专利名称：一种小菜蛾提取物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于中药制剂及其制备方法技术领域。具体涉及小菜蛾提取物及其应用。
背景技术：
外伤感染是由病原微生物、寄生虫感染局部创伤所致的常见疾病。引起感染的因素种类繁多，外伤感染治疗周期普遍较长，给患者带来了诸多不便。目前治疗外伤感染的药物主要集中在抗生素类药物，治疗过程中往往伴随着副作用，比如药物的毒性反应、过敏反应、二重感染以及细菌耐药性的产生。抗菌肽在治疗这类疾病方面，具有非常明显的优势。肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌。按肿瘤的形态可分为结节型、巨块型和弥 漫型。原发性肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。我国是乙肝大国，我国的肝癌多数是在乙肝肝硬化的基础上发展而来，丙肝病人也在逐渐增加，乙肝后期也会发展为肝癌。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民生命健康的一大杀手，其危险性不容小视。目前肝癌治疗方式主要为手术治疗，射频消融、微波消融、高强度聚焦超声、动脉化疗栓塞、酒精注射、冷冻治疗、放疗、分子靶向治疗、免疫治疗和中医药治疗等，治疗成本高昂，给患者及家庭带来沉重的经济负担，而且目前尚无一种疗效确切的治疗办法，总体患病人数还会呈现上升趋势，肝癌仍将是危害人民健康的疾病之一。小菜蛾大多寄生在甘蓝、紫甘蓝、青花菜、薹菜、芥菜、花椰菜、白菜、油菜、萝卜等食用植物上，对农作物的生长造成危害。近年来，有关昆虫抗菌肽的研究越来越广泛，一些学者发现抗菌肽具有良好的抗菌活性。
发明内容
本发明旨在从对农作物有害的小菜蛾中提取抗菌肽，通过适宜的给药途径进行给药，用于外伤感染治疗，且具有一定的抗癌活性。本发明通过药效学研究，确定了小菜蛾的活性成分，进而优化提取工艺得到简单易行的一种小菜蛾提取物的制备方法。然而，抗菌肽属于肽类成分，直接口服易被生物体内的酶水解而失活，使其应用受到极大限制。建立肽类药物的有效吸收途径成为关键，不仅要保证抗菌肽的稳定性，还需要有效防止药物在体内降解，以更好地发挥药物疗效。为了解决现有技术所存在的问题，本发明的一个目的在于公开了一种小菜蛾提取物。本发明的另一个目的在于公开了小菜蛾提取物的应用。本发明的技术方案如下一种小菜蛾提取物，其中，所述小菜蛾提取物是通过下述方法制备
(I)、用带菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，刺激诱导抗菌肽的产生，刺伤后继续饲养24-48小时；(2)、将小菜蛾用昆虫生理盐水提取，匀质机充分捣碎匀浆，匀浆液加入乙酸铵缓冲液，离心，搜集上清液；(3)、将步骤(2)所得上清液粗滤，粗滤液精滤，滤液冷冻干燥，得到抗菌肽含量为
I.5% I. 8%的小菜蛾提取物。上述技术方案中所述的小菜蛾提取物，其中，带菌小针所带菌种为大肠杆菌或金黄色葡萄杆菌。上述技术方案中所述的小菜蛾提取物，其中，小菜蛾用昆虫生理盐水提取的具体步骤为将小菜蛾加入昆虫生理盐水，其中小菜蛾与昆虫生理盐水之间的重量与体积比为lg (3_5)ml,所述昆虫生理盐水中各物质的浓度为苯甲基磺酰氟IOy g/ml、NaC1130mM、KCl 5mM 和 CaCl2 ImM。上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗外伤感染药物中的应用。上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗外伤感染药物中的应用，其中，所述药物为医学上可接受的肠溶口服制剂或非胃肠道给药剂型，其中所述的肠溶口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或滴丸；所述的非胃肠道给药剂型为注射剂、鼻喷剂、栓剂或口含片。