专利名称：一种细胞灭活疫苗、卵黄抗体及卵黄抗体的注射液和冻干粉的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种细胞灭活疫苗、卵黄抗体及卵黄抗体的注射液和冻干粉，属于疾病免疫领域。
背景技术：
猪圆环病毒2型(PVC2)是断奶仔猪多系统衰竭综合症和肾病皮炎综合症的主要病原，同时该病还会造成免疫抑制，容易造成其他疾病的继发或并发感染，具有高发生率、高流行性、高致病性、高死亡性等特点,给养猪业造成了巨大的经济损失。PVC2的致病机制尚不清楚，其对猪免疫系统的破坏被认为是引起相关猪病的主要原因。由于免疫力下降，猪在应激和病原感染时容易遭受其他病原侵袭，其临床症状主要为进行性消痩、贫血和黄疸。现在防治手段有抗病毒药、中药等，但效果不佳。鸡卵黄抗体IgY是鸡的ー种免疫球蛋白Ig，鸡IgY在功能上相当于哺乳动物IgG，但结构上有所不同，具有典型的的免疫球蛋白的空间构象。鸡卵黄抗体具有很多优越性
(I)由于鸟类与哺乳类动物种系发生学的差距，鸟类更适于生产抗哺乳动物抗原的特异性抗体。卵黄抗体不会激发补体系统，不与抗哺乳动物抗原的抗体发生反应，不与哺乳动物和细菌的Fe受体结合，这在免疫诊断中具有重要意义。(2)卵黄抗体作为ー种具有生物活性的免疫球蛋白，在贮存、生产、加工、摄食及消化过程中保证其稳定性是非常关键的。多项试验表明，鸡IgY具有较好的稳定性，耐酸、耐碱、耐热。卵黄抗体较易保存，4°C条件下存放5年或室温条件下存放6个月对抗体活性无明显影响。(3)卵黄抗体量大，成本低，便于规模化生产。卵黄中抗体浓度能长期维持在相当于甚至超过血清抗体浓度的水平上。I只产蛋鸡(以平均每周产蛋5飞枚，平均每枚鸡蛋蛋黄大约15mL计算)所产蛋生产的抗体量相当于9(Tl00mL血清或18(T200mL血液中抗体的量，例如I只兔子I个月可提取IgG约200mg，而I个月I只蛋鸡可从蛋中提取IgY2000mg以上。此外，在实际生产中，动物的采血不仅对动物本身是极大的应激，而且费时、费エ，大規模生产是不切实际的，而利用蛋鸡生产抗体要方便的多。总的来讲，卵黄抗体对动物没有毒副作用，用高免卵黄抗体治疗动物疾病不但避免了高免血清价格昂贵、产量低的缺点，而且可以避免高免血清在治疗过程中引起的副作用，是ー种很有前途的新型免疫球蛋白制剂。目前卵黄抗体的制备及生产エ艺已经成熟，可以保质保量的生产，卵黄抗体在禽畜疾病诊断、治疗和预防的应用越来越多。但是，目前抗猪圆环病毒2型疫苗的治疗比较単一，而且卵黄抗体制备方法繁琐，抗体的损失较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种细胞灭活疫苗。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案提供一种细胞灭活疫苗，由以下方法制备获得I)取病料制成匀浆，反复冻融后以10000-12000rpm离心15_20min，取上清液，过滤，接种敏感单层PK-15细胞；2)将PK-15细胞连续传代，细胞冻融，提取PCV2病毒的DNA，针对PCV2病毒ORFl基因，由具有序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列以及SEQ ID NO :3和SEQID NO 4的核苷酸序列组成的两对特异性PCR引物对目的基因扩增；3)扩增产物克隆入PMD-18T载体进行测序，鉴定；4)筛选多个具有抗原免疫活性的病毒表位，经过特异引物PCR、产物电泳、测序、克隆、纯化、检测每个表位的蛋白免疫活性，选择5个抗原表位点；5)将5个抗原表位点连接，插入到鹅圆环病毒标准毒株基因中，然后病毒在敏感性细胞PK-15单层上传代，获得免疫原性的毒株；6)扩大增殖,用IPMA法测定病毒效价； 7)当病毒在PK-15细胞中传代表现稳定细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在103-9TCID50/1. 0ml，收集细胞，甲醛灭活加弗式佐剂制得细胞灭活疫苗。所述的步骤I)中细胞反复冻融3次。所述的步骤I)中过滤采用0. 22 ii m滤膜。所述的步骤2)中PK-15细胞连续传代6代，步骤5)病毒在细胞PK-15单层上传代45代。本发明的目的还在于提供一种细胞灭活疫苗制备的卵黄抗体。本发明的技术方案还在于提供一种细胞灭活疫苗制备的卵黄抗体，由以下方法制备获得I)用细菌灭活疫苗，每间隔7-10天对健康产蛋鸡群进行基础免疫、加强免疫和强化免疫三次免疫，加强免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达I :64、鹅圆环病毒抗体效价达I :64以上时，收集高免蛋；2)清理、消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液；3)向卵黄原液中加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；4)将卵黄溶液放入60-65°C水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH4. 