专利名称：小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法
技术领域：
本发明涉及小球藻深加工及生物技术领域，具体涉及小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法。
背景技术：
小球藻(Chlorella pyenoidosa)是一类普生性单细胞绿藻,属于绿藻门、小球藻属，生长速度快，易于培养，应用价值高.小球藻含有丰富的生物活性物质和药用成分，作为一种新型保健食品和药物蕴藏着巨大潜力。小球藻具有抗肿瘤活性、增加免疫力、解毒保肝、降压作用等，其粗蛋白含量高(50%左右)，品质好，已经成为小球藻应用领域十分活跃、备受重视的一个方面。
生物活性肽是指那些具有特殊生理活性或功能特性的肽类。绝大多数蛋白质都是具有一定功能作用的生物活性肽的前体物质，其肽链结构中存在着具有一定生物活性的氨基酸序列片段(功能区)，在正常状态下，其功能区肽段隐藏在肽链中，但一旦单独从蛋白质肽链中释放出来，在适当的环境下，就能显示出独特的生物活性，这个功能肽段就是生物活性肽。现代生物代谢研究发现人类摄取的蛋白质经过消化道的多种酶水解后，更多的是以低肽的形式直接吸收，具有更高的营养价值和生物效价。酶水解法获得生物活性肽已经成为工业化生产生物活性肽的主要手段。恶性肿瘤是严重威胁人类健康和生命的疾病之一，目前已有的抗肿瘤药物虽对大多数肿瘤有一定疗效，但仍存在着治疗效率低、选择性差、毒副反应大、易产生瘤细胞耐药等问题。因此，从不同途径寻找高效、低毒、特异强的抗肿瘤药物仍是药物治疗肿瘤的当务之急。近年来，人们越来越重视生物活性肽的研究和开发，各种生物活性肽不断被发现和制备，多肽类药物因其分子量小、无免疫原性、结构简单、副作用小，其抗肿瘤活性的研究正在引起国内外学者的广泛关注。蛋白及其多肽类药物在药物投递过程中极易受到复杂生理环境特别是大量酶类物质的作用而遭到破坏，另外其较弱穿透能力及天然脆性决定了较易丧失本身的活性，为了提高多肽的生物利用度，抵抗胃酸和胃蛋白酶的降解作用，必须对其进行适当的保护，使其在小肠内稳定的发挥作用。壳聚糖无毒，具有良好的生物相容性、可降解性、成膜性和可塑性.壳聚糖还具有一定的抗菌、抗肿瘤、抗病毒活性。因此，壳聚糖的应用日益受到人们的重视，在食品和生物医药领域具有广阔的前景。特别对于生物活性肽，壳聚糖包埋可望提高其稳定性和生物利用度，达到更好的营养功能和生理功效。
发明内容
为拓展小球藻在食品和生物医学领域的应用，本发明的目的是提供小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法。为实现本发明目的，采用如下技术方案
I、小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，具体包括如下步骤(1)将小球藻粉和纯水混合后搅拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白质，得到的粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，将获得的溶液离心，去除沉淀获得蛋白上清液，再真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉。
(2)以步骤(I)得到的小球藻蛋白质粉为基础，配置浓度为广4%(w/v,g/mL)的小球藻蛋白水溶液，加水解酶进行水解，水解后，灭酶，冷却至室温后将水解液离心，取上清液，然后，经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤，即可获得分子量大小范围为< 3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步骤(2)得到的3-5 KD小球藻多肽水解液为基础，使用离子交换色谱DEAE-52分离纯化，按照出峰顺序共收集到四个峰Af A4，将收集到的吸收峰A2再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化，按照出峰顺序共收集到二个峰A2-1和A2-2。(4)以步骤(3)得到的纯化的小球藻多肽水解液A2-1为基础，再采用三聚磷酸钠(TPP)离子交联法即可得到小球藻多肽-壳聚糖纳米粒。 上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤(I)所述小球藻粉和纯水的质量比为1:10 1:40，所述搅拌时间为30 120分钟。上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤(I)所述提取小球藻蛋白质为在温度4°c 10°C、压力50MPa 250MPa的条件下提取。上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤(I)所述再提取所提取的次数为I次 8次,每次提取的时间为IOmin 60min ;所述离心为在温度4 8 °C，转速为5000 10000 r/min 下离心 10 60 min。