APP基因在制备早期确定t(8；21)/AML1/ETO⁺AML预后制剂中的应用的制作方法

专利名称：APP基因在制备早期确定t(8；21)/AML1/ETO⁺ AML预后制剂中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因的应用，特别涉及APP基因在制备早期判断t (8 ；21)/AML1/ET0+急性髓细胞白血病预后制剂中的应用。
背景技术：
t (8 ;21)/AML1/ET0+ 急性髓细胞白血病(acute myeloid leukemia, AML)是一种异质性髓细胞肿瘤，年轻患者多见，常常出现髓外白血病(extramedulIary leukemia,EML),主要表现为髓外粒细胞肉瘤(granulocytic sarcoma,GS)和中枢神经系统白血病,文献报道GS发生率高达15-26. 7%，明显高于AML患者的发生率(2. 5% 2. 9% );椎管内为最常见发生部位；目前有关GS的发病机制尚不明确。该类型白血病长期以来被认为是预后 良好，但是近些年越来越多研究发现不同患者的OS存在显著差异，而其预后影响因素存在较大争议，尚缺乏完善的分层诊治体系。APP是一种包括由770、751或695个氨基酸组成三种异型体的糖基化跨膜蛋白，在大脑中表达丰富。APP在两种蛋白酶即β-分泌酶和Y-分泌酶的先后作用下被切割而产生三个片段sAPPP、Αβ和AICD (APP intracellular domain):即APP细胞内功能域。APP主要有以下功能(1)营养的功能，促进成纤维细胞生长；(2)细胞粘附的功能，细胞外基质(肝素、胶原)黏附，促进细胞黏附，(3) AICD可能作为一种受体，与其它蛋白/转录因子相结合而发挥基因调控作用，研究发现APP基因高表达可以异常串话Wnt/Notchl通路。目前不少研究证实APP基因在某些实体瘤中表达增高并可促进瘤细胞增殖，影响疾病预后，但具体机制尚不清楚。APP在白血病中的研究较少，对白血病的预后影响更是未有报道。国外文献报道复杂核型、伴21号染色体异常的AML患者APP mRNA表达较正常核型AML增高。我们的前期研究亦发现APP mRNA在t (8 ；21 )/AMLl/ET0+ AML患者中表达显著高于AML-M5等亚组；在Kasumi-I细胞的表达水平也明显高于其他类型髓细胞白血病。由此可见，APP与t (8 ;21)/AML1/ET0+ AML有关，但其临床意义尚不明确。深入研究APP临床意义，有助于深入研究t (8 ；21)/AML1/ET0+ AML的异质性，完善诊断分层，为寻找靶向治疗提供理论依据。

发明内容
本发明的目的在于提供APP基因在制备早期判断t (8 ;21) /AML1/ET0+急性髓细胞白血病预后制剂中的应用。本发明的另一个目的在于提供一种早期确定t (8 ;21) /AML1/ET0的检测试剂。本发明的又一个目的在于提供一种改善t (8 ；21)/AML1/ET0+急性髓细胞白血病患者预后的制剂。本发明所采取的技术方案是
发明人通过成熟的荧光定量PCR技术研究发现，APP基因在t (8; 21) /AMLI/ETO+ AML中高表达。通过荧光定量PCR检测了 44例t(8;21)/AMLl/ET0+ AML患者首次治疗前骨髓单个核细胞的APP mRNA表达量，以中位表达量为界线，彡1%者为高表达组(n=22)，< 1%者为低表达组(n=22);分别有16、10、6、2、8例检测了完全缓解(complete response, CR)后3、6、12、24月和复发时的APP mRNA表达量，同时荧光定量PCR法监测AML1/ET0融合基因表达量作为微小残留病(minimal residual disease, MRD)指标；免疫组化方法比较了 5例t (8; 2DAML和7例AML-M5患者髓外侵犯部位或白血病进展期骨髓活检病理的APP抗原表达水平的差异；Transwell方法比较了 Kasumi-I细胞被siRNA干扰APP表达前后迁移力的变化。将所测结果与临床特征、治疗反应和分析结果分析比较，APP基因高表达组患者的EML发生率为45. 5%，显著高于低表达组的9. 1%，且髓外白血病发生率与APP mRNA表达量呈正相关性；免疫组化检测髓外侵犯部位病理高表达APP抗原；siRNA技术干扰APP表达后Kasumi-I细胞迁移力显著下降，因此推测APP基因可能参与了 t(8 ；21 )/AMLl/ET0+ AML的髓外侵犯的过程。在接受相似巩固治疗情况下，中位随访28 (4-70)月，高表达组的总生存率(overall survival, OS)为 32. 8%,无复发生存率(recurrence-free survival, RFS)为 26. 6%%，均显著低于低表达组的OS 83. 9%和RFS 67. 2%。由此表明，APP基因表达量可作为判断t (8 ；21)/AMLI/ETO+ AML预后的指标，表达量高者易复发，死亡率高；表达量低者则与之相反。APP mRNA表达量与MRD水平呈一致性变化，因此动态监测APP基因水平可作为MRD监测指标之一。可见，APP基因可能参与t (8 ;21)/AML1/ET0 AML髓外浸润和发展为难治性白血病的过程，其表达量可作为判断t (8 ；21)/AML1/ET0+ AML预后的指标，动态监测其水平可作为MRD监测指标之一，为难治性白血病分子机制研究和个体化治疗方案设计提供理论依据。


