专利名称：碱性成纤维细胞生长因子在制备治疗脊髓损伤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属医药技术领域，，具体涉及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在制备治疗脊髓损伤药物中的应用，包括对各种因素导致的脊髓原发性损伤和继发性损伤的治疗。
背景技术：
脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是一种严重的神经系统创伤,通常可导致严重的神经功能障碍和残疾，不仅影响患者个人生理及心理，而且对家庭及社会造成沉重的负担。世界上脊髓损伤瘫痪病人有上万，我国亦逾百万，据统计美国每年新增I万多伤病员，我国仅北京地区脊髓损伤发生率约800人/年，已成为高发伤病之一。 脊髓损伤可以分为原发性损伤和继发性损伤。脊髓损伤发生后，其损伤邻近部位的组织受损破坏，发生出血、坏死、为原发性损伤；随后损伤区及邻近部分发生缺血、再灌注损伤，脂质过氧化产生氧自由基损害，细胞内钙离子超载，炎症介质产生，兴奋性神经递质损害，细胞凋亡等一系列病理生理过程，称为继发性损伤。继发性损伤是一种细胞和分子水平主动调节的过程，具有可逆性。继发性损伤可加重原发性损伤，造成脊髓功能障碍，致使机体全瘫或部分瘫痪。如果能阻断此连锁反应中的某一环节，则可明显减轻继发性损伤，促进脊髓功能的恢复。而对原发性脊髓损伤治疗主要依靠外科手术，到目前为止尚无有效治疗发现，故对继发性损伤进行药物控制治疗，有可能为减轻脊髓损伤的有效途径。研究表明，脊髓损伤继发性与神经细胞凋亡有关，细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，自己结束其生命的过程。其受控于一系列基因顺序表达而发现的主动的耗能的自杀性死亡，是维持机体细胞种类和数量动态平衡的重要机制，与多种疾病的发生发展密切相关。目前已知的三条主要信号转导途径来控制细胞凋亡1、线粒体通路；2、死亡受体通路；3、内质网通路。内质网通路机制是近年来发现的一条新的凋亡途径，且很多动物实验已被初步证明内质网通路参与了脊髓损伤的继发性病理机制。内质网是真核细胞中重要的细胞器，参与蛋白质合成、折叠和寡聚化，还参与脂类代谢、类固醇代谢的合成以及Ca2+调节等。内质网非常敏感，葡糖糖/营养素的缺乏、蛋白质糖基化的抑制、二硫键形成的障碍、蛋白质运转异常、Ca2+耗竭等刺激均可导致内质网功能失调，即内质网应激。内质网应激时内质网内蛋白质不能正确折叠而被大量滞留，导致未折叠蛋白反应，激发内质网和高尔基体、细胞核之间的信号转导，抑制蛋白质合成并启动内质网相关基因转录，一定程度的内质网应激可增强内质网的应激能力，促进内质网功能恢复。但是内质网应激持续存在或过强时将诱导内质网相关性蛋白细胞凋亡，造成组织损伤。脊髓损伤时，发生的缺血缺氧、酸中毒、ATP耗竭、钙超载以及大量自由基生成等均可诱导内质网应激，从而使其在脊髓损伤发生发展中具有重要意义。未折叠蛋白应答是一种对抗内质网应激的自身保护机制，有利于细胞内环境的稳定。其由一个内质网分子伴侣GRP78和3个内质网应激感受蛋白所介导，分别是IRE-1、ATF6、PERK。无内质网应激时，IRE-1、ATF6、PERK分别与分子伴侣GRP78结合，处于无活性状态。一旦内质网应激，GRP78从3种跨膜蛋白上解离，转而去结合未折叠蛋白。解离后的感受蛋白被活化并启动为折叠蛋白应答，降低未折叠或错误折叠蛋白在内质网内的积累，通过IRE-1、ATF6、PERK三条信号途径，恢复内质网的正常功能，是一个促生存相应。长时间或过量的应激，会损伤内质网，这三条通路同时也能诱导内质网应激介导的细胞凋亡信号通路，去除无功能细胞，其并非直接诱导凋亡，而是通过激活下游凋亡信号分子CaSpaSel2和GADD153/CH0P，激酶ASK1/JUK等诱导凋亡。Caspasel2和GADD153/CH0P是内质网应激特异性的转录因子，在死亡受体和线粒体通路中不被活化。目前对于脊髓损伤治疗，在临床上尚无特殊用药，治疗不甚理想。损伤早期多用糖皮质激素(地塞米松、甲基强的松龙等)来减轻炎症反应。甲基强的松龙是目前应用最为广泛且公认最有效的治疗脊髓损伤的药物。大剂量应用甲基强的松龙可通过多种机制阻止脊髓继发性损伤的发生，但是其在临床应用中会导致病人出现过敏、休克，诱导或加重溃疡、糖尿病等相关并发症，为治疗脊髓损伤增加了一定的风险，也引起了临床医生的担忧和警惕。故研发一种副作用少且疗效和的脊髓损伤治疗药物已经成为目前研究是热的和难点。
