专利名称：一种海豚链球菌减毒疫苗的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种海豚链球菌减毒疫苗及其应用。
背景技术：
海豚链球菌(Streptococcus iniae)是一种革兰氏阳性细菌,能感染多种鱼类,包括牙鲆、大菱鲆、鲶鱼、虹鳟等，给产业造成严重的经济损失。另外，海豚链球菌也是一种人类病原，在人类种可诱发脑膜炎等疾病。目前对海豚链球菌病的防治在我国主要以抗生素和化学药物为主，没有有效的疫苗。
减毒疫苗是一种近年来发展起来的疫苗形式，其构建原理是将病原菌株通过诸如基因敲除等方法进行改造，使得改造后的突变株的侵染能力大大下降。当这种减毒的细菌作为疫苗使用时，它即可通过自身残留的毒力侵染至宿主体内，引起宿主免疫应答，从而使宿主获得免疫保护性。因此减毒疫苗通常可通过浸泡和口服的方式导入鱼体，从而避免了昂贵的注射途径。目前，海豚链球菌减毒疫苗尚未见报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种海豚链球菌减毒疫苗及其应用。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为一种海豚链球菌减毒疫苗，减毒疫苗菌株为海豚链球菌G26在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养，直至培养到培养基中利福平浓度为200ug/ml，所得转化菌株为减毒疫苗菌株G26RM。将海豚链球菌G26在含有lug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取一个转化子，将转化子在含有2ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天选取转化子；如此重复，直至LB培养基中利福平浓度达200ug/ml，由此获得的转化子即为减毒疫苗菌株G26RM。所述减毒疫苗菌株G26RM与海藻酸钠微球混合，作为海豚链球菌免疫药物。所述减毒疫苗菌株G26RM与海藻酸钠微球混合静置(两种按体积比混合I: I. 67)，将受免鱼喂食含有G26RM疫苗的海藻酸钠微球饲料，持续3天，随后在含有G26RM疫苗的浸泡液中浸泡6小时。本发明具有如下优点I. 口服和浸泡方式导入。本发明的疫苗可经由口服和浸泡方式导入鱼体，因此在应用上操作简单，成本低廉，不受鱼类个体大小限制，可以大面积引用，故具有良好的产业应用前景。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。在本发明实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法
实施例I海豚链球菌减毒疫苗的构建方法将海豚链球菌G26在含有lug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取一个转化子，将转化子在含有2ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取一个转化子，将其在含有4ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取一个转化子。如此逐渐升高利福平浓度，直至利福平浓度达200ug/ml (在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养梯度为，lug/ml、2ug/ml、4ug/ml、IOug/ml、50ug/ml、IOOug/ml 和 200ug/ml),在此培养基中挑取一个转化子，命名为G26RM。所述LB组成成分按重量百分比计1.0%蛋白胨，O. 5%酵母粉，1.0%氯化钠，97. 5%蒸馏水。
所述海豚链球菌G26保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市海淀区中关村北一条13号，保藏日期2007年3月22日，保藏编号为CGMCC No. 1984,分类命名为海豚链球菌(Streptococcus iniae)。实施例2G26RM毒力检测用半致死量(LD5tl)测定方法(具体方法参见文献Wang H，HuY，Zhang Wj Sun L.Construction of an attenuated Pseudomonas fluorescensstrain and evaluation of its potential as a cross-protective vaccine. Vaccine2009; 27:4047 一 55 )检测 G26RM 与野生株 G26 的毒力，发现 G26 的 LD5tl 为 106_ 9CFU,而 G26RM的LD5tl大于109CFU。