专利名称：用作双重胱天蛋白酶-2/-6 抑制剂的新肽及其生物学应用的制作方法
用作双重胱天蛋白酶-2/-6抑制剂的新肽及其生物学应用本申请是申请日为2005年11月24日、申请号为200580046297. 4、发明名称为“用作双重胱天蛋白酶-2/-6抑制剂的新肽及其生物学应用”的中国发明专利申请的分案申请。本发明涉及用作双重胱天蛋白酶-2/胱天蛋白酶-6抑制剂的新肽类。本发明还涉及其生物学应用。所有胱天蛋白酶(半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶)均表现出具有在天冬氨酸残基和裂解位点N-末端一般4个连续氨基酸的识别序列后裂解的绝对要求的高度特异性。使用组合手段将它们分类成三个不同的特异性组对Trp-Glu-His-Asp具有优先性的I组(胱天蛋白酶-1，_4，-5) JiAsp-Glu-X-Asp具有优先性的II组(胱天蛋白酶_2，-3，-7);和对(Leu/Val)-Glu-X-Asp具有优先性的III组(胱天蛋白酶_6，-8，-9和-10)。这种特征特异性对细胞凋亡过程而言是决定性的，因为它涉及以有序方式(而非无差别蛋白水解)裂解特定组的蛋白质。基于其在 细胞环境中的作用，可以将胱天蛋白酶视为执行(直接裂解在细胞结构、细胞周期调节或信号传导途径中起作用的特异性下游蛋白底物)或起始胱天蛋白酶(作为细胞凋亡途径上游调节物起作用)。由于其在调节细胞凋亡中的中枢作用，所以胱天蛋白酶为重要的治疗靶标。多种神经疾病与胱天蛋白酶细胞凋亡途径相关并且已经证实某些小的胱天蛋白酶抑制剂可阻断神经元细胞死亡效应。作为癌症和神经变性疾病治疗所期望的，胱天蛋白酶的受控活化更难以实现。可能的策略可以包括设计特异性抑制指定病理环境中的必需胱天蛋白酶而非所有胱天蛋白酶的化合物。发现胱天蛋白酶-2作为第一种哺乳动物细胞凋亡的胱天蛋白酶。近期研究揭示出胱天蛋白酶-2作为起始物参与非神经元细胞细胞凋亡的外在和内在途径(Lassus等，2002)。另外，胱天蛋白酶-2既作为默认起始物起作用，又作为默认执行胱天蛋白酶起作用。近来，本发明者证实胱天蛋白酶-2启动原代皮质神经元即部分模拟体内脑缺血的体外模型中血清剥夺所诱导的细胞凋亡(Chauvier等，2005)。胱天蛋白酶_2还能够裂解亨廷顿蛋白，由此可能参与亨廷顿疾病的发病机制。其底物特异性尚未完全了解，并且仅获得了基于两种五肽VDVAD和LDESD的抑制剂。胱天蛋白酶-6涉及神经元(发育)细胞死亡并且是执行胱天蛋白酶而非起始物。存在至少4种病理学情况，已知胱天蛋白酶-6在其中被活化在阿尔茨海默病的营养不良的神经突和神经原纤维缠结中；在人胎儿和成年人脑缺血过程中(Guo等，2004);在提示对于癫痫发生和癫痫的作用的大鼠红藻氨酸癫痫发作模型中；在胃肠内衬上皮细胞的失巢凋亡中。对胱天蛋白酶-6底物特异性了解不足。获得了基于四肽VE 1(或H)D的抑制剂，但是未获得用于胱天蛋白酶-6抑制的基于五肽的抑制剂。I/发明领域本发明属于分子建模、医学生物学和化学领域，并且涉及新化合物和包含所述化合物的药物组合物，它们抑制促细胞凋亡性胱天蛋白酶-2 (Nedd-2 ；Ich-l)和/或抑制促细胞凋亡性胱天蛋白酶-6 (Mch2)并且用于治疗涉及胱天蛋白酶-2活性和/或胱天蛋白酶-6的疾病和损伤。
