专利名称：一种沙棘提取物及其制备方法与在抑制脂肪酸合酶活性中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种沙棘提取物及其制备方法与在抑制脂肪酸合酶活性中的应用。
背景技术：
脂肪酸合酶是生物细胞内合成脂肪过程中最重要的酶。田维熙等对家禽脂肪酸合酶的研究发现，家禽腹腔的脂肪水平和脂肪酸合酶活性有很高的正相关，并提出控制脂肪酸合酶活性是控制动物体脂水平的有效方法的理论(田维熙，1994.动物的体脂水平和脂肪酸合酶活性的调控.生命的化学，14，(I) :184;田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合酶活性的关系.生物化学杂志，12(2) :234-236;Mei Li et al. . 1999. Factors influencing the levels of fatty acid synthase complex activity in fowl.Biochemistry and Molecular Biology International, 47 (I) : 63-69)。2000 年，霍普金斯大学Loftus等对小鼠脂肪酸合酶的研究结果证明，抑制脂肪酸合酶可造成丙二酸单酰辅酶A的积累，而后者抑制与进食相关的下丘脑神经肽Y的表达，在不影响小鼠活动能力的情况下使食欲下降，体重降低。T. Loftus等指出，脂肪酸合酶可以作为控制体重潜在的治疗靶位(Loftus. T. M. et al.，2000. Science, 288(5475) :2379-2381)。此外，许多研究发现脂肪酸合成酶(FAS)的活性和表达在几乎所有的非病态成人组织中表现出极低的水平，而在许多类型的癌组织如直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肺癌、肝癌等中其活性显著提高，表达显著上调。同时，还有研究发现FAS的抑制剂cerulenin能够杀死癌细胞和阻碍异种移植瘤的生长，其他FAS抑制剂如cerulenin的衍生物C75、β -内酯orlistat、EGCG及其他天然来源的黄酮类化合物如luteolin、quercetin、kaempferol等和抗生素triclosan也已被确认可以通过诱导细胞凋亡抑制肿瘤细胞的生长。以上结果表明，脂肪酸合酶可能是潜在的治疗肥胖症和肿瘤的双重靶点。因此，研制和开发脂肪酸合酶的抑制剂将具有重大的现实意义及开发潜力。沙棘(Hippophaerhamnoides Linn.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(Hippophae)的一种落叶灌木，不仅是一种被广泛用于水土保持的生态植物资源，而且是一种传统的药食两用的植物资源。根据藏医巨著《四部医典》的记载，沙棘具有止咳、平喘、活血化瘀、治疗胃溃疡等功效。现有研究报道，沙棘可降低胆固醇，缓解心绞痛发作，还有防治冠状动脉粥样硬化性心脏病的作用。中国专利CN102000284A公开了一种以沙棘果汁为主要原料配以其他植物的提取液后制备成具有止咳功效的口服液。公开号CN102228545A的中国专利发明了一种沙棘水煎液为主，配以鹿茸、黄芪、桅子、肉桂、大枣等植物水煎液后制备成具有治疗消化性溃疡功能的口服液。又如公开号CN101897967A的中国专利发明了一种治疗血脂异常的沙棘复方制剂。以上专利中发明的药物制剂，都是基于沙棘的传统药用功效。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种沙棘提取物的制备方法。本发明提供的方法，包括如下步骤I)将沙棘果实依次经去除果汁和脱脂处理，得到脱脂后沙棘籽皮混合物；2)将步骤I)得到的脱脂后沙棘籽皮混合物和有机溶剂A水溶液混匀，得到混合液，再将所述混合液经酸化处理得到酸化混合液；所述有机溶剂A水溶液为乙醇水溶液、丙醇水溶液、甲醇水溶液和丙酮水溶液中的任意一种； 3)将步骤2)得到的酸化混合液超声，收集超声产物，即得到沙棘提取物。上述方法步骤I)中，所述脱脂为用有机溶剂B对所述沙棘果实去除果汁后的产物进行回流提取；步骤2)中，所述酸化处理为将所述混合液的pH值调至I. 5-3. 5 ；步骤3)中，所述超声功率大于100W ;所述超声的方式为超声1-3次，每次超声为持续超声，每次所述持续超声的时间为10-30min。上述方法中，步骤I)中，所述有机溶剂B为石油醚；
