专利名称：药物诱导的亚细胞结构疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于疫苗领域，具体涉及一种药物诱导的亚细胞结构疫苗及其制备方法。
背景技术：
肿瘤生物治疗发展迅速，目前已有一些肿瘤疫苗上市，大量疫苗也进入临床实验阶段，肿瘤疫苗包括肿瘤细胞疫苗，肿瘤相关抗原疫苗，核酸疫苗及相关活性免疫细胞疫苗
坐寸ο
而肿瘤细胞本身成分复杂，不同种类的肿瘤又存在一定差异，要想选定某特定的抗原肽作为研究靶点又存在一定困难，且肿瘤杀伤主要是通过MHC I类分子提呈诱导Thl型免疫反应起作用，本发明所涉及的短寿蛋白及缺损的核糖体产物属于MHC I类抗原，且抗原类别根据肿瘤类别具有特异性。蛋白酶体抑制剂本身以可抗多发性骨髓瘤应用于临床，蛋白酶体抑制剂联合氯化铵可以抑制溶酶体功能，阻断肿瘤细胞SLiPs、DRiPs的降解，促使其进入自噬途径，达到募集短寿蛋白的目的；在此基础上摹集自噬小体结构。以自噬小体为抗原制备疫苗，小体疫苗的双层膜结构易于被DC等抗原递呈细胞识别且携带的蛋白抗原易于激发体内Thl型免疫反应，活化的⑶4+、⑶8+ T淋巴细胞及分泌的细胞因子可有效杀伤肿瘤细胞。淋巴结给药在临床上以B超定位技术将抗原注射进入肿瘤病人两侧腹股沟淋巴结，大大减少抗原用量，缩短免疫递呈途径，快速有效活化免疫系统，使得机体用药后相对迅速产生免疫应答,杀伤体内肿瘤细胞。
发明内容
解决的技术问题本发明的目的在于提供一种可以用于临床的携带多种抗原的亚细胞结构疫苗。技术方案药物诱导的亚细胞结构疫苗，在肿瘤原代细胞分裂过程中以蛋白酶体抑制剂诱导，肿瘤细胞内部产生的一些易降解蛋白进入自噬途径，产生的自噬小体不被溶酶体降解，最终形成直径为200-900nm的亚细胞结构，即为小体疫苗。药物作用的主体是存活的原代肿瘤细胞。其抗原主体为短寿蛋白以及缺损的核糖体产物。其抗原主体为短寿蛋白以及缺损的核糖体产物由双层膜结构包裹形成粒径约为200-900nm自噬小体的亚细胞结构。诱导形成亚细胞结构的药物为蛋白酶体抑制剂及氯化铵。给药途经为淋巴结给药。既可以单独使用也可与药物载体组成药物组合物，或与其他药物活性成分制成药物组合物，或与其他免疫活性细胞组合使用。药物诱导的亚细胞结构疫苗的制备方法，包括步骤(I)原代肿瘤细胞经酶法及机械研磨法制备单细胞体外培养；(2)培养至一定饱和度加入一定浓度蛋白酶体抑制剂及氯化铵孵育24-48小时，诱导自噬小体形成；(3)低速离心去除残余完整的肿瘤细胞及其他杂质，保留上清；(4)高速离心收集上清中自噬小体结构；(5)由亚细胞结构包裹的抗原蛋白易于被抗原递呈细胞识别及提呈，最终诱发机体强烈的细胞免疫。该方法适用于各种对蛋白酶体抑制剂具有药物敏感性的肿瘤细胞类型制备相应的抗肿瘤小体疫苗。一种药物诱导的亚细胞结构疫苗，在肿瘤原代细胞分裂过程中以蛋白酶体抑制剂诱导，肿瘤细胞内部产生的一些易降解蛋白进入自噬途径，产生的自噬小体不被溶酶体降解，最终形成直径为200-900nm的亚细胞结构，即为小体疫苗。药物作用的主体是存活的原代肿瘤细胞。其抗原主体为短寿蛋白(short-lived proteins, SLiPs)以及缺损的核糖体产物(defective ribosomal products, DRiPs)。其抗原主体为短寿蛋白(short-livedproteins, SLiPs)以及缺损的核糖体产物(defective ribosomal products, DRiPs)由双层膜结构包裹形成粒径约为200-900nm自卩遼小体(aotophagesome)的亚细胞结构。诱导形成亚细胞结构的药物为蛋白酶体抑制剂及氯化铵。给药途经为淋巴结给药，淋巴结给药可以大大减少抗原用量，缩短抗原在体内传递过程，比常规给药方式更易活化免疫系统。既可以单独使用也可与药物载体组成药物组合物，或其他药物活性成分制成药物组合物，或与其他免疫活性细胞组合使用。