本发明涉及具有选自下组的核心序列的新肽类SEQ ID N。1:VDEADSEQ ID N。2: LDE⑶SEQ ID N。3: VDE⑶SEQ ID N。4: VDESDSEQ ID N。5: LDEKDSEQ ID N。6: FDESDSEQ ID N。7: LDEAD。 所述的肽类有利地具有N-末端和/或C-末端保护基。按照本发明的一个实施方案，所述的肽类具有N-末端保护基M，其表示A- (CH2) nl，其中. nl=0-20 ；.当nl=0 时，M为 H;. A为C1-C20烷基、一个或几个稠合环和/或杂环；.当不为H，并且当nl大于2时，A为饱和或不饱和的并且任选被一个或几个基团取代，所述的基团诸如为 H、OH、ORa, (CH2)nlOH, (CH2)nl0Ra、C00H、COORa, (CH2)nlCOOH, (CH2)nlC00Ra、C1-C3 烷基或环烷基、(CH2)nl-烷基、CO-NH-烷基、Ar、(CH2)nl-Ar, CO-NH-Ar、卤素、CF3> S03H、(CH2) χΡ03Η2, B (OH) 2、NO2、SO2NH2、SO2NHRa ;其中 x=0，I 或 2 ；Ra 为 C1-C3 烷基并且 Ar为任选取代的芳基或杂芳基；或. A为一个或几个氨基酸残基；或.A表示发色、荧光、发光、吸收(UV至近IR)基团；放射性同位素；金属粒子，诸如用于电子显微镜检查的金属粒子；比色基团；生物素/链霉抗生物素/neutravidin标记系统；或类似物。按照可选与上述披露的实施方案联用的另一个实施方案，本发明的肽类具有羰基(carbony)，其中X为H或羧基保护基，所述的羧基保护基选自下组0Rb、NHRb, SRb, CH2ORb,CH2NHRb, CH2SRb, CH2ORb和CH2Y，其中Rb=酰基、烷基、取代的烷基、芳基、杂芳基、取代的芳基或杂芳基，其任选与一个或几个环和/或杂环稠合；C1-C20取代或未被取代的脂族基团、芳烷基碳环、烷基碳环或杂环基，其任选与一个或几个芳族或非芳族环稠合，并且Y为卤原子(F、Cl、Br或I)或NO2，或X表示发色、荧光、发光、吸收(UV至近IR)基团、放射性同位素诸如用于电子显微镜检查的金属粒子、比色基团、生物素/链霉抗生物素/neutravidin标记系统或类似物。正如通过实施例解释的，上述披露的肽类特别具有对胱天蛋白酶-2和/或-6活性的抑制剂特性。本发明由此还涉及其作为抑制剂用于预防或阻断细胞死亡，特别是神经元、神经元细胞或非神经元细胞中胱天蛋白酶-2活性的应用。此外，本发明的肽类具有高度无害性。通过在成年Swiss小鼠中iv或ip注射100mg/kg未观察到毒性。
所述的特性有利地用于药物组合物。本发明还涉及包含治疗有效量的至少一种诸如上述定义的肽或胱天蛋白酶-2和/或-6抑制剂与药学上可接受的载体的药物组合物。所述的药物组合物采用适合于通过口服、鼻部、局部(例如皮下、脑室内、大脑内植入浸溃了化合物或药物组合物的材料、大脑内植入机械递送装置)或全身(例如腹膜内、静脉内给药以减少细胞死亡的形式。以适合于所治疗的病理学情况和患者年龄的剂量给予本发明的组合物。所述的剂量特别为 10-9mg-100g/Kg，尤其是 O. l-10mg/kgo这类剂量可有效地治疗新生儿(足月分娩)、儿童、成年人的总体缺血。可以通过口服途径或通过ip、iv或皮下注射(I次或几次)给予它们。所述的药物组合物特别用于治疗.病理情况，包括缺氧-缺血(H-1)H-1 (存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)；.病理情况，包括脑缺氧-缺血(H-1)(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)；.神经元死亡，特别是在 总体性或局部性H-1(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中；.神经元死亡，特别是在成年人、胎儿或围产期H-1(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中；.神经元死亡，特别是暂时性或永久性H-1(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况(例如脑、肾、心力衰竭)中；.