专利名称：小菜蛾抗菌肽脂质体及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物制剂及其制备方法技术领域，具体涉及小菜蛾抗菌肽脂质体及其制备方法和应用。
背景技术：
肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，因其恶性度高，病情发展快，治疗难度大，疗效差，死亡率高，被称为“癌中之王”。我国每年大约有11万人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人数的45%。目前在治疗肝癌方面多依赖于手术，放疗，化疗，治疗过程中伴有恶心、呕吐、毛发脱落等副作用，给病人带来许多痛苦。在治疗过程中，杀死癌细胞的同时人体正常细胞也同 样受到损害，导致患者的一些正常机体功能丧失，机体免疫力下降，不能从根本上解决患者的治病问题。肝癌治疗周期长，花费大，给病人及家庭带来了沉重的经济负担。为此，亟需寻找一种疗效好、毒副作用小，易于患者接受的有效抗肝癌药物及治疗方法。抗菌肽是一类普遍存在于生物体内的阳离子两亲性多肽，是机体免疫防御的重要组成部分，具有抗菌谱广、作用强且迅速、不易产生耐药等众多优点。研究进一步发现，抗菌肽在抗肿瘤方面也具有一定活性，且对哺乳动物正常细胞毒性较低，这些特点使其成为抗肿瘤药物研发的热点之一。小菜蛾抗菌肽(cecropin from Plutellaxylostella(pxCECAl))是鳞翅目菜蛾科Plutella xylostella (L.)幼虫饲养至五龄，用蘸有大肠杆菌或金黄色葡萄杆菌菌液针刺激其腹部后，经基因工程诱导合成的，合成内容见文献 “Production, purification, and characterization of the cecropin fromPlutella xylostella,pxCECAl, using an intein—induced self-cleavable systemin Escherichia coli，，由 Hong Wang, Xiao-Iin Meng，Jin-ping Xu. et al 发表于 ApplMicrobio Biotechnolj94(4):1031-1039。脂质体(Liposomes)是由一种或多种两亲性分子双层膜包裹而成的具有一个或多个水性腔室的微泡。脂质体作为蛋白质及多肽类药物的载体，不仅能够起到缓释和控释的作用，还能提高蛋白质及多肽类药物的稳定性；另外，由于形成脂质体的成膜剂和分散剂与生物膜具有较大的相似性和组织相容性，能有效提高蛋白质及多肽类药物的膜通透性，易于被组织吸收从而提高生物利用度。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明公开了小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法。本发明的另一个目的在于公开了由上述制备方法制得的小菜蛾抗菌肽脂质体。本发明的第三个目的在于公开了小菜蛾抗菌肽脂质体在抗肝癌中的应用。本发明的技术方案如下小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，包括如下步骤(I)、将脂质体成膜剂置于烧杯内，加入2-6倍有机溶剂溶解；(2)、将溶液加入圆底烧瓶中，35_45°C水浴加热减压旋转干燥至有机溶剂挥尽；
(3)、加入含分散剂的水溶液，超声充分分散后，得空白脂质体；(4)、加入小菜蛾抗菌肽，置于涡旋仪上缓缓震荡均匀，即得混合脂质体混悬液；(5)、混悬液放入-20°C冰箱冷冻，然后在室温下解冻，反复冻融3-5次，取冻融处理的混悬液，经冷冻干燥后即得脂质体冻干粉。上述技术方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其中，所述的脂质体成膜剂为磷脂酰胆碱、脑磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕榈酰-DL- α -磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰丝氨酸、神经鞘磷脂、胆固醇、十八胺或磷脂酸中的一种或两者以上的组合。上述技术方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其中，磷脂酰胆碱、脑磷 月旨、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕榈酰-DL-α-磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰丝氨酸或神经鞘磷脂与胆固醇、十八胺或磷脂酸之间的重量比为(O. 5-6) : I。