药物诱导的亚细胞结构疫苗的制备方法，包括步骤(I)原代肿瘤细胞经酶法及机械研磨法制备单细胞体外培养，(2)培养至一定饱和度加入一定浓度蛋白酶体抑制剂及氯化铵孵育24-48小时，诱导自噬小体形成。(3)低速离心去除残余完整的肿瘤细胞及其他杂质，保留上清。(4)高速离心收集上清中自噬小体结构。(5)由亚细胞结构包裹的抗原蛋白易于被抗原递呈细胞识别及提呈，最终诱发机体强烈的细胞免疫。该方法适用于各种对蛋白酶体抑制剂具有药物敏感性的肿瘤细胞类型制备相应的抗肿瘤小体疫苗。有益效果提供一种可以用于临床的携带多种抗原的亚细胞结构疫苗及其制备方法，本发明的抗肿瘤的亚细胞结构疫苗是基于以蛋白酶体抑制剂及氯化铵诱导肿瘤原代细胞内短寿蛋白和缺损的核糖体产物作为抗原蛋白通过自噬途径进入双层膜结构的自噬小体中，这样包裹抗原的自噬小体即为本发明的亚细胞结构疫苗。该疫苗经淋巴结给药可以有效诱发机体免疫系统的交叉递呈，激活CD4+、CD8+ T淋巴细胞及CTL细胞，杀伤肿瘤细胞。
图I是本发明中方法制备的肝癌细胞亚细胞结构疫苗电镜效果 图2是临床B超定位病人淋巴结给药过程 图3是病人给药前后外周血IFNy浓度，a.免疫前，b.免疫后一周；
图4是原发性肝癌病人肺转移后使用小体疫苗治疗前后肿瘤病灶部位CT。a.治疗前，
b.治疗后3个月。
具体实施方式
实施例I :
在本发明中提供了新型亚细胞结构疫苗的制备方法，包括(1)肿瘤病人原代细胞分离、体外培养，(2)蛋白酶体抑制剂及氯化铵诱导形成携带短寿蛋白的自噬小体形成，(3)梯度离心法分离自噬小体，(4)蛋白定量。这种疫苗强化抗原免疫原性原理为蛋白酶体抑制剂及氯化铵为诱导药物，可以抑制溶酶体中蛋白酶对SLiPs、DRiPs的降解，而SLiPs、DRiPs作为MHC I类抗原可以有效诱导CD8+T淋巴细胞活化。分泌激活型细胞因子，如IL-l、IL-2、IFNa ,IFNy ,TNFa、TNF3
坐寸ο本发明第二方面，提供了一种抗肿瘤的细胞亚结构疫苗，其含多种有已知及未知抗原及表位，这些已知及未知的抗原主要由蛋白酶体抑制剂及氯化铵诱导制备。本发明第三方面，提供了制备亚细胞结构疫苗，S卩小体疫苗制备方法的适用范围，如上所述，该疫苗可适用于所有对蛋白酶体抑制剂及氯化铵敏感的可在胞内促进SLiPs、DRiPs进入自噬小体形成的肿瘤细胞类型。 本发明第四上面，提供了上述小体疫苗用途，在临床上，该疫苗可适用于实体瘤肿瘤患者术后有效辅助治疗。本发明中，提供了上述小体疫苗的给药途径，即B超定位的病人两侧腹股沟淋巴
结给药。本发明中提供了小体疫苗具体制备方法将实体瘤肿瘤病人术后分离的肿瘤组织在30min内在无菌环境进行单细胞分离处理，并以10%胎牛血清1640培养基二氧化碳环境培养，单细胞分离时先将实体瘤用剪刀简单分离成小块，按照每2g组织加入2mg/mL胶原酶II 37°C消化30min，取出消化后的单细胞悬液，经200目滤网过滤，取出其它纤维组织及脂肪组织，得到较纯净的肿瘤原代单细胞，生理盐水洗涤后以1640完全培养基37°C, CO2培养。