上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤(2)所述水解酶为木瓜蛋白酶，水解条件是温度3(T80 °C, pH= 5 10，酶与小球藻蛋白质水溶液的比为1°/Γ5% (w/v, g/mL)，水解时间为3 10h。上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤(2)所述灭酶为在100 °〇水中灭酶10 min ;所述离心为在8000 r/min下离心25 min。上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤(2)所述过滤为在8000 g、4°c条件下经超滤离心管过滤。上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤(3)所述使用离子交换色谱DEAE-52分离纯化的具体分离条件是上样体积为:Γ15 mL，洗脱速度为O. 2 2 mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280 nm ;所述凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化的具体分离条件是上样体积为3 15 mL，洗脱速度为O. 2^2 mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280nm。上述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤(4)所述三聚磷酸钠(TPP)离子交联法为把I飞HiL浓度为O. 2 2 mg/mL的小球藻多肽水解液A2-1与3 10 mL浓度为f 3mg/mL的壳聚糖醋酸溶液混合均匀，再将浓度为O. Γ2 mg/mL的TPP水溶液逐渐滴加到A2-1和壳聚糖醋酸溶液体系中，搅拌反应30 min,在4 °C >10000 r/min下高速离心30 min,收集沉淀物，将其于45°C烘箱中干燥。与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果本发明得到的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒具有下述抗肿瘤活性对人肝癌细胞HepG2体外生长具有一定的抑制作用，当浓度为400yg/mL时，抑制率可达32%.因而本发明得到的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用。
图I为实施例I中小球藻木瓜蛋白酶3-5 KD水解液(活性组分A)离子交换色谱DEAE-52柱层析洗脱曲线；
图2为实施例I中小球藻活性组分A2凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25柱层析洗脱曲线；
图3为实施例I所制备的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的粒度分布曲线；
图4为实施例I所制备的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒表面形貌的扫描电镜(SEM)图。
具体实施方式
以下结合附图和实例对本发明的具体实施作进一步说明，但本发明的实施和保护范围不限于此。实施例I
小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤如下
(I)采用低温超高压连续流细胞破碎机对小球藻蛋白质进行提取将小球藻粉和纯水以1:20的质量比混合后搅拌50分钟得混合溶液。将上述混合溶液在温度为6°C、压力为IOOMPa的条件下提取小球藻蛋白质，得到粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，提取的次数为3次，每次提取的时间为20min。最后，将获得的溶液于温度4 V，转速为6000r/min下离心30 min,去除沉淀获得蛋白上清液，再迅速真空冷冻干燥,获得小球藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的小球藻蛋白质粉为基础，配置浓度为2%的小球藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解.实验条件是温度40°C，pH= 5，酶与底物的比3%.水解5h后，在100 1水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在8000 r/min下离心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4 1条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD,5 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步骤(2)得到的3-5 KD木瓜蛋白酶水解液(活性组分A)为基础，使用离子交换色谱DEAE-52分离纯化.