神经元死亡，特别是H-1(存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)损伤和中风样情况，存在或不存在再灌注情况的脑损伤(例如脑、肾、心力衰竭)；.神经元死亡，特别是在成年人、胎儿或围产期H-1中的大脑中动脉闭塞(MCAO)中；.神经元死亡，特别是当合并下列病理事件的至少一种或多种时存在或不存在再灌注的总体或局部、暂时性或永久性、成年人或胎儿或围产期H-1 (存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)，在脑水平上或在整体水平上；.神经元死亡，特别是在脑损伤后的至少一种或多种情况时；.神经元死亡，特别是在围产期脑损伤后的至少一种或多种情况时。更具体地说(a)本发明涉及五肽-胱天蛋白酶-2蛋白质复合物的分子对接，所述的复合物使得能够(i)鉴定提供与胱天蛋白酶-2接触所需的氨基酸残基和(ii)确定这些序列与胱天蛋白酶-2之间相互作用的性质。(b)本发明涉及获得新的五肽序列/基于它们的抑制剂，其诱导与胱天蛋白酶-2的可逆或不可逆复合物形成(即具有更低的最小能量)，由此产生对胱天蛋白酶-2活性的实验性抑制。(c)本发明涉及获得第一种五肽序列/基于五肽的化合物，其抑制胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6活性，但不抑制其它胱天蛋白酶或蛋白酶(需钙蛋白酶，粒酶B)。
(d)本发明涉及获得第一种五肽序列或基于五肽的化合物，其导致胱天蛋白酶-6抑制。(e)本发明涉及获得第一种五肽序列或基于五肽的化合物，其以相似剂量范围抑制胱天蛋白酶-2和胱天蛋白酶-6活性。(f)可以通过组合分子对接和功能性裂解体外试验而对新的胱天蛋白酶-2抑制剂进行合理设计。(g)在一种非限制性实施方案中，可以将这些序列合并到在其N-末端的甲基丙二酰衍生物、喹啉基衍生物。在一种非限制性实施方案中，可以将离核体如2，6-二氟苯基酯、2，6- 二氟苯氧基、2-溴苯甲酰氧基、氟添加到羧基末端位置上。在一种非限制性实施方案中，氨基酸侧链可包含保护基，诸如甲基，以便改善细胞渗透性和保留。基于先前的数据，这类五肽序列/相关化合物为抑制体外缺血性神经元细胞死亡(尤其是细胞凋亡，Chauvier等，2005)和体内病理学情况包括脑(缺氧_)缺血性损伤(局部暂时性围产期H-1 或MCAO(大脑中动脉闭塞)FR专利申请03 06 190 和 WO 2004/103389 ；TheraptosisSA)的精确模板。(h)本发明涉及如下发现新的胱天蛋白酶-2抑制剂预防或减少体内病理学情况中的脑细胞死亡，所述病理学情况包括心脏停搏或心血管损伤过程中血流减少/缺氧后成年人全脑缺血。(i)本发明涉及新的胱天蛋白酶抑制剂的新的应用，包括局部(例如脑室内、海马内……)递送或全身(腹膜内、静脉内....)给药以便减少病理学情况过程中的脑细胞死亡，在所述的病理学情况中，血流和氧压受到扰乱，即脑(暂时性或永久性)局部或总体缺血。(j)本发明涉及治疗存在细胞死亡的病理学情况，特别是缺血和中风性损伤的方法，包括给予治疗有效剂量的诸如上述定义的药物组合物。(k)包含有效量的本发明肽类的药物组合物特别用于预防、减少和治疗存在细胞死亡的病理情况，特别是在H-1损伤和中风样情况的脑损伤中例如总体或局部的暂时或永久性成年人、胎儿、围产期H-1 (存在或不存在缺氧/低血糖的缺血)，其源自脑或心脏水平，存在或不存在再灌注；或MCAO (大脑中动脉闭塞)。本发明的具体特征和优点在下列数据中给出并且参照附