步骤2)中，所述有机溶剂A水溶液的浓度为50%_75% (体积百分含量)。上述方法中，步骤I)中，所述回流提取的温度为30_90°C，时间为7-12小时；步骤2)中，所述脱脂后沙棘籽皮混合物和所述有机溶剂A水溶液的配比为Ig:5_20ml ；所述调节pH值的试剂具体为乙酸、盐酸、甲酸、三氟乙酸中的任意一种。上述方法中，步骤I)中，在所述去除果汁后和所述脱脂前还包括粉碎的步骤；步骤3)中，在所述收集超声产物的步骤后，还包括如下步骤先向所述超声产物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，再去除乙酸乙酯，得到沙棘提取物。上述萃取为在室温(25°C )下萃取，并静止待自然分层。上述方法中的所述超声产物和所述乙酸乙酯的体积比为I: (1-4)。上述方法中，在所述收集超声产物的步骤后和所述先向所述超声产物中加入乙酸乙酯进行萃取的步骤前，还包括去除所述超声产物中所述有机溶剂A的步骤。上述方法中，去除乙酸乙酯和去除所述超声产物中所述有机溶剂A均采用在30-55°C、压力为O. 01-0. IMPa的条件下减压压缩。由上述的方法制备的沙棘提取物也是本发明保护的范围。上述的沙棘提取物在抑制脂肪酸合酶或制备抑制脂肪酸合酶产品或制备用于减肥产物或制备用于抗癌产品中的应用也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种脂肪酸合酶抑制剂。本发明提供的脂肪酸合酶抑制剂，其活性成分为上述的沙棘提取物。本发明的实验证明，本发明与现有技术相比具有以下优点I、本发明从沙棘中可制取得到一种可以抑制的脂肪酸合酶活性的提取物，是一种天然的、植物源的、无毒的脂肪酸合酶抑制剂；2、本发明得到的提取物可以显著地抑制脂肪酸合酶的活性，其活性大小比目前已知的几种脂肪酸合酶抑制剂，如cerulenin、EGCG、槲皮素、鞣花酸等，高出10-250倍；
3、由于脂肪酸合酶活性的强弱直接影响到生物细胞内合成脂肪的多少和肿瘤细胞合成脂肪酸的能力，因此，抑制脂肪酸合酶的活性，一方面可以使生物细胞内合成脂肪的过程弱化，脂肪含量即会得到控制甚至减少；另一方面可以使肿瘤细胞合成脂肪酸的能力下降，从而可以抑制肿瘤细胞的生长；因此，以本发明的提取物作为活性成分制成各种剂型的减肥药物或抗癌药物具有功效活性显著、作用机理清楚、靶点明确等特点，符合药物制剂开发的要求；
4、由于沙棘是一种传统的药食两用的植物资源，用本发明从沙棘中制取的提取物作为原料制成减肥或抗肿瘤的保健食品、功能化妆品、普通食品等，符合国家对于保健食品及普通食品的原料的限定和法规要求，因此，本发明的具有抑制脂肪酸合酶活性的提取物具有更为广阔的应用开发前景。总之，本发明不仅丰富了纯天然脂肪酸合酶抑制剂的来源，也开拓了具有地域特色和资源优势的沙棘植物新的功效及应用价值。
图I为本发明提取物与几种目前已知的脂肪酸合酶抑制剂的半抑制浓度的对比结果图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例是对本发明的进一步详细说明，但不意味着对本发明的任何限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段做出的各种替换方式或变更，均包含在本发明之内。实施例I、沙棘提取物的获得及检测I、沙棘提取物的获得及检测I)将沙棘果实榨去果汁、粉碎过20目后，再用石油醚在温度30°C下回流提取7个小时脱脂，得到脱脂后沙棘籽皮；2)向步骤I)得到的脱脂后沙棘籽皮中按料液比Ig 15ml (质量体积比)加入50%(体积百分含量)的乙醇，再加乙酸调节至PH值为I. 5，得到酸化混合液；3)将步骤2)得到的酸化混合液于常温下(25°C)超声提取(XH-2008DE超声波萃取仪，北京祥鹄科技发展有限公司)，超声功率200W，提取3次，每次持续lOmin，收集合并提取液，并于温度为35°C、压力为O. OSMPa的条件下减压浓缩至无醇味(除去乙醇)，得到粗提液；4)向步骤3)得到的粗提液中加入4倍体积的乙酸乙酯，在室温(25°C)下进行萃取并静止待自然分层，收集有机相于温度为35°C、压力为O. OSMPa的条件下减压浓缩至挥尽溶剂，干燥至恒重，即得到沙棘提取物A。