具体分离条件为上样体积为10 mL，洗脱速度为O. 3 mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280 nm。并且按照出峰顺序共收集到四个峰Af A4 (图I).将收集到的吸收峰A2再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化。具体分离条件为上样体积为5 mL,洗脱速度为O. 2 mL/min,洗脱液为蒸懼水,检测波长为280 nm。并且按照出峰顺序共收集到二个峰A2-1和A2-2 (图2)。(4)以步骤(3)得到的纯化的小球藻多肽水解液A2-1为基础，再采用三聚磷酸钠(TPP)离子交联法制备壳聚糖纳米粒子。具体程序为lmL浓度为O. 4 mg/mL的组分A2-1与5 mL浓度为I mg/mL的壳聚糖醋酸溶液混合均匀。再将浓度分别为O. 3 mg/mL的TPP水溶液逐渐滴加到A2-1和壳聚糖醋酸溶液体系中。搅拌反应30 min,将制得的胶体溶液在
40CuOOOO r/min下高速离心30 min，收集沉淀物，将其于45°C烘箱中干燥即可得到小球藻多肽-壳聚糖纳米粒。采用激光粒度仪对步骤(I) (4)所得的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒进行粒径检测。从图3可以看出，小球藻多肽-壳聚糖纳米粒平均粒径为129. 2nm。把步骤(I广(4)所得的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒进行扫描电镜(SEM)分析。从图4中可以看出，小球藻多肽-壳聚糖纳米粒复合物呈球形或近似球形的形态，粒径大小比较均一。粒径大小为170 nm，与上述的激光粒度散射仪对壳聚糖纳米粒子复合物的粒径分析结果基本吻合。将步骤(I) (4)所得的小球藻多肽 -壳聚糖纳米粒进行抗肿瘤活性检测(使用MTT检测方法)，结果表明，小球藻多肽-壳聚糖纳米粒对人肝癌细胞HepG2体外生长具有一定的抑制作用，当浓度为400 μ g/mL时，抑制率可达32%.
实施例2 小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤如下
(I)采用低温超高压连续流细胞破碎机对小球藻蛋白质进行提取将小球藻粉和纯水以1:30的质量比混合后搅拌80分钟得混合溶液。将上述混合溶液在温度为8V、压力为150MPa的条件下提取小球藻蛋白质，得到粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，提取的次数为6次，每次提取的时间为50min。最后，将获得的溶液于温度4 V，转速为5000r/min下离心20 min,去除沉淀获得蛋白上清液，再迅速真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的小球藻蛋白质粉为基础，配置浓度为2%的小球藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解.实验条件是温度70 °C，pH= 9，酶与底物的比4%.水解6 h后，在100 1水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在8000 r/min下离心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4 1条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD,5 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步骤(2)得到的3-5 KD木瓜蛋白酶水解液(活性组分A)为基础，使用离子交换色谱DEAE-52分离纯化.具体分离条件为上样体积为10 mL，洗脱速度为O. 5 mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280 nm。并且按照出峰顺序共收集到四个峰Af A4.将收集到的吸收峰A2再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化。具体分离条件为上样体积为5 mL，洗脱速度为I. 2 mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280 nm。并且按照出峰顺序共收集到二个峰A2-1和A2-2。(4)以步骤(3)得到的纯化的小球藻多肽水解液A2-1为基础，再采用三聚磷酸钠(TPP)离子交联法制备壳聚糖纳米粒子。具体程序为ImL浓度为O. 7 mg/mL的组分A2-1与
5mL浓度为I. 5 mg/mL的壳聚糖醋酸溶液混合均匀。再将浓度分别为O. 15 mg/mL的TPP水溶液逐渐滴加到A2-1和壳聚糖醋酸溶液体系中。搅拌反应30 min,将制得的胶体溶液在4 0CuOOOO r/min下高速离心30 min，收集沉淀物，将其于45°C烘箱中干燥即可得到小球藻多肽-壳聚糖纳米粒。检测方法与结果同实施例I。实施例3