培养24小时后，收集细胞，将原培养液更换为含有Immol蛋白酶体抑制剂及Immol氯化铵的培养液，再放入细胞培养箱孵育过夜。电镜观察自噬小体形成情况，发现细胞此时会有200-900nm小泡状结构分泌至胞外，即为自噬小体。此时，收集培养液上清，先经1000rpm/5min离心，完整细胞等将形成沉淀，小体将保留于上清中。再将上清12000rpm/30min离心，此时，粒径较小的自噬小体将出现在沉淀中。收集沉淀，生理盐水洗涤3次后以约500ul生理盐水重悬，此时即得到小体疫苗注射液。为了充分灭活肿瘤原代细胞，小体疫苗制备完成后将经放射科Y射线处理lh。病人术后一个月即可使用上述小体疫苗，给药剂量为每侧IOOug/次，给药间隔时间为一个月。
权利要求
1.药物诱导的亚细胞结构疫苗，其特征在于在肿瘤原代细胞分裂过程中以蛋白酶体抑制剂诱导，肿瘤细胞内部产生的一些易降解蛋白进入自噬途径，产生的自噬小体不被溶酶体降解，最终形成直径为200-900nm的亚细胞结构，即为小体疫苗。
2.根据权利要求I所述的药物诱导的亚细胞结构疫苗，其特征在于药物作用的主体是存活的原代肿瘤细胞。
3.根据权利要求I所述的药物诱导的亚细胞结构疫苗，其特征在于其抗原主体为短寿蛋白以及缺损的核糖体广物。
4.根据权利要求I所述的药物诱导的亚细胞结构疫苗，其特征在于其抗原主体为短寿蛋白以及缺损的核糖体产物由双层膜结构包裹形成粒径约为200-900nm自曬小体的亚细胞结构。
5.根据权利要求I所述的药物诱导的亚细胞结构疫苗，其特征在于诱导形成亚细胞结构的药物为蛋白酶体抑制剂及氯化铵。
6.根据权利要求I所述的药物诱导的亚细胞结构疫苗，其特征在于给药途经为淋巴结给药。
7.根据权利要求I所述的药物诱导的亚细胞结构疫苗，其特征在于既可以单独使用也可与药物载体组成药物组合物，或与其他药物活性成分制成药物组合物，或与其他免疫活性细胞组合使用。
8.权利要求I所述的药物诱导的亚细胞结构疫苗的制备方法，其特征在于包括步骤(O原代肿瘤细胞经酶法及机械研磨法制备单细胞体外培养；(2)培养至一定饱和度加入一定浓度蛋白酶体抑制剂及氯化铵孵育24-48小时，诱导自噬小体形成；(3)低速离心去除残余完整的肿瘤细胞及其他杂质，保留上清；(4)高速离心收集上清中自噬小体结构；(5)由亚细胞结构包裹的抗原蛋白易于被抗原递呈细胞识别及提呈，最终诱发机体强烈的细胞免疫。
9.根据权利要求8所述的药物诱导的亚细胞结构疫苗的制备方法，其特征在于该方法适用于各种对蛋白酶体抑制剂具有药物敏感性的肿瘤细胞类型制备相应的抗肿瘤小体疫苗。
全文摘要
药物诱导的亚细胞结构疫苗及其制备方法，在肿瘤原代细胞分裂过程中以蛋白酶体抑制剂诱导，肿瘤细胞内部产生的一些易降解蛋白进入自噬途径，产生的自噬小体不被溶酶体降解，最终形成直径为200-900nm的亚细胞结构，即为小体疫苗。本发明的抗肿瘤的亚细胞结构疫苗是基于以蛋白酶体抑制剂及氯化铵诱导肿瘤原代细胞内短寿蛋白和缺损的核糖体产物作为抗原蛋白通过自噬途径进入双层膜结构的自噬小体中，这样包裹抗原的自噬小体即为本发明的亚细胞结构疫苗。该疫苗经淋巴结给药可以有效诱发机体免疫系统的交叉递呈，激活CD4+、CD8+T淋巴细胞及CTL细胞，杀伤肿瘤细胞。
文档编号A61K39/00GK102813915SQ20121025700
公开日2012年12月12日 申请日期2012年7月24日 优先权日2012年7月24日
发明者周镇先, 邢芸, 魏强, 曾勇, 苏舒, 方媛 申请人:东南大学