专利名称：一种抗菌药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于制药领域，具体地说，涉及一种抗菌药物组合物及其应用。
背景技术：
感染性疾病是威胁人类生命健康的常见多发病，也是多器官疾病的重要合并症和死因之一。抗感染药物的应用大大降低了感染性疾病的死亡。常用的抗感染药物包括β_内酰胺类抗生素、喹诺酮类抗生素、氨基糖苷类抗生素等。其作用机制包括抑制细菌细胞壁合成，抑制细胞膜的某些功能，抑制蛋白质合成，抑制核酸合成，抑制叶酸合成等。D-氨基酸天然存在于许多生物中，发挥特定功能，如D-丙氨酸和D-谷氨酸是细菌细胞壁的重要组分，而D-丝氨酸为人类的神经递质等。但通常状况下，这些相对稀有的氨 基酸在菌体内浓度很低。而近期报道发现细菌在稳态期时产生的各种D-氨基酸可累积达到毫摩尔水平，提示D-氨基酸与细菌的生理状态相关。生物被膜是由细菌粘附于接触表面，分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等，将其自身包埋其中而形成的大量细菌聚集膜样物。多种细菌可形成生物被膜(如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌等)。细菌生物被膜形成是导致某些慢性感染反复发作难以治愈和细菌耐药性产生的重要原因，其机制主要包括对抗生素的渗透性降低；吸附抗生素灭活酶，灭活抗生素；细菌代谢减缓，呈“亚冬眠状态”，对抗生素的敏感性降低(形成生物被膜的细菌对药物的敏感性比游离状态的细菌低1000倍以上);逃避机体免疫系统的清除作用等。而最近研究发现，纳摩尔水平的D-氨基酸混合物可以使形成生物被膜的枯草杆菌等菌株重回游离状态，从而恢复菌株对抗生素的敏感性，并且基于许多菌株都可以产生D-氨基酸的事实，推测D-氨基酸可能是生物被膜解离的通用信号。由于传统抗感染药物治疗的用药策略上存在弊端，加上药物滥用问题严重，从而对微生态平衡产生了严重影响。在抗生素选择压力下，出现如MRSA (耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、VRE (耐万古霉素肠球菌)、PRSP (耐青霉素肺炎链球菌)等革兰氏阳性耐药菌和多药耐药革兰氏阴性菌如鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等，而耐药菌治疗非常棘手，使感染死亡率急剧上升，对全人类的健康构成了严重威胁(Clin MicrobiolRev,22(4):582-610，2009)。我国细菌耐药形势严峻，多药耐药G-菌感染问题严重，对碳青霉烯类抗生素耐药的铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌在临床上广泛流行，治疗困难，甚至无药可治。在美国MRSA成为感染性疾病的首要致死原因，超级细菌NDM-I在全球的暴发和流行，更引起全球的高度关注。而且细菌耐药基因还常位于可移动元件上，从而加速了耐药基因在不同菌株间的传播。因此迫切需要加强对抗耐药菌药物的研发。许多耐药基因来源于环境中的非致病菌，非致病菌携带的强大耐药系统包含对天然、半合成和全合成抗生素的耐药元件，耐药的产生似乎是不可避免的。近几十年来很少有新类型的抗生素问世，而将抗生素和其他生物活性分子的抗菌佐剂与现有抗生素联合用药为新型抗耐药菌药物的开发提供了新思路。
发明内容
本发明的目的是提供D-氨基酸在增强抗菌药物的抗菌活性中的应用。本发明的另一目的是提供一种新型抗菌药物组合物及其应用。本发明的再一目的是提供D-氨基酸与抗菌药物联合用药在感染性疾病治疗方面的应用。为了实现本发明目的，本发明的一种抗菌药物组合物，由两种组分构成，一种为D-氨基酸，另一种为抗菌活性药物和/或其衍生物；其中，所述D-氨基酸为D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-蛋氨酸、D-苏氨酸、D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-脯氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-半胱氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-天冬氨酸、D-组氨酸、D-天冬酰胺和不具备D L分型的甘氨酸中的一种或多种；所述抗菌活性药物和/或其衍生物为β -内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、喹诺酮类抗生素、大环内酯类抗生素、氯霉素类抗生素、糖肽类抗生素或磷霉素等中的一种或多种。 