图1-17，这些附图分别表示-附图1:本发明胱天蛋白酶-2抑制剂的结构；-附图2:胱天蛋白酶-2活性部位上的化合物I(Ac-LDESD-cho)；-附图3:Ac-LDESD-choI的结构和某些残基和官能团；-附图4:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-choI和Ac-LDEAD-cho 的重叠；-附图5:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-choI和Qco-VDVAD-cho 13的重叠；-附图6:胱天蛋白酶-2活性部位 上Ac-LDESD-choI和Ac-LDEAD-cho翌的重叠；-附图7:胱天蛋白酶-2活性部位上Ac-LDESD-choI和Ac-LDEKD-cho丑的重置;-附图8:新设计的五肽抑制剂对人重组胱天蛋白酶-2的抑制曲线；-附图9:本发明五肽抑制剂对人重组胱天蛋白酶-2抑制作用的三种典型模式；-附图10:胱天蛋白酶-2抑制的实验推定(IC50以nM计)，-附图11: Ac-VDVAD-cho 的抑制谱；-附图12:Ac-LDEAD-cho 的抑制谱；-附图13:Ac-VDEAD-cho 的抑制谱；-附图14:新设计的五肽抑制剂对重组需钙蛋白酶I和II的抑制谱；-附图15:新设计的五肽抑制剂对重组粒酶B的抑制谱；-附图16:SEQ8对胱天蛋白酶_2的体外抑制；-附图17:当缺血后I小时1.p.给药时SEQ8使得新生儿缺血性脑损伤的梗塞体积减小(48小时)。
一附图18 :单剂量的SEQ8 (lmg/kg)在缺血后I小时给予时显著减少了(至少30%)梗塞体积。
一附图19 :脑缺血后72小时中在单一1. c. v60ng SEQ8给药后，经SEQ8治疗的动物的染色切片中甲酚紫染色强度部分恢复至无缺血的动物的水平，但细胞形态未完全恢复。
一图20:脑缺血后72小时中在单一1.e. v60ng SEQ8给药后，经SEQ8治疗的动物与缺血性大鼠形成鲜明对比，SEQ8治疗的动物较少存在异常核(核较大并且收缩较少)并且几乎没有细胞掺入了 Fluorojade B (10-20%而非50-60%)。11/序列和胱天蛋白酶-2抑制剂的合理设计11-1/方法胱天蛋白酶-2-抑制剂复合物相当于蛋白质数据库的结构Ipyo (Schweizer等，2003)。以不带电荷形式在介电常数为I时研究所有模型。通过Accelrys的Biopolymer模块(San Diego, CA)手动修饰抑制剂。固定酶原子并且使用2000个步骤的接合梯度，应用Discover模块使该抑制剂最小化，直到RMS〈0. 0001Kcal/mol. Λ。使用InsightII模块
计算非共价能值(范德瓦耳斯能和库仑能)。11-2/结果和讨论附图1显示通过使用上述方法进行分子建模研究的一系列化合物。这些化合物抑制胱天蛋白酶-2酶的功效的特征在于相应酶-抑制剂复合物的最低能量(EminKcaVmol)(附图1)。该能量由两种成分组成(i)因抑制剂与酶残基之间的氢键和盐桥所致的电或库仑成分(E库仑)；(ii)因抑制剂与酶之间的范德瓦耳斯相互作用产生的排斥-吸引成分(E范德瓦瓶)。附图2显示胱天蛋白酶-2活性部位上的参考分子Ac-LDESD-cho I。正如所示的，将这种五肽的原子表示如下(a)绿色=碳；(b)白色=氢；(c)蓝色=氮；(d)红色=氧。这种抑制剂与胱天蛋白酶-2之间的电相互作用(氢键和盐桥)由绿色虚线表示。在该附图中，与抑制剂I发生相互作用的酶残基用黄色表示并且那些不与抑制剂发生相互作用的酶残基用红紫色表示。抑制剂残基由其I字母密码随后是表明其在抑制剂序列中的位置的数字表示。还显示了第一个残基上的氨基的保护。为清楚目的，未在附图1中显示范德瓦耳斯互作用。在全文中将相同的条理用于表示其它新设计的五肽抑制剂与胱天蛋白酶-2酶之间形成的复合物。