2、沙棘提取物的检测I)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase, FAS)的制备脂肪酸合酶FAS的粗提新鲜鸡肝脏称重后按1:1.8 (g/mL)加入4°C的抽提缓冲液(O. lmol/L KH2PO4-K2HPO4, ImmoI/L EDTA, ImmoI/L DTT，O. 07mol/L KHCO3, ρΗ8·0)，匀浆50秒。测量匀浆液体积后以8000r / min速度4°C下离心15min。上清液经纱布过滤，测量体积后，再以35000r / min速度4°C下离心30min。上清液经纱布过滤后分装于耐低温塑料瓶_20°C过夜，剩余置于_80°C保存备用。硫酸铵分步沉淀将冷冻的高速离心上清液置水浴化冻，化冻后置于冰盒中，磁力搅拌状态下按三分之一体积量滴加4°C的pH7. O的饱和硫酸铵(含lmmol/L DTT)至25%饱和度。搅拌IOmin后用10000r/min速度4°C下离心15min,弃去沉淀。取样测定上清液的FAS活性。再于搅拌状态下滴加上清液四分之一体积的4°C pH7. O的饱和硫酸铵(含lmmol/LDTT)至40%饱和度，搅拌IOmin后用10000r/min离心15min。若测定上清中不含或只含很少FAS活性,弃去上清,保留沉淀。
离子交换层析DEAE纤维素DE52经处理后用4°C缓冲液A(5mmol/L KH2PO4-K2HPO4含lmmol/L EDTA, lmmol/L DTT，pH7. O)平衡。上述沉淀控干后溶于适量4°C缓冲液A，测定电导值不大于5. 5ms/cm即可上样。上样后用4°C缓冲液A洗涤至杂蛋白的吸收为0，再依次用 4°C 50mmol/L、160mmol/L、250mmol/L、lmol/L KH2PO4-K2HPO4 缓冲液(皆含 lmmol/L EDTA,lmmol/L DTT, pH7.0)洗脱。分别收集洗脱峰，测量体积、蛋白含量及FAS活性。层析过程使用LKB蛋白监测仪和记录仪监测。亲和层析BlueSepharose6B 树脂用 4°C 缓冲液 B (50mmol/L KH2PO4-K2HPO4 含lmmol/L EDTA, lmmol/L DTT, ρΗ7·0)平衡。将 DEAE 层析的 250mmol/L KH2PO4-K2HPO4 缓冲液洗脱收集液上样。上样后用4°C缓冲液B洗涤，再依次用4°C含0. 35mol/L,2mol/L NaCl缓冲液B洗脱。分别收集洗脱峰，测量体积、蛋白含量及FAS活性。浓缩保存搅拌状态下按含有0. 35mol/LNaCl缓冲液B洗脱收集液三分之二体积缓慢加入4°C饱和硫酸铵溶液至40%饱和度以沉淀FAS。搅拌IOmin后以10000r/min速度4°C下离心15min。弃去上清液，控干沉淀后溶于少量储存缓冲液(0. ImoI/LKH2PO4-K2HPO4,lmmol/L EDTA, IOmmoI/L DTT，20% 甘油，pH7. 0)中，使 FAS 浓度在 10mg/mL 左右，取少量样品测定蛋白浓度和FAS活性，其余分装完毕后经-20°C过夜后转置_80°C冷冻保存备用，得到脂肪酸合酶。脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法进行测定(W. X. Tian et al.，1985. J. Biol. Chem.，260(20) :11375-11387 ；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合酶活性的关系.生物化学杂志，12(2):234-236)。以上分离提纯过程的所有步骤均在4_8°C低温下进行。终样品脂肪酸合酶经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一条带，分子量为270kD。2)沙棘提取物对脂肪酸合酶的抑制作用取10. 9mg由I得到的沙棘提取物A溶于218mlDMS0中作为受试样品溶液；脂肪酸合酶活性采用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、NADPH为底物的标准测活方法进行测定(w. X. Tian et al.，1985. J. Biol. Chem.，260(20) :11375-11387 ；田维熙等，1996.不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合酶活性的关系.生物化学杂志，12(2):234-236)。