近来研究表明，脊髓损伤后给予外源性生长因子可以促进神经功能的恢复。神经营养因子还可与其他中和轴突生长抑制因子，共同起到促进轴突生长和补充的作用。自1939年Trowell等发现原代培养的成纤维细胞分裂增殖物成纤维细胞生长因子后，发现碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)是18KD的阴离子多肽，具有广泛生物学活性，它广发存在于全身组织中，但以神经系统最为明显，它能促进神经元的存活和突起生长，是神经胶质细胞、毛细血管内皮细胞的促有丝分裂原，并能拮抗兴奋性氨基酸等对神经元的毒性作用而起到保护神经元的作用，且对神经外胚层和中胚层的多种细胞具有促增殖和分化的作用。体外实验亦证明bFGF能促进神经元存活与生长，且效用与剂量有关。其机制已有证明bFGF在动物体内可改变一些神经递质的合成，拮抗兴奋性氨基酸对神经元的毒害作用，保护受损的神经元。FGF又是一种趋化因子，对皮内细胞，成纤维细胞，星型胶质细胞均有趋化作用，提示bFGF在局部缺血性损伤的修复方面具有广泛的临床应用价值，特别是对抑制脊髓损伤继发性伤害具有重要的意义。另外bFGF能抑制疤痕疙瘩与正常成纤维细胞的胶质合成，并刺激胶原酶的表达。若再脊髓损伤中亦有此作用，可大大促进再生的神经纤维通过损伤区防止永久性疤痕及瘫痪的发生。当代医学对脊髓损伤还缺少有效的治疗和/或预防的药物。本发明制备了一种含有成纤维细胞生长因子的新型生物胶原材料，并通过细胞实验和动物实验发现，在脊髓损伤前期，生物胶原可以通过减少的内质网应激来抑制细胞凋亡，从而对脊髓损伤有明显的治疗和/或预防作用。
发明内容
本发明的目的是提供bFGF应用于制备治疗和/或预防各种原因造成的原发性脊髓损伤或继发性脊髓损伤。本发明的bFGF对各种原因造成的原发性脊髓损伤或继发性脊髓损伤有明显的治疗和/或预防作用。
具体实施例方式实施例IbFGF对实验性挤压致脊髓损伤大鼠的治疗作用动物模型和分组SD大鼠30只，体重220_250g，雌性。用以下方法制作脊髓损伤大鼠模型10%水合氯醛3.5ml/kg腹腔麻醉。俯卧固定大鼠四肢，作背部后正中切口。切开皮肤以及皮下组织，显露并咬除T8 TlO锥板和棘突。用15g动脉夹压迫脊髓2min，麻醉清醒后双下肢呈现弛缓性瘫痪。术后7日给予注射用头孢唑林50mg/kg腹腔注射每日2次，并每日给予大鼠人工排泄大小便2次。将动物随机分为3组(每组10只大鼠)假手术组只接受T8 T9椎板切除手术，下肢行动正常；对照组脊髓损伤后，不给予生物胶原材料，只给予相同剂量的生理盐水；生物胶原治疗组在脊髓损伤后在损伤脊髓面贴敷生物胶原海绵一片(IOOg)，其中含有 bFGF I. 5μ go检测指标和结果BBB评分根据BBB评分标准，分别于术后1，3，7天进行评定，并遵循双盲法观察原则，通过计分来评价动物双后肢功能状况。通过BBB评分，结果发现皮下注射生物胶原治疗组后肢恢复情况比对照组明显好转。各组损伤大鼠BBB评分结果见表I。HE染色于术后7天处死大鼠取材，石蜡包埋，切片(5 μ m)，通过苏木精-伊红染色，于镜下观察发现给予生物胶原材料后，大鼠脊髓组神经细胞凋亡明显少于对照组，见附图
I。免疫组化学染色于术后7天处死大鼠取材，石蜡包埋，切片(5 μ m)，DAB显色，发现给予生物胶原材料后，大鼠脊髓损伤处神经元和神经胶质细胞GRP78，CHOP和Caspase-12蛋白表达明显少于对照组,见附图2。Western blot :于术后7天处死大鼠取材,用化学发光试剂盒曝光、显影、定影,发现与对照组相比，生物胶原材料治疗组GRP78，CHOP和Caspase-12表达明显减少，见附图3 ；而神经保护因子stathmin和GAP-43表达明显增加,见附图4。表I各组脊髓损伤大鼠不同时间点BBB评分比较(X土s)
权利要求
1.本发明涉及医药技术领域，特别涉及碱性成纤维细胞生长因子(bFG F)在制备治疗脊髄损伤药物中的应用，包括各种因素导致的脊髄原发性损伤和继发性损伤的治疗。
全文摘要
本发明属医药技术领域，具体涉及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在制备治疗脊髓损伤，包括各种因素导致的脊髓原发性损伤和继发性损伤中的应用。bFGF在制备治疗脊髓损伤药物中的应用，药物的形式可以是粉针剂、水剂、脂质体等。bFGF可以抑制内质网应激，减少内质网引起的脊髓神经元凋亡，从而对脊髓损伤产生治疗作用。
文档编号A61P25/28GK102847139SQ201210327589
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月13日 优先权日2012年8月13日
发明者肖健, 李校堃, 张宏宇, 张谢, 王周光, 王晓杰 申请人:温州医学院