正如附图2中所示，使Ac-LDESD-chol与胱天蛋白酶_2活性部位之间的复合物稳定的氢键和盐桥如下L1 (NH) -T B233 (OH)，LI (CO) -TB233 (NH)，D2 (NH) -YB273 (CO), D2 (O δ 2) -ΥΒ273 (NH), D2 (O δ ^ -ff B238 (吲哚)和 N B232 (NH2)，E3 (NH)-RB231(CO)，E3(Oδ J-RB231(胍，盐桥)，Ε3 (CO)-R Β23 I (NH)，D5(NH)-AΒ229 (CO)，D5 (O δ ^ -Q Α153 (NH2)和 R Α54 (NH2)，D5 (O δ 2) -R Β231 (胍，盐桥)和 RA54 (胍，盐桥)，D5(C0)-C A155(NH)和H Al 12 (咪唑)和G Al 13 (NH)。用于设计残基的命名、残基侧链的氧原子和第一个残基的氨基保护如附图3所示。将所研究的每种化合物抑制胱天蛋白酶-2酶的能力与在所用模型中表现出-76. 6Kcal/mol最低能量(Eniin)的参照五肽Ac-LDESD-cho I进行比较。由此可以从本发明者的工作中推导出下列结论。11-2.1/残基置换LI 被 Vl 置换(Ac-VDESD-choZ，Emin=-1Ol. 2Kcal/mol)使得抑制剂-胱天蛋白酶-2复合物的稳定性更好。该抑制剂的功效在S4被下列残基置换时甚至更大(i)K4(Ac-LDEKD-cho27, Emin=-1Ol. 2Kcal/mol) ； (ii)A4 (Ac-LDEAD-cho,化合物 H，Emin=-133. 7Kcal/mol);或(iii)G4(Ac-LDEffl)-cho，化合物 26, E ; =~135. Okcal/mole)。这些观察结果由此证实化合物I，U，迷和为比参照化合物I(AC-LDESD-Cho)更好的胱天蛋白酶_2抑制齐U。附图4显示在胱天蛋白酶-2活性部位中化合物I和 (Ac-LDEAD-cho)的重叠。将化合物盟(Emin=-113. 2Kcal/mol, LI被Vl置换且S4被A4置换，Ac-VDEAD-cho)与化合物7(Emin=-101. 2Kcal/mol, LI 被 Vl 置换，Ac-VDESD-cho)比较显示，在 4 位上丙氨酸(A4)比丝氨酸(S4)使得酶-抑制剂复合物更好的稳定。
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使用化合物8(EminE=-85. 4kcal/mole, LI 被 Vl 置换，E3 被 V3 置换且 S4 被A4 置换,Ac-VDVAD-cho)和 20 (Emin=-113. 2Kcal/mol, LI 被 Vl 置换且 S4 被 A4 置换，Ac-VDEAD-cho)获得的结果表明谷氨酸(E3)能够使得胱天蛋白酶_2稳定优于3位上为缬氨酸(V3)。此外，将化合物3(Emin=-97. 2Kcal/mol,Ll 被 Fl 置换，Ac-FDESD-cho)与
5(Emin=-128. 6Kcal/mol, Ac-LDESD-cho)比较显示在I位上为亮氨酸(LI)使得酶-抑制剂复合物稳定优于苯丙氨酸(Fl)残基。此外，在所有所研究的化合物中，D2和/或05被其它氨基酸置换显示出抑制剂-胱天蛋白酶-2复合物的最低能量(Emin)大大增加(结果未显示)，从而表明这两种残基必须在新设计的胱天蛋白酶-2抑制剂中保持不变。I1-2. 2/第一个残基的氨基保护为了鉴定胱天蛋白酶-2酶的更有效抑制剂，研究了第一个残基的氨基官能基的不同保护基对抑制剂-酶复合物稳定性的作用。为了这一目的，使用所用的4种不同五肽序列LDESD、VDVAD、LDEAD和VDEAD。结果如下所示(在文件的最后定义所用的缩写)(a) LDESD 系列。胱天蛋白酶 _2 酶与化合物 I(Ac-LDESD-cho，Emin=-76. 6Kcal/mol), 2 (Qop-LDESD-cho, Emin=-8. 