将一定浓度的待测样品溶液加入测活体系中，37°C恒温，然后加入一定量的由I)得到的FAS启动反应，测得酶活性为Aitl加样品溶剂对照测得的酶活性是AyAiAtl即为FAS的剩余活性(Remaining Activity, R. A.)。该值越小,贝U表明样品对FAS的抑制能力越强。这种方法测定的抑制作用通常情况下是可逆的，即表示抑制剂与酶的结合是非共价结合。脂肪酸合酶(FAS)活性被抑制的程度用IC50 (半抑制浓度)来表示，其计算方法为以底物中只加入相应提取溶剂的为对照，测定其脂肪酸合酶活性值，该值用A0表示，并设定其为100%。底物中加入脂肪酸合酶抑制剂提取液的为实验组，测得其脂肪酸合酶活性的数值为A0的50%时，抑制剂的浓度为IC50值。该值越小，表明样品对FAS的抑制能力越强。
结果表明沙棘提取物A对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为O. 087 μ g/mL。采用上述方法分别用脂肪酸合酶抑制剂cerulenin (浅蓝菌素)、EGCG (表没食子儿茶素没食子酸酯)、槲皮素、鞣花酸(均购自Sigma公司)进行实验，将对脂肪酸合酶的半抑制浓度和沙棘提取物A对于脂肪酸合酶的半抑制浓度作图如图I所示，a为沙棘提取物A、b为cerulenin、c为EGCG、d为槲皮素、e为鞣花酸，可以看出，沙棘提取物A对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为O. 087 μ g/mL, cerulenin对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为20 μ g/mL、EGCG对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为24 μ g/mL、槲皮素对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为I. 3 μ g/mL、鞣花酸对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为I. 31 μ g/mL。从上述结果可以表明，沙棘提取物A对脂肪酸合酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需的有效剂量很低。实施例2、沙棘提取物的获得及检测I、沙棘提取物的获得及检测I)将沙棘果实榨去果汁、粉碎过20目后，再用石油醚在温度90°C下回流提取10个小时脱脂，得到脱脂后沙棘籽皮；2)向步骤I)得到的脱脂后沙棘籽皮中按料液比Ig 20ml加入60% (体积百分含量)的乙醇，再加10%的稀盐酸，调节至pH值为3，得到酸化混合液；3)将步骤2)得到的酸化混合液于常温下(25°C )超声提取2次，超声功率200W，提取3次，每次持续20min，收集合并提取液并于温度为55°C、压力为O. OlMPa的条件下减压浓缩至无醇味(除去乙醇)，得到粗提液；4)向步骤3)得到的粗提液中加入I倍体积的乙酸乙酯，在室温(25°C)下进行萃取并静止待自然分层，收集有机相于温度为55°C、压力为O. OlMPa的条件下减压浓缩至挥尽溶剂，经干燥得到沙棘提取物B。2、沙棘提取物的检测I)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase)的制备与实施例I的2的I)相同。2)沙棘提取物对脂肪酸合酶的抑制作用方法与实施例I的2的2)相同，结果表明沙棘提取物B对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为O. 082 μ g/mL。说明沙棘提取物B对脂肪酸合酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需的有效剂量很低。实施例3、沙棘提取物的获得及检测I、沙棘提取物的获得及检测I)将沙棘果实榨去果汁、粉碎过20目后，再用石油醚在温度60°C下回流提取12个小时脱脂，得到脱脂后沙棘籽皮；2)向步骤I)得到的脱脂后沙棘籽皮中按料液比Ig 5ml加入75% (体积百分含量)的乙醇，再加乙酸调节至pH值为3. 