小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤如下
(I)采用低温超高压连续流细胞破碎机对小球藻蛋白质进行提取将小球藻粉和纯水以1:35的质量比混合后搅拌100分钟得混合溶液。将上述混合溶液在温度为9°C、压力为200MPa的条件下提取小球藻蛋白质，得到粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，提取的次数为2次，每次提取的时间为lOmin。最后，将获得的溶液于温度4 V,转速为8000r/min下离心30 min,去除沉淀获得蛋白上清液，再迅速真空冷冻干燥,获得小球藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的小球藻蛋白质粉为基础，配置浓度为2%的小球藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解.实验条件是温度40°C，pH= 5，酶与底物的比4%.水解4h后，在100 1水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在8000 r/min下离心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4 1条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD,5 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步骤(2)得到的3-5 KD木瓜蛋白酶水解液(活性组分A)为基础，使用 离子交换色谱DEAE-52分离纯化.具体分离条件为上样体积为10 mL，洗脱速度为I mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280 nm。并且按照出峰顺序共收集到四个峰Af A4.将收集到的吸收峰A2再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化。具体分离条件为上样体积为5 mL,洗脱速度为I. 5 mL/min,洗脱液为蒸懼水,检测波长为280 nm。并且按照出峰顺序共收集到二个峰A2-1和A2-2。(4)以步骤(3)得到的纯化的小球藻多肽水解液A2-1为基础，再采用三聚磷酸钠(TPP)离子交联法制备壳聚糖纳米粒子。具体程序为lmL浓度为I. 2 mg/mL的组分A2-1与5 mL浓度为2 mg/mL的壳聚糖醋酸溶液混合均匀。再将浓度分别为I mg/mL的TPP水溶液逐渐滴加到A2-1和壳聚糖醋酸溶液体系中。搅拌反应30 min，将制得的胶体溶液在40CUoooo r/min下高速离心30 min，收集沉淀物，将其于45°C烘箱中干燥即可得到小球藻多肽-壳聚糖纳米粒。检测方法与结果同实施例I。实施例4
小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，步骤如下
(I)采用低温超高压连续流细胞破碎机对小球藻蛋白质进行提取将小球藻粉和纯水以1:10的质量比混合后搅拌90分钟得混合溶液。将上述混合溶液在温度为9°C、压力为250MPa的条件下提取小球藻蛋白质，得到粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，提取的次数为4次，每次提取的时间为40minn。最后，将获得的溶液于温度4 °C ,转速为10000 r/min下离心60 min,去除沉淀获得蛋白上清液，再迅速真空冷冻干燥,获得小球藻蛋白质粉。(2)以步骤(I)得到的小球藻蛋白质粉为基础，配置浓度为2%的小球藻蛋白溶液，加入木瓜蛋白酶进行水解.实验条件是温度60°C，pH= 7，酶与底物的比5%.水解IOh后，在100 1水中灭酶10 min，室温冷却后将水解液在8000 r/min下离心25 min，取上清液。然后，在8000 g、4 1条件下经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤。滤液再经过3 KD,5 KD的超滤离心管过滤。即可获得分子量大小范围为0-3 KD,3-5 KD,5-10 KD、>10 KD的小球藻多肽水解液。(3)以步骤(2)得到的3-5 KD木瓜蛋白酶水解液(活性组分A)为基础，使用离子交换色谱DEAE-52分离纯化.具体分离条件为上样体积为10 mL，洗脱速度为I. 5 mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280 nm。并且按照出峰顺序共收集到四个峰Af A4.将收集到的吸收峰A2再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化。具体分离条件为上样体积为5 mL，洗脱速度为2 mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280 nm。并且按照出峰顺序共收集到二个峰A2-1和A2-2.