上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用。上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中，所述的肿瘤为肝癌。上述技术方案中所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其中，所述药物为医学上可接受的肠溶口服制剂或非胃肠道给药剂型，其中所述的肠溶口服制剂为片齐U、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或滴丸；所述的非胃肠道给药剂型为注射剂、鼻喷剂、栓剂或口含片。作为对本发明技术的延伸，本发明小菜蛾提取物原料药可以制成以下药物制剂所说的药物制剂是肠溶口服制剂或非胃肠道给药剂型，其中所述的肠溶口服制剂包括片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂当中的任何一种；所述的非胃肠道给药剂型选自于注射剂、鼻喷剂、栓剂、或口含片当中的任何一种。抗菌肽属于肽类成分，为防止抗菌肽直接口服被生物体内的酶水解而失活，提高药物的稳定性，可考虑将抗菌肽制备成非胃肠道给药剂型，或采用肠溶材料制备成肠溶药物。本发明具有以下有益效果I、本发明小菜蛾提取物与抗生素类药物相比具有用量少、毒副作用小、不易产生细菌耐药性等特点。2、本发明小菜蛾提取物采用现代提取工艺从昆虫体内直接提取，具有工艺简单、成本低、疗效好的优点。3、本发明在治疗外伤感染和抗肝癌所采用的提取物来源于对农作物有害的小菜蛾，其来源丰富，因此有效降低了药物的生产成本，降低了药物的价格，且具有与同类药物相近的临床治疗效果，减轻了患者及家庭的经济负担，而且将有害的资源变为对人类有益的药物，具有一定的社会和经济效益。4、本发明小菜蛾提取物及其制备方法，具有提取工艺简单、质量稳定可控、处方用量少、疗效高，给药方便，可有效预防和治疗外伤感染和肝癌。
I、图I为抗菌肽对照品(CeCTopin)的高效液相色谱图；2、图2为本发明小菜蛾提取物的高效液相色谱图。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体试验例对本发明作进一步的说明。 实施例I :小菜蛾提取物的制备(I)、用带大肠杆菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，刺激诱导抗菌肽的产生，刺伤后继续饲养24小时；(2)、将小菜蛾按重量与体积比为lg:3ml加入的昆虫生理盐水，所述昆虫生理盐水中各物质的浓度为苯甲基磺酰氟10 U g/ml、NaCl 130mM> KCl Sml^PICaCl2 ImM，勻质机充分捣碎匀浆，匀浆液加入乙酸铵缓冲液在15000r/min，4°C离心20min，搜集上清液；(3)、将步骤(2)所得上清液过滤，初滤液回滤，滤液冷冻干燥，即得小菜蛾提取物。实施例2 :小菜蛾提取物的制备本实施例与实施例I步骤相同，区别在于用带金黄色葡萄球菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，继续饲养36h，将小菜蛾按重量与体积比lg:4ml加入昆虫生理盐水提取，匀浆，离心，过滤，冷冻干燥，即得小菜蛾提取物。实施例3 :小菜蛾提取物的制备本实施例与实施例I步骤相同，区别在于用无菌小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，继续饲养48h，将小菜蛾按重量与体积比lg:5ml加入昆虫生理盐水提取，匀浆，离心，过滤，冷冻干燥，即得小菜蛾提取物。实施例4 :小菜蛾提取物鼻喷剂的制备(I)、取尼泊金乙酯0. 5g溶解于IOOml水中，加热至40 50°C使之全部溶解；力口入丙二醇5ml，搅拌溶解，高压湿热灭菌，制成辅料溶液备用；(2)、将实施例I 3中的小菜蛾提取物加入辅料溶液中，加水至全量，混匀，密封