上述技术方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其中，脂质体成膜剂与小菜蛾抗菌肽之间的质量比为(10-20): I。上述技术方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其中，所述的有机溶剂为氯仿、异丙醇、丙酮、乙醇和甲醇中的一种或两者以上的组合；两者以上的组合为任意比例组合。上述技术方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其中，所述的分散剂包括甘露醇、琥珀酸盐和葡萄糖溶液中的一种或两者以上的组合；两者以上的组合为任意比例组合。上述技术方案中所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其中，所述分散剂在水溶液中的质量体积分数为3%-10%，即IOOml水溶液中含有分散剂的量为3g-10g。小菜蛾抗菌肽脂质体，其中，所述小菜蛾抗菌肽脂质体是通过上述技术方案中任一技术方案所述的方法制备所得。小菜蛾抗菌肽脂质体在制备抗肝癌药物中的应用。小菜蛾抗菌肽具有抗肿瘤、作用强且迅速、不易产生耐药等众多优点，由于小菜蛾抗菌肽为肽类物质，体内易被消化系统内的蛋白酶水解使其活性丧失，并且在自然条件下也很容易失活，因此，本发明将小菜蛾抗菌肽制备成脂质体通过静脉注射等非口服途径给药。本发明具有以下有益效果I、脂质体可以提高被包裹药物的稳定性，延长抗菌肽的抗肝癌活性；2、脂质体可以提高抗菌肽被动靶向性，提高药物的生物利用度，减少用药剂量，降低毒性；3、抗菌肽脂质体缓慢释放，延长肾排泄和代谢，从而延长作用时间；4、原料来源丰富，价格低廉，利于扩大化生产和运输。
I、图I为小菜蛾抗菌肽小菜蛾抗菌肽脂质体对人肝癌细胞H印G II的抑制作用曲线.2、图2为人肝癌细胞IfepG II在空白对照组的存活情况；
3、图3为人肝癌细胞IfepG II在浓度为I μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情况；4、图4为人肝癌细胞H印G II在浓度为2 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情况；5、图5为人肝癌细胞IfepG II在浓度为4 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情况；6、图6为人肝癌细胞IfepG II在浓度为8 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情况；
7、图7为人肝癌细胞IfepG II在浓度为16 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽中的存活情况。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。实施例I :小菜蛾抗菌肽脂质体的制备:
卵磷脂Ig
胆固醇0.335g
氯仿5mL
甘露醇1.25g
水25inL
小菜蛾抗菌肽O. Ig按处方量，称取卵磷脂lg、胆固醇O. 335g，置圆底烧瓶中，加入氯仿5ml溶解，40°C水浴旋转蒸发除去有机溶剂，使脂质在器壁上形成一层均匀的薄膜。加入5%甘露醇水溶液25mL，旋转洗膜，水化一定时间后，水浴超声15min分散，即得空白脂质体。加入处方量小菜蛾抗菌肽，置于涡旋仪上缓缓震荡均匀，即得脂质体混悬液；混悬液放入_20°C冰箱冷冻一定时间，然后在室温下解冻，反复冻融3次。取冻融处理的混悬液冷冻干燥后即得脂质体。实施例2 :小菜蛾抗菌妝脂质体的制备:
磷脂酰胆碱Ig
胆固醇0.198g
乙醇5mL
甘露醇2g
水25mL
小菜蛾抗菌肽O.lg按处方量，磷脂酰胆碱lg、胆固醇O. 198g，置圆底烧瓶中，加入乙醇5ml溶解，40°C水浴旋转蒸发除去有机溶剂，使脂质在器壁上形成一层均匀的薄膜。加入8%甘露醇水溶液25mL，旋转洗膜，水化一定时间后，水浴超声15min分散，即得空白脂质体。加入处方量小菜蛾抗菌肽，置于涡旋仪上缓缓震荡均匀，即得脂质体混悬液；混悬液放入_20°C冰箱冷冻一定时间，然后在室温下解冻，反复冻融3次。取冻融处理的混悬液冷冻干燥后即得脂质体。实施例3 :小菜蛾抗菌肽脂质体的制备:
大豆磷脂Ig
十八胺0.215g
异内醇5.5mL
甘露醇2g
水25mL