(4)以步骤(3)得到的纯化的小球藻多肽水解液A2-1为基础，再采用三聚磷酸钠(TPP)离子交联法制备壳聚糖纳米粒子。具体程序为lmL浓度为O. 2 mg/mL的组分A2-1与5 mL浓度为3 mg/mL的壳聚糖醋酸溶液混合均匀。再将浓度分别为O. I mg/mL的TPP水溶液逐渐滴加到A2-1和壳聚糖醋酸溶液体系中。搅拌反应30 min,将制得的胶体溶液在 4 0CuOOOO r/min下高速离心30 min，收集沉淀物，将其于45°C烘箱中干燥即可得到小球藻多肽-壳聚糖纳米粒。检测方法与结果同实施例I。
权利要求
1.小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤 (I)将小球藻粉和纯水混合后搅拌得混合溶液，在所述混合溶液中提取小球藻蛋白质，得到的粗提液作为下一次的待提取溶液进行再提取，将获得的溶液离心，去除沉淀获得蛋白上清液，再真空冷冻干燥，获得小球藻蛋白质粉；(2)以步骤(I)得到的小球藻蛋白质粉为基础，配置浓度为广4% (w/v)的小球藻蛋白水溶液，力口水解酶进行水解，水解后，灭酶，冷却至室温后将水解液离心，取上清液，然后，经截留分子量为10 KD的超滤离心管过滤，滤液再经过3 KD、5 KD的超滤离心管过滤，即可获得分子量大小范围为<3 KD,3-5 KD,5-10 KD, >10 KD的小球 藻多肽水解液； (3)以步骤(2)得到的3-5 KD小球藻多肽水解液为基础，使用离子交换色谱DEAE-52分离纯化，按照出峰顺序共收集到四个峰ΑΓΑ4，将收集到的吸收峰A2再进行凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化，按照出峰顺序共收集到二个峰A2-1和A2-2 ； (4)以步骤(3)得到的纯化的小球藻多肽水解液A2-1为基础，再采用三聚磷酸钠(TPP)离子交联法即可得到小球藻多肽-壳聚糖纳米粒。
2.根据权利要求I所述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤(I)所述小球藻粉和纯水的质量比为1:10 1:40，所述搅拌时间为30 120分钟。
3.根据权利要求I所述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤(I)所述提取小球藻蛋白质为在温度4°C 10°C、压力50MPa 250MPa的条件下提取。
4.根据权利要求I所述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤(1)所述再提取所提取的次数为I次 8次，每次提取的时间为IOmin 60min;所述离心为在温度4 8 V，转速为5000^10000 r/min下离心10 60 min。
5.根据权利要求I所述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤(2)所述水解酶为木瓜蛋白酶，水解条件是温度3(T80°C, pH= 5 10，酶与小球藻蛋白质水溶液的比为1% 5% (w/v)，水解时间为TlOh。
6.根据权利要求I所述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤(2)所述灭酶为在100 °C7K中灭酶10 min ;所述离心为在8000 r/min下离心25 min。
7.根据权利要求I所述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤(2)所述过滤为在8000g、4 °C条件下经超滤离心管过滤。
8.根据权利要求I所述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤(3)所述使用离子交换色谱DEAE-52分离纯化的具体分离条件是上样体积为3 15mL，洗脱速度为O. 2 2 mL/min，洗脱液为蒸馏水，检测波长为280 nm ;所述凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25分离纯化的具体分离条件是上样体积为:Γ15 mL，洗脱速度为O. 2^2 mL/min，洗脱液为蒸懼水，检测波长为280 nm。
9.根据权利要求I所述的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于步骤(4)所述三聚磷酸钠(TPP)离子交联法为把I飞mL浓度为O.2^2 mg/mL的小球藻多肽水解液A2-1与3 10 mL浓度为广3 mg/mL的壳聚糖醋酸溶液混合均匀，再将浓度为O. Γ2 mg/mL的TPP水溶液逐渐滴加到A2-1和壳聚糖醋酸溶液体系中，搅拌反应30 min，在4 °C、·10000 r/min下高速离心30 min,收集沉淀物，将其于45°C烘箱中干燥。
全文摘要
本发明提供小球藻多肽-壳聚糖纳米粒的制备方法，其特征在于，首先采用低温超高压连续流细胞破碎机提取小球藻蛋白，木瓜蛋白酶水解小球藻蛋白,超滤离心管过滤,离子交换色谱DEAE-52和凝胶色谱葡聚糖凝胶G-25柱分离纯化,再采用三聚磷酸钠离子交联法制备小球藻多肽-壳聚糖纳米粒子。本发明制得的小球藻多肽-壳聚糖纳米粒具有抗肿瘤活性,例如,对人肝癌细胞HepG2体外生长具有一定的抑制作用，当浓度为400μg/mL时,抑制率可达32%,有利于抗肿瘤保健食品和医药产品的开发利用。
文档编号A61K47/36GK102846553SQ20121031809
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者张学武, 王晓琴 申请人:华南理工大学