分装于定量喷雾器。实施例5 :小菜蛾提取物鼻喷剂的制备本实施例与实施例4步骤相同，区别在于取尼泊金乙酯和尼泊金丁酯各0. 25g溶解于IOOml水中，加热溶解，加入聚乙二醇400 5ml,制成辅料溶液，加入小菜蛾提取物原料药，混匀，密封分装于定量喷雾器。实施例6 :小菜蛾提取物注射用冻干粉针的制备称取实施例I 3中的小菜蛾提取物，分装于安瓿瓶中，制成Img/瓶的规格，封装，轧盖，注射前用生理盐水溶解、摇匀。实施例7 :小菜蛾提取物肠溶胶囊剂的制备
在室温(25°C 土1°C )下，取氯化钙溶液在磁力搅拌器上搅拌，用注射器逐滴滴入含实施例I 3中小菜蛾提取物的海藻酸钠溶液，即可得到白色凝胶状固体，继续在溶液中孵育(室温)15min左右，将微囊用纯水洗涤后过滤分离，冷冻干燥，过7号筛，装于肠溶胶囊壳中，共制成1000粒。实施例8 :小菜蛾提取物口含片的制备称取实施例I 3中小菜蛾提取物的原料药25g，甘露醇10g，糊精5g，羧甲基纤维素钠10g，蔗糖20g，加入70%乙醇适量制软材，制粒，干燥，整粒，再加入微粉硅胶5g，硬脂酸镁IOg,薄荷脑IOg,香精5g,混合均勻,压成100片。实施例9 :小菜蛾提取物的复合胶束的制备(I)、将豆磷脂16. 67g加入IOOml石油醚中制成标准液，氮气吹干大部分溶剂，再放入真空干燥箱，常温条件下放置过夜，以除去微量的有机溶剂，制成脂膜；
(2)、将牛黄胆酸钠2g溶于IOOml的PBS缓冲液(pH=6. 5的磷酸盐缓冲液)中，制成所需的PBS溶液；(3)、将脂膜与PBS溶液在45°C水浴中超声混合45min，即得空白磷脂/胆盐胶束溶液；(4)、将5g小菜蛾提取物的干燥粉末加入到空白磷脂/胆盐胶束溶液中，充氮密封，置恒温磁力搅拌器上，均匀搅拌24h，得载药胶束，即小菜蛾提取物的复合胶束。实施例10 :小菜蛾提取物口胳薄膜的制备(I)将5g羟丙甲基纤维素，5g微晶纤维素，IOml丙二醇溶液加入IOOml蒸馏水中，均匀搅拌I小时，得溶液I ;(2)、将IOg小菜蛾提取物，2g薄荷醇，2g预糊化淀粉，IOg羧甲基纤维素钠钠和5g聚乙二醇400在搅拌状态下加入IOOml蒸馏水中，得溶液2 ；(3)、将溶液I和2混合并搅拌I小时，放置除去气泡，涂布于平板玻璃上制膜，70°C干燥I小时，脱膜，剪成适当大小，封装于适宜包装材料中，即得。小菜蛾提取物中活性成分定量分析采用HPLC法色谱条件色谱柱AgilentAlltima C18 (250mmX4. 6mm, 5 u m);流动相:0. 05%三氟乙酸(TFA)溶液-甲醇-乙腈(95:2. 5:2. 5)；流速1.Oml/min ；柱温25°C;检测波长275nm。色谱图见图I和图2所示，其中图I为抗菌肽对照品，图2为供试品小菜蛾提取物，图I和图2中的I号峰为活性峰。以下通过本发明制备的小菜蛾提取物的药效学试验来进一步阐述本发明产物小菜蛾提取物在治疗外伤感染和肝癌中所具有的有益效果试验例一、考察小菜蛾提取物对体外肝癌细胞的抑制作用:细胞株人肝癌细胞H印G II，由北京协和细胞库提供。药品及试剂MTT(SIGMA, USA), DMSO (SIGMA, USA),胰蛋白酶(SIGMA, USA),RPMI1640 (GIBCO, Invitragen co. , USA),特级胎牛血清 Fetal Bovine Serum (Hyclone)0