小菜蛾抗菌肽0.095g按处方量,大豆磷脂lg、十八胺O. 215g,置圆底烧瓶中，加入异丙醇5. 5ml溶解， 40°C水浴旋转蒸发除去有机溶剂，使脂质在器壁上形成一层均匀的薄膜。加入8%甘露醇水溶液25mL，旋转洗膜，水化一定时间后，水浴超声15min分散，即得空白脂质体。加入处方量小菜蛾抗菌肽，置于涡旋仪上缓缓震荡均匀，即得脂质体混悬液；混悬液放入-20°C冰箱冷冻一定时间，然后在室温下解冻，反复冻融3次。取冻融处理的混悬液冷冻干燥后即得脂质体。实施例4 :小菜蛾抗菌肽脂质体的制备:
磷脂酰乙醇胺Ig
磷脂酸0.167 g
丙酬3.5mL
琥珀酸盐1.25g
水25mL
小菜蛾抗菌肽0.12g按处方量，磷脂酰乙醇胺10g、磷脂酸I. 67g，置圆底烧瓶中，加入丙酮35ml溶解，40°C水浴旋转蒸发除去有机溶剂，使脂质在器壁上形成一层均匀的薄膜。加入5%琥珀酸盐水溶液25mL，旋转洗膜，水化一定时间后，水浴超声15min分散，即得空白脂质体。加入处方量小菜蛾抗菌肽，置于涡旋仪上缓缓震荡均匀，即得脂质体混悬液；混悬液放入-20°C冰箱冷冻一定时间，然后在室温下解冻，反复冻融3次。取冻融处理的混悬液冷冻干燥后即得脂质体。实施例五小菜蛾抗菌肽脂质体的制备:
脑磷脂1.053g
磷脂酸0.167 g
甲醇3.8mL
葡萄糖2.5g
水25mL
小菜蛾抗菌肽1.25g
按处方量，脑磷脂I. 053g、磷脂酸O. 167g，置圆底烧瓶中，加入甲醇3. 8ml溶解，40°C水浴旋转蒸发除去有机溶剂，使脂质在器壁上形成一层均匀的薄膜。加入10%葡萄糖溶液25mL，旋转洗膜，水化一定时间后，水浴超声15min分散，即得空白脂质体。加入处方量小菜蛾抗菌肽，置于涡旋仪上缓缓震荡均匀，即得脂质体混悬液；混悬液放入-20°C冰箱冷冻一定时间，然后在室温下解冻，反复冻融3次。取冻融处理的混悬液冷冻干燥后即得脂质体。实施例6 :小菜蛾抗菌肽脂质体包封率的测定:I、色谱条件色谱柱:Agilent Alltima C18 (250mmX4. 6mm, 5 μ m);流动相O. 05%三氟乙酸(TFA)溶液-甲醇-乙腈(95:2.5:2. 5);检测波长275nm ;流速1. Oml/min ;进样量10μ I ;柱温25°C。2、样品包封率的测定(I)、冻干前精密量取小菜蛾抗菌肽脂质体混悬液200μ I置IOml量瓶中，加乙醇 lml，超声20min，放冷至室温，用流动相定容，进样测定总药物量。另取脂质体混悬液适量置I. 5ml离心管中，15000rpm离心lOmin，精密量取上清液200 μ I置IOml量瓶中，同上操作，测定游离药物量，根据公式包封率(ΕΕ，％) = (1 — I· O X 100%，测定3批样品的包封率，结果显示药物平均包封率为82. 35%。(2)冻干后精密称取小菜蛾抗菌肽脂质体冻干粉5mg置5ml量瓶中，加蒸馏水复溶，摇匀，得脂质体混悬液。精密量取脂质体混悬液200μ I置IOml量瓶中，加乙醇1ml，超声20min，放冷至室温，用流动相定容，进样测定总药物量。另取脂质体混悬液适量置I. 5ml离心管中，8000rpm离心lOmin，精密量取上清液200 μ I置IOml量瓶中，同上操作，测定游离药物量，根据公式包封率(ΕΕ，%) = (I — Iim /ff,6) X 100%,测定3批样品的包封率，结果显示药物平均包封率为84. 98%。表I脂质体包封率结果
批次_包封率(％)_平均包封率(％)
185.52
284.47 84.98 _3__84.95__实施例7 :小菜蛾抗菌肽脂质体稳定性考察:取冻干后的脂质体样品，分别于4和25°C放置3个月，于O、I、2、3月取样，考察外观、再分散性、含量、粒径和渗漏率。两种条件下脂质体冻干品均为类白色块状物；除251放置3个月的样品用水再分散的效果较差外，其它条件的样品加水振摇下3min都能快速分散成均匀的混悬液,再分散性良好。渗漏率按照包封率的测定方法测定3批，依照公式渗漏率[[(W^-W^/W初]X 100%,结果显示平均渗漏率为O. 148%。表2脂质体渗漏率结果
_批次_渗漏率(％)_平均渗漏率(％)
「八…·!I0.153
2 0.147 0.148 _3__OJ45__
以下通过本发明制备的小菜蛾抗菌肽脂质体的药效学试验来进一步说明小菜蛾抗菌肽脂质体在抗肝癌治疗中的有益效果试验例I :小菜蛾抗菌肽脂质体对体外肝癌细胞的抑制作用:细胞株人肝癌细胞H印G II，由北京协和细胞库提供。药品及试剂MTT(SIGMA,USA)，DMSO (SIGMA, USA)，胰蛋白酶(SIGMA, USA)，RPMI1640 (GIBCO, Invitragen co. , USA),特级胎牛血清 Fetal Bovine Serum(Hyclone)。仪器超低温冰箱(Bio-TekInstruments, Inooski, VT, USA)，pH 计(Thermoorion, USA)，超净工作台(FLC-哈尔滨东联仪器厂)。试验方法MTT法将肝癌细胞株按照常规方法培养传代，收集对数生长期细胞，调节单细胞混悬液浓度I X IO5个/ml。