因此，较之于G26，G26RM的毒力大幅下降，是一株减毒株。实施例3海豚链球菌减毒疫苗的应用步骤I)疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料的制备。在LB培养基中于28°C培养G26RM至OD6tltl为0. 8 — 1，然后离心(5000g，4°C )10min。收集菌体，将其悬浮于普通海水中至终浓度为lxl09cfu/ml，即为G26RM悬浮液。将50ml海藻酸钠(质量百分比3% )与30ml G26RM悬浮液或PBS (对照)混合，随后加入2000ml石蜡、10ml S-80乳化剂(皆购于美国Sigma公司)以及50ml氯化钙(0. 15M)(购于上海Sangon公司);将含有15947和PBS对照的混合液分别离心(IOOOg, IOmin),收集沉淀；将含有G26RM悬浮液和PBS的沉淀分别与IOOOg鱼饲料(购于山东升索渔用饲料研究中心)混合，用F(II)-26双螺杆挤条制粒机(华南理工大学，广州)加工制成颗粒饲料(I. 5mmX 2. 0mm)，即为疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料。所述PBS组成成分按重量百分比计0. 8 % NaCl, 0. 02 % KCl, 0. 358 %Na2HPO4. 12H20, 0. 024% NaH2PO4。步骤2)疫苗浸泡液的制备。在LB培养基中于28°C培养G26RM至OD6tltl为0. 8 —
I,然后离心(5000g，4°C)10min。收集菌体，将其悬浮于海水中至终浓度为lxl08cfu/ml，即为疫苗浸泡液。步骤3)疫苗的免疫传递。将48条牙鲆(每条重约12. 6g)随机分为2 (每组24条)，分别命名为A和B。将A (样品组)和B (对照组)组鱼分别喂食上述步骤I)的疫苗海藻酸钠微球饲料和对照海藻酸钠微球饲料，持续3天。随后，将A和B组鱼分别在上述步骤
2)的疫苗浸泡液和普通海水中浸泡6小时。
步骤4)疫苗的免疫保护效应检测。在LB培养基中培养海豚链球菌G26至0D_为
0.8，然后离心(5000g，4°C，10min)。收集菌体，将G26悬浮于PBS中至终浓度为5xl08cfu/ml,即为海豚链球菌悬液。在上述步骤3)浸泡免疫后的第30天，将A和B组鱼腹腔注射IOOu I海豚链球菌悬液，随后将4组鱼置入正常海水中养殖。在以后的20天中，每天观察并记录各组鱼的死亡情况。20天后，统计各组鱼的总死亡数目A组，5条；B组，17条。利用下列公式计算相对免疫保护效率(RPS)RPS=IOOxd 一免疫组鱼的总死亡百分比/对照组鱼的总死亡百分比)据此算出减毒疫苗G26RM针对海豚链球菌的免疫保护效率为71%。 故本发明的海豚链球菌减毒疫苗能够通过口服和浸泡而有效地保护牙鲆抵御海豚链球菌感染。
权利要求
1.一种海豚链球菌减毒疫苗，其特征在于减毒疫苗菌株为海豚链球菌G26在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养，直至培养到培养基中利福平浓度为200ug/ml，所得转化菌株为减毒疫苗菌株G26RM。
2.按权利要求I所述的海豚链球菌减毒疫苗的制备方法，其特征在于将海豚链球菌G26在含有lug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天，挑取一个转化子，将转化子在含有2ug/ml利福平的LB培养基中培养4 一 5天选取转化子；如此重复，直至LB培养基中利福平浓度达200ug/ml，由此获得的转化子即为减毒疫苗菌株G26RM。
3.按权利要求I所述的海豚链球菌减毒疫苗，其特征在于所述减毒疫苗菌株G26RM与海藻酸钠微球混合，作为海豚链球菌免疫药物。
4.按权利要求3所述的海豚链球菌减毒疫苗，其特征在于所述减毒疫苗菌株G26RM与海藻酸钠微球混合静置，将受免鱼喂食含有G26RM疫苗的海藻酸钠微球饲料，持续3天，随后在含有G26RM疫苗的浸泡液中浸泡6小时。
全文摘要
本发明涉及疫苗学领域，具体的说是一种海豚链球菌减毒疫苗及其应用。减毒疫苗菌株为海豚链球菌G26在含逐渐升高浓度的利福平的培养基中培养，直至培养到培养基中利福平浓度为200ug/ml，所得转化菌株为减毒疫苗菌株G26RM。本发明的疫苗可经由口服和浸泡方式导入鱼体，因此在应用上操作简单，成本低廉，不受鱼类个体大小限制，可以大面积引用，故具有良好的产业应用前景。
文档编号A61K39/09GK102824631SQ20121025599
公开日2012年12月19日 申请日期2012年7月23日 优先权日2012年7月23日
发明者孙黎, 于兰萍, 胡永华 申请人:中国科学院海洋研究所