反式激活转导蛋白TAT的蛋白转导结构域修饰神经转录因子neurogenin2形成的融合蛋白TAT-neurogenin2。本发明提供的所述融合蛋白的制备方法包括(1)选取含所述TAT蛋白转导结构域的pTAT-HA表达载体；(2)合成原核表达优化后的神经转录因子neurogenin2目的基因片断，(3)用T4连接酶连接上述酶切产物，通过克隆筛选获得pTAT-neurogenin2重组表达质粒载体；4)所述重组表达质粒转化大肠杆菌DE3感受态细胞，并诱导蛋白表达。本发明首次大量制备低成本、高活性的能够诱导星形胶质细胞转分化为具生物活性神经元的TAT-neurogenin2融合蛋白，且由于TAT-neurogenin2易于穿透血脑屏障(BBB)而在临床治疗脑损伤疾病中具有广阔的前景。
文档编号A61K47/48GK102659951SQ20121017027
公开日2012年9月12日 申请日期2012年5月29日 优先权日2012年5月29日
发明者弥曼, 景晓红, 苟兴春, 闫爱丽, 陈海 申请人:西安医学院