前述的抗菌药物组合物中D-氨基酸的浓度范围是O. OOlmM^lOM0组合物中D-氨基酸的种类及浓度的选择，依据拟作用的菌株、抗生素的种类而不同，优选对该抗生素抗特定菌株影响明显(MIC值越低)的一种或多种D-氨基酸联合用药。最终目的是获得一系列可分别有效对抗特定菌株感染的D-氨基酸抗菌药物组合物。前述抗菌药物组合物的制备方法包括两种，第一种为首先将两种组分D-氨基酸、抗菌活性药物和/或其衍生物分别用水或合适溶剂(根据D-氨基酸、抗菌活性药物选择)配制成母液，然后根据抗菌药物活性及所需D-氨基酸浓度配制成两者联合用药液。第二种为按比例混合D-氨基酸、抗菌活性药物和/或其衍生物，然后加入水或合适溶剂(根据D-氨基酸、抗菌活性药物选择)直接配制成两者联合用药液。比如，用于溶解D-亮氨酸、亚胺培南、红霉素、氯霉素的溶剂分别为IM盐酸溶液、O. OlM磷酸盐缓冲液(pH7. 2),95%乙醇或冰醋酸、95%乙醇。本发明还提供所述抗菌药物组合物在制备抗感染药物中的应用。该抗感染药物的抗菌谱为革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌及它们的耐药菌。优选地，所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌等中的一种或多种。所述革兰氏阴性细菌为鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、摩根摩氏菌、异型枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、雷极氏普鲁菲登杆菌等中的一种或多种。本发明进一步提供D-氨基酸与抗菌药物联合用药在感染性疾病治疗方面的应用，包括I) D-氨基酸与抗菌药物制成复合制剂联合用药；或2) D-氨基酸和抗菌药物依次用药，即先给予D-氨基酸，后给予抗菌药物；或先给予抗菌药物，后给予D-氨基酸。本发明首次将D-氨基酸与现有抗菌药物进行科学、合理地组合，通过D-氨基酸干扰细菌生理代谢的作用来增强抗菌药物的抗菌活性，为应对日益严重的细菌耐药性问题提供了一条崭新的途径。本发明提供的抗菌药物组合物及联合用药的方法相对于传统的新药研发而言具有高效、快速、费用低廉、可选组合多等优点，且已在体内外抗感染研究中显示出良好的抗菌活性。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例I D-丝氨酸与美罗培南联合用药液的配制I.称取D-丝氨酸粉末(分子量105. 09，纯度98%) O. 429g，用无菌水定容至10ml，无菌过滤，得O. 4M母液。2.取O. 4M D-丝氨酸母液O. 25ml，用无菌水定容至10ml，得IOmMD-丝氨酸母液。3.取IOmM D-丝氨酸母液O. Iml,用无菌水定容至IOml,得O. ImM D-丝氨酸母液。4.称取美罗培南粉末(纯度99. 1% ;水分12. 4%) 57. 6mg，用无菌水定容至10ml，无菌过滤，得5mg/mL母液。 5.将O. 4M D-丝氨酸母液O. 25ml和5mg/ml美罗培南母液O. 512ml混合，用无菌水定容至IOml,即得IOmM D-丝氨酸与256 μ g/ml美罗培南的联合用药液。6.将IOmM D-丝氨酸母液O. Iml和5mg/ml美罗培南母液O. 512ml混合,用无菌水定容至IOml,即得O. ImM D-丝氨酸与256 μ g/ml美罗培南的联合用药液。7.将O. ImM D-丝氨酸母液O. Iml和5mg/ml美罗培南母液O. 512ml混合,用无菌水定容至10ml，即得O. OOlmM D-丝氨酸与256 μ g/ml美罗培南的联合用药液。实施例2 D-丝氨酸与美罗培南联合用药液的配制I.称取D-丝氨酸粉末(分子量105. 09，纯度98%) 3. 43g。2.称取美罗培南粉末(纯度99. 1% ;水分12. 4%) 115. 2g。3.将两者混合，用无菌水定容至10ml，即得3. 2M D-丝氨酸和10mg/ml美罗培南的联合用药液。由其它D-氨基酸与抗菌活性药物和/或其衍生物组成的抗菌药物组合物的制备比照实施例I或实施例2中的描述进行。实施例3 D-丝氨酸与美罗培南联合用药的抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)活性研究I.取D-丝氨酸(购自Sigma公司),用无菌水配制成O. 4M母液,过滤备用。美罗培南粉针剂(购自石药集团河北中润制药有限公司)，用无菌水配制为5mg/mL母液。2.将美罗培南分别用含0mM、0. 2mM、2mM和20mM D-丝氨酸的MH肉汤培养基进行二倍浓度梯度稀释，浓度范围为64 μ g/mL-O. 03 μ g/mL。将各浓度药液按100 μ L/孔的量加入无菌96孔板中。