5，得到酸化混合液；3)将步骤2)得到的酸化混合液于常温(25°C)下超声提取I次，每次持续30min，收集合并提取液并于温度为30°C、压力为O. IMPa的条件下减压浓缩至无醇味，得到粗提液；4)向步骤3)得到的粗提液中加入2倍体积的乙酸乙酯在室温(25°C)下进行萃取 并静止待自然分层，收集有机相于温度为30°C、压力为O. IMPa的条件下减压浓缩至挥干溶齐U，经干燥得到沙棘提取物C。2、沙棘提取物的检测I)、脂肪酸合酶(Fatty acid synthase)的制备与实施例I的2的I)相同。2)沙棘提取物对脂肪酸合酶的抑制作用方法与实施例I的2的2)相同，结果表明沙棘提取物C对于脂肪酸合酶的半抑制浓度(IC50)为O. 078 μ g/mL。说明沙棘提取物C对脂肪酸合酶的活性有强烈的抑制作用，并且所需的有效剂量很低。
权利要求
1.一种沙棘提取物的制备方法，包括如下步骤 1)将沙棘果实依次经去除果汁和脱脂处理，得到脱脂后沙棘籽皮混合物； 2)将步骤I)得到的脱脂后沙棘籽皮混合物和有机溶剂A水溶液混匀，得到混合液，再将所述混合液经酸化处理得到酸化混合液； 所述有机溶剂A水溶液为乙醇水溶液、丙醇水溶液、甲醇水溶液和丙酮水溶液中的任意一种； 3)将步骤2)得到的酸化混合液超声，收集超声产物，即得到沙棘提取物。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述脱脂为用有机溶剂B对所述沙棘果实去除果汁后的产物进行回流提取； 步骤2)中，所述酸化处理为将所述混合液的pH值调至I. 5-3. 5 ； 步骤3)中，所述超声功率大于IOOW ;所述超声的方式为超声1-3次，每次超声为持续超声，每次所述持续超声的时间为10-30min。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述有机溶剂B为石油醚； 步骤2)中，所述有机溶剂A水溶液的浓度为50%-75% (体积百分含量)。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 步骤I)中，所述回流提取的温度为30— 90°C，时间为7-12小时； 步骤2)中，所述脱脂后沙棘籽皮混合物和所述有机溶剂A水溶液的配比为lg:5—20ml ； 所述调节pH值的试剂具体为乙酸、盐酸、甲酸、三氟乙酸中的任意一种。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 步骤I)中，在所述去除果汁后和所述脱脂前还包括粉碎的步骤； 步骤3)中，在所述收集超声产物的步骤后，还包括如下步骤先向所述超声产物中加入乙酸乙酯进行萃取，收集有机相，再去除乙酸乙酯，得到沙棘提取物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述超声产物和所述乙酸乙酯的体积比为 I: (1-4)。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于 在所述收集超声产物的步骤后和所述先向所述超声产物中加入乙酸乙酯进行萃取的步骤前，还包括去除所述超声产物中所述有机溶剂A的步骤。
8.由权利要求1-7中任一所述的方法制备的沙棘提取物。
9.权利要求8所述的沙棘提取物在抑制脂肪酸合酶或制备抑制脂肪酸合酶产品或制备用于减肥产物或制备用于抗癌产品中的应用。
10.一种脂肪酸合酶抑制剂，其活性成分为权利要求8所述的沙棘提取物。
全文摘要
本发明公开了一种沙棘提取物及其制备方法与在抑制脂肪酸合酶活性中的应用。本发明提供一种沙棘提取物的制备方法，包括如下步骤1)将沙棘果实依次经去除果汁和脱脂，得到脱脂后沙棘籽皮混合物；2)将步骤1)得到的脱脂后沙棘籽皮混合物和有机溶剂A水溶液混匀，得到混合液，再将所述混合液酸化处理得到酸化混合液；所述有机溶剂A水溶液为乙醇水溶液、丙醇水溶液、甲醇水溶液和丙酮水溶液中的任意一种；3)将步骤2)得到的酸化混合液进行超声提取，收集超声产物，即得到沙棘提取物。本发明的实验证明，本发明从沙棘中可制取得到一种可以抑制的脂肪酸合酶活性的提取物，是一种天然的、植物源的、无毒的脂肪酸合酶抑制剂。
文档编号A61P35/00GK102755359SQ20121025134
公开日2012年10月31日 申请日期2012年7月19日 优先权日2012年7月19日
发明者王小艳, 王洪伦, 王祎, 田维熙, 索有瑞, 马晓丰 申请人:中国科学院研究生院, 中国科学院西北高原生物研究所