图I是APP mRNA表达水平与t (8 ;21) /AML1/ET0+ AML患者EML的相关 图2是siRNA下调APP表达前后Kasumi-I细胞迁移力变化 图3是APP mRNA表达水平与t (8 ;21) /AML1/ET0+ AML患者OS的关系 图4是APP mRNA表达水平与MRD监测水平的关系图。
具体实施例方式选取南方医院2006年2月至2012年2月间经FISH或骨髓染色体培养法诊断的44例t (8 ；21)/AML1/ET0+ AML患者(男女=25 :15，中位年龄29岁)。(I)实时荧光定量PCR方法检测首次治疗前单个核骨髓细胞APP mRNA表达量，> 中位表达量为高表达组，<中位表达量为低表达组，比较两组患者临床特征(如表I所示)、缓解率、OS、RFS的差异性，42例完成彡2疗程化疗纳入CR分析，41例完成中位28 (4_70)月随访，纳入0S、RFS分析。(2)用相同方法分别检测了 16、10、6、2、8例CR后3月、6月、12月、24月、复发时骨髓APP mRNA水平，同时RQ-PCR方法监测AML1/ET0融合基因表达量作为MRD指标。(3)用免疫组化方法比较了 5例t (8; 21) /AMLI/ETO+ AML和7例AML-M5患者同一髓外侵犯部位或白血病进展期骨髓活检病理的APP抗原表达水平的差异。(4)应用Transwell方法研究比较了 Kasumi-I细胞被siRNA干扰APP表达前后迁移力变化。(5)使用SPSS17. O软件进行统计分析，选取模型为两组间比较Mann-Whitney U test,两变量之间相关分析Spearmanrank correlation analysis,率的比较chi-square test,生存分析Kaplan-Meier 曲线,单因素分析、多因素分析Cox Regression。
权利要求
1.APP基因在制备早期确定t (8 ；21)/AML1/ET0+急性髓细胞白血病预后试剂中的应用。
2.一种早期确定t (8 ;21)/AML1/ET0预后的检测试剂，其特征在于所述含有可扩增AML患者APP mRNA的引物。
3.根据权利要求2所述的检测试剂，其特征在于所述引物为TGGCCCTGGAGAACTACATC(SEQ ID NO : I)和 AATCACACGGAGGTGTGTCA (SEQ ID NO :2)。
4.一种改善t (8 ；21)/AML1/ET0+急性髓细胞白血病患者预后的制剂，由可使APP基因表达量减少的siRNA和可接受的药用辅料组成。
5.根据权利要求4所述的制剂，其特征在于所述siRNA为CATCTTTGACCGAAACGAA(SEQID NO :3)。
全文摘要
本发明公开了APP基因在制备早期判断t(8；21)/AML1/ETO+急性髓细胞白血病制剂预后中的应用。实时荧光定量PCR方法检测首次治疗前单个核骨髓细胞APPmRNA表达量，将所测结果与临床特征、治疗反应和分析结果分析比较，发现APPmRNA表达量≥1%者的髓外白血病发生率显著高于＜1%者，且髓外白血病发生率与APPmRNA表达量呈正相关性；免疫组化检测髓外侵犯部位病理高表达APP抗原；siRNA技术下调APP表达后Kasumi-1细胞迁移力显著下降，因此APP基因表达量可以预测t(8；21)/AML1/ETO+AML的髓外白血病的发生，为个体化治疗方案的设计提供理论依据。
文档编号A61K48/00GK102876778SQ20121032775
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月5日 优先权日2012年9月5日
发明者孟凡义, 余国攀, 蒋玲, 阴常欣, 王治香, 江雪杰 申请人:南方医科大学