同时设不含美罗培南的菌株生长对照。3.将MRSA标准菌株ATCC 33591、ATCC 43300、N315，以及北京地区临床分离株06-3、06-16、06-23、06-37、08-6、08-26、08-32、08-36、08-44、08-45、08-48、08-50 分别接种于ImL MH肉汤培养基中，37° C培养过夜。4.将过夜培养的菌液调至O. 5麦氏浊度(约为I. OX 108CFU/mL)，然后按20倍浓度梯度稀释作为接种菌液，接种量为10 μ L/孔，接种浓度约为5. OX 105CFU/mL。5.将96孔培养板适当包裹，防止液体过度蒸发，置于37° C培养16_18h。6.取出96孔培养板，观察结果，无菌生长的最小抗生素浓度即为最小抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration, MIC)。结果如表 I 所不。
表ID-丝氨酸对美罗培南抗MRSA活性的影响结果
权利要求
1.D-氨基酸在增强抗菌药物的抗菌活性中的应用。
2.一种抗菌药物组合物，其特征在于，由两种组分构成，一种为D-氨基酸,另一种为抗菌活性药物和/或其衍生物。
3.根据权利要求2所述的抗菌药物组合物，其特征在于，所述D-氨基酸为D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-蛋氨酸、D-苏氨酸、D-苯丙氨酸、D-谷氨酸、D-谷氨酰胺、D-脯氨酸、D-精氨酸、D-赖氨酸、D-半胱氨酸、D-缬氨酸、D-亮氨酸、D-异亮氨酸、D-色氨酸、D-酪氨酸、D-天冬氨酸、D-组氨酸、D-天冬酰胺和不具备D L分型的甘氨酸中的一种或多种； 所述抗菌活性药物和/或其衍生物为β -内酰胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、喹诺酮类抗生素、大环内酯类抗生素、氯霉素类抗生素、糖肽类抗生素或磷霉素中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的抗菌药物组合物，其特征在于，所述组合物中D-氨基酸的浓度范围是O. OOlmM^lOM0
5.权利要求2-4任一项所述的抗菌药物组合物的制备方法，所述方法为首先将两种组分D-氨基酸、抗菌活性药物和/或其衍生物分别配制成母液，然后根据抗菌药物活性及所需D-氨基酸浓度配制成两者联合用药液。
6.权利要求2-4任一项所述的抗菌药物组合物的制备方法，所述方法为按比例混合D-氨基酸、抗菌活性药物和/或其衍生物，然后配制成两者联合用药液。
7.权利要求2-4任一项所述的抗菌药物组合物在制备抗感染药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述抗感染药物的抗菌谱为革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌及它们的耐药菌。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阳性细菌为金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、化脓链球菌中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述革兰氏阴性细菌为鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、粘质沙雷氏菌、奇异变形杆菌、普通变形杆菌、摩根摩氏菌、异型枸橼酸杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、雷极氏普鲁菲登杆菌中的一种或多种。
全文摘要
本发明提供一种新型的抗菌药物组合物及其应用，该抗菌药物组合物由两种组分构成，一种为D-氨基酸，另一种为抗菌活性药物和/或其衍生物。本发明首次将D-氨基酸与现有抗菌药物进行组合，通过D-氨基酸干扰细菌生理代谢的作用来增强抗菌药物的抗菌活性，为应对日益严重的细菌耐药性问题提供了一条崭新的途径。本发明提供的抗菌药物组合物及联合用药的方法相对于传统的新药研发而言具有高效、快速、费用低廉、可选组合多等优点，且已在体内外抗感染研究中显示出良好的抗菌活性。
文档编号A61K31/401GK102871996SQ20121033369
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月10日 优先权日2012年9月10日
发明者李聪然, 游雪甫, 张健美, 胡辛欣, 王青, 杨信怡, 李国庆, 张伟新, 王秀坤, 庞晶 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所