将细胞混悬液加入96孔板中，每个孔加入200 μ I。置于37°C恒温培养箱中培养24h后，实验组加入不同浓度小菜蛾抗菌肽脂质体，每个浓度设4个复孔。并设有相应的空白对照组及无细胞调零孔。加药后细胞在37°C，5%C02条件下培养48小时，每孔加入20 μ I新鲜配制的5mg/ml四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液，并在37°C，5%C02条件下继续培养4h ;小心弃上清，每孔加入150 μ I DMSO,置摇床摇匀30min，用酶标仪在492nm下检测各孔的光密度值(0D值)，按下列公式计算肝癌细胞的生长抑制率；试验重复3次，结果如表3和图I所示。图2至7分别为人肝癌细胞IfepG II在正常情况下(空白对照组)，浓度为I μ g/ml、2 μ g/ml、4 μ g/ml、8 μ g/ml、16 μ g/ml的小菜蛾抗菌肽的存活情况。
权利要求
1.小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，包括如下步骤 (1)、将脂质体成膜剂置于烧杯内，加入2-6倍有机溶剂溶解； (2)、将溶液加入圆底烧瓶中，35-45°C水浴加热减压旋转干燥至有机溶剂挥尽； (3)、加入含分散剂的水溶液，超声充分分散后，得空白脂质体； (4)、加入小菜蛾抗菌肽，置于涡旋仪上缓缓震荡均匀，即得小菜蛾抗菌肽脂质体混悬液； (5)、混悬液放入-20°C冰箱冷冻，然后在室温下解冻，反复冻融3-5次，取冻融处理的混悬液，经冷冻干燥后即得小菜蛾抗菌肽脂质体。
2.根据权利要求I所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其特征在于所述的脂质体成膜剂为磷脂酰胆碱、脑磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕榈酰-DL- a -磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰丝氨酸、神经鞘磷脂与胆固醇、十八胺或磷脂酸中的一种或两者以上的组合。
3.根据权利要求2所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其特征在于磷脂酰胆碱、脑磷脂、大豆磷脂、卵磷脂、合成二棕榈酰-DL- a -磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、合成磷脂酰丝氨酸或神经鞘磷脂与胆固醇、十八胺或磷脂酸之间的重量比为(0. 5-6) : I。
4.根据权利要求广3中任一权利要求所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其特征在于脂质体成膜剂与小菜蛾抗菌肽的质量比为(10-20) : I。
5.根据权利要求I所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其特征在于所述的有机溶剂为氯仿、异丙醇、丙酮、乙醇和甲醇中的一种或两者以上的组合。
6.根据权利要求I所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其特征在于所述的分散剂包括甘露醇、琥珀酸盐和葡萄糖溶液中的一种或两者以上的组合。
7.根据权利要求6所述的小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，其特征在于所述分散剂在水溶液中的质量体积分数为3%-10%。
8.小菜蛾抗菌肽脂质体，其特征在于所述小菜蛾抗菌肽脂质体是通过权利要求广7中的方法制备所得。
9.小菜蛾抗菌肽脂质体在制备抗肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明小菜蛾抗菌肽脂质体及其制备方法和应用，属于药物制剂及其制备方法技术领域。本发明提供了一种小菜蛾抗菌肽脂质体的制备方法，具有制备工艺简单，制备脂质体所用的原辅料经济易得，所用的有机溶剂可回收利用，且包封率高，制剂工艺稳定，渗漏率低，显著提高了抗菌肽的活性周期的特点。小菜蛾抗菌肽脂质体具有很好的抗肝癌作用，表现在对体外人肝癌细胞HepGⅡ具有明显的抑制活性，并对接种肝癌H22的小鼠体内的肿瘤生长具有显著的抑瘤活性。且该药物具有用量小，毒副作用小，活性强的特点。
文档编号A61K38/17GK102793667SQ201210269910
公开日2012年11月28日 申请日期2012年7月31日 优先权日2012年7月31日
发明者韩晋, 袁海龙, 靳世英, 徐和, 徐平华, 靳士晓, 李仙义, 孟小林 申请人:中国人民解放军第三0二医院