仪器超低温冰箱(Bio-TekInstruments, Inooski，VT，USA)，pH 计(Thermoorion，USA)，超净工作台(FLC-哈尔滨东联仪器厂)。MTT试验法将肝癌细胞株按照常规方法培养传代，收集对数生长期细胞，调节单细胞混悬液浓度为I X IO5个/ml。将细胞混悬液加入96孔板中，每个孔加入200 。置于37°C恒温培养箱中培养24h后，实验组加入不同浓度小菜蛾提取物，每个浓度设4个复孔，并设置相应的空白对照组及无细胞调零孔。细胞加药后在37°C，5%C02条件下继续培养48小时，每孔加入20 u I新鲜配制的5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液，并在37°C，5%C02条件下继续培养4h ;小心弃上清，每孔加入150 ill DMS0，置摇床摇匀30min，用酶标仪在492nm波长处检测各孔的光密度值(0D值)，按下列公式计算肝癌细胞的生长抑制率。试验重复3次，结果见下表I。
权利要求
1.一种小菜蛾提取物，其特征在于，所述小菜蛾提取物是通过下述方法制备 (1)、用带菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，刺激诱导抗菌肽的产生，刺伤后继续饲养24-48小时； (2)、将小菜蛾用昆虫生理盐水提取，匀质机充分捣碎匀浆，匀浆液加入乙酸铵缓冲液，离心，搜集上清液； (3)、将步骤(2)所得上清液粗滤，粗滤液精滤，滤液冷冻干燥，得到抗菌肽含量为I.5% I. 8%的小菜蛾提取物。
2.根据权利要求I所述的小菜蛾提取物，其特征在于带菌小针所带菌种为大肠杆菌或金黄色葡萄杆菌。
3.根据权利要求I所述的小菜蛾提取物，其特征在于，小菜蛾用昆虫生理盐水提取的具体步骤为将小菜蛾加入昆虫生理盐水，其中小菜蛾与昆虫生理盐水之间的重量与体积比为lg: (3-5)ml ;所述昆虫生理盐水中各物质的浓度为苯甲基磺酰氟IOy g/ml、NaCl 130mM、KCl 5mM 和 CaCl2 ImM。
4.权利要求I所述的小菜蛾提取物在制备治疗外伤感染药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的小菜蛾提取物在制备治疗外伤感染药物中的应用，其特征在于所述药物为医学上可接受的肠溶口服制剂或非胃肠道给药剂型，其中所述的肠溶口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或滴丸；所述的非胃肠道给药剂型为注射剂、鼻喷剂、栓剂或口含片。
6.权利要求I所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用。
7.根据权利6所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述的肿瘤为肝癌。
8.根据权利要求6或7所述的小菜蛾提取物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于所述药物为医学上可接受的肠溶口服制剂或非胃肠道给药剂型，其中所述的肠溶口服制剂为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂或滴丸；所述的非胃肠道给药剂型为注射剂、鼻喷剂、栓剂或口含片。
全文摘要
本发明一种小菜蛾提取物及其应用，属于中药制剂发明及其制备方法技术领域。小菜蛾提取物是通过下述方法制备所得(1)用带菌的小针斜刺小菜蛾幼虫的腹腔，刺激诱导抗菌肽的产生，刺伤后继续饲养24小时；(2)将小菜蛾用昆虫生理盐水提取，匀质机充分捣碎匀浆，匀浆液加入乙酸铵缓冲液，离心，搜集上清液；(3)将步骤(2)所得上清液粗滤，粗滤液精滤，滤液冷冻干燥，得到抗菌肽含量为1.5%～1.8%的小菜蛾提取物。本发明从小菜蛾中提取得到的含抗菌肽的原料药，通过非胃肠道和胃肠道途径给药，用于抗菌及抗肿瘤治疗，具有提取工艺简单、成本低、疗效好的特点。
文档编号A61P35/00GK102793724SQ20121027002
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者袁海龙, 韩晋, 徐和, 徐平华, 李仙义, 靳士晓, 靳世英, 孟小林 申请人:中国人民解放军第三0二医院