3Kcal/mol)， 4 (Suc-LDESD-cho, Emin=-85. 7Kcal/mol)，5 (Mal-LDESD-cho, Emin=-128. 6Kcal/mol), 6 (Qmal-LDESD-cho, Emin=-53. 8kcal/mole)或31 (Oxa-LDESD-cho, Emin=-9. 5Kcal/mol)之间形成的复合物显示出(i)琥珀酰(Sue)和丙二酰(Mal)基团使得能够远比乙酰基更好地抑制胱天蛋白酶-2酶；(ii) 3-氧代-3-喹啉基丙酰基(Qop) ,3-(2-喹啉基)丙二酰基(Qmal)和草酰基(Oxa)导致形成的酶-抑制剂复合物的稳定性比乙酰基低。(b) VDVAD 系列。胱天蛋白酶 _2 与化合物 § (Ac-VDVAD-cho, Emin=-85. 4Kcal/mol) ,9(Qop-VDVAD-cho, Eniin=-H. 2Kcal/mol)，10 (Mal-VDVAD-cho, Emin=-134. 9Kcal/mol),ll(Suc-VDVAD-cho, Emin=-91. 9Kcal/mol), 12 (Qmal-VDVAD-cho, Emin=-59. OKcal/mol)，13 (Qco-VDVAD-cho, Emin=+38. OKcal/mol 附图 5)，H(Bz-VDVAD-cho，Eniin=-1 8Kcal/mol)，18(Z-VDVAD-cho, Emin=-31. 8Kcal/mol)，19 (Hxa-VDVAD-cho, Emin=-59. OKcal/mol)和M(VDVAD-cho, Emin=-32. Okcal/mol)之间形成的复合物显示出(i)琥珀酰(Sue)和丙二酰(Mal)基团比乙酰基导致形成更稳定性的酶-抑制剂复合物且由此对胱天蛋白酶-2的抑制更好；(ii) 3-氧代-3-喹啉基丙酰基(Qop)、2_喹啉基丙二酰基(Qmal)、2_喹啉基羰基(Qco)、苯甲酰基(Bz)和己酰基(Hxa)导致抑制剂的功效低于乙酰基。正如使用未被保护的五肽M所证实的，第一个残基上缺乏保护还导致形成的酶-抑制剂复合物的稳定性较低。应注意是在酶的原子固 定情况下实现对接。这可以解释对2-喹啉基羰基化合物垃，益和M的最低能量观察到的正值。表1.某些抑制剂-胱天蛋白酶-2复合物的最低能量(Kcal/mol)
权利要求
1.对胱天蛋白酶-2和-6具有抑制活性的肽，其具有下述序列CH3COHN- a -D-E-β -D-CHO, 其中α是选自V或L的氨基酸；以及 β是选自A或G的氨基酸。
2.权利要求1的肽，其中β是A。
3.药物组合物，其中包含治疗有效量的权利要求1或2所述至少一种肽与药学上可接受的载体。
4.权利要求3所述的药物组合物，其中所述的量为10_9mg-100g/Kg。
5.权利要求4所述的药物组合物，其中所述的量为O.l-10mg/kg。
6.权利要求1或2的肽作为药物的用途。
7.权利要求1或2的肽在制备用于治疗围产期或成年人的缺血性损伤的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种用作双重胱天蛋白酶-2/-6抑制剂的新肽及其生物学应用。本发明涉及具有选自包含下列序列的组中的核心序列的肽类SEQ ID N°1:VDEADSEQ ID N°2:LDEGDSEQ ID N°3:VDEGDSEQ ID N°4:VDESDSEQ ID N°5:LDEKDSEQ ID N°6:FDESDSEQ ID N°7:LDEAD，它们用作胱天蛋白酶-2和/或-6活性抑制剂的应用。
文档编号A61K38/08GK103059100SQ20121029165
公开日2013年4月24日 申请日期2005年11月24日 优先权日2004年11月24日
发明者D·肖维耶, R·卡齐米尔, J·厄贝克 申请人:奇斯药制品公司