9-5. 2温度4-60C的酸化水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，15000rpm离心20min,取上清液；5)向上清液中加入辛酸，辛酸加入量为溶液体积的0. 8-1. 0%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，20000rpm离心lOmin，取上清液，静置；6)用0. 45 ii m的滤膜对步骤5)所得上清液过滤，得到卵黄抗体溶液，再经MCW300KD的滤膜过滤，得到精制的含有卵黄抗体的溶液。所述的步骤I)中基础免疫接种细菌灭活疫苗的量为I. 5ml，加强免疫和強化免疫接种加量I倍。所述的步骤4)中酸化水溶液是盐酸配制的酸化水，预冷时间为l_2h。本发明的目的还在于提供含有卵黄抗体的注射液。本发明的技术方案还在于提供含有卵黄抗体的注射液，该卵黄抗体注射液包括卵黄抗体溶液I份、甲醛0. 002-0. 003份和硫柳汞0. 0001-0. 0002份。本发明的目的还在于提供含有卵黄抗体的冻干粉。本发明的技术方案还在于提供含有卵黄抗体的冻干粉，该卵黄抗体冻干粉包括卵黄抗体溶液I份、甲醛0. 002-0. 003份、硫柳汞0. 0001-0. 0002份、葡萄糖0. 03-0. 04份、山梨醇0. 01-0. 02份、甘氨酸0. 02-0. 03份和甘露醇0. 030. 04份。本发明采用了最新的冷热酸化处理卵黄液技术，消毒和酸化处理同步进行，減少了生产步骤，也相对减少抗体的损失，该产品是ー种畜禽可以同时用的生物制剂，相比生产相应的血清制品，減少成本和劳动强度。该产品采用基因整合技术、克隆等选先进技术制成的疫苗增加其免疫原性和抗体治疗范围，将猪的圆环病毒基因插入到鹅圆环病毒基因组中，增强对鹅圆环病毒的免疫原性和对鹅机体的免疫系统的刺激，使其产生抗体要比単一使用猪圆环病毒疫苗产生的卵黄抗体效价高，临床应用效果好，同时产生鹅的圆环抗体对猪圆环疾病具有辅助治疗效果。
具体实施例方式本发明的病料采集自山东地区发生严重猪圆环病的猪场。 实施例I本实施例提供的细胞灭活疫苗，由以下方法制备获得I)取病料制成匀浆，反复冻融3次后，10000-12000rpm离心15_20min，取上清液，经0. 22 ii m滤膜过滤，接种敏感单层PK-15细胞；2)将PK-15细胞连续传代，细胞冻融，提取PCV2病毒的DNA，针对PCV2病毒ORFl基因，由具有序列表中SEQ ID NO :1和SEQ ID NO :2的核苷酸序列以及SEQ ID NO :3和SEQID NO 4的核苷酸序列组成的两对特异性PCR引物对目的基因扩增，其中，引物1PCV2. I :5，-TTCGGTACCAGCTATGACGTATCCAAG-3’ (SEQ ID NO 1),PCV2. 2 :5’-GCCAAGCTTTCACTTCGTAATGGTTTT-3’ (SEQ ID NO 2)；引物2PCV2. I :5，-TTGGCCTAAGCTATGACGTATCCAA-3’ (SEQ ID NO 3),PCV2. 2 :5’-CCAAGCTTTCACTTCGTTGAAGTTT-3’ (SEQ ID NO 4)；3)扩增产物克隆入PMD-18T载体进行测序，鉴定；4)筛选多个具有抗原免疫活性的病毒表位，经过特异引物PCR、产物电泳、测序、克隆、纯化、检测每个表位的蛋白免疫活性，选择5个抗原表位点；5)用拼接技术将5个抗原表位点连接，插入到鹅圆环病毒标准毒株基因中，然后病毒在敏感性细胞PK-15单层上传代45代，获得免疫原性的毒株；6)扩大増殖，用IPMA法测定病毒效价；7)当病毒在PK-15细胞中传代表现稳定细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在103-9TCID50/1. 0ml，收集细胞，甲醛灭活加弗式佐剂混匀制得细胞灭活疫苗。实施例2本实施例提供的卵黄抗体，由以下方法制备获得I)用细菌灭活疫苗，每间隔7天对健康产蛋鸡群进行基础免疫、加强免疫和強化免疫三次免疫，基础免疫接种疫苗I. 5ml，加强免疫和強化免疫接种加量I倍，加强免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达I :64、鹅圆环病毒抗体效价达I :64以上吋，收集闻免蛋；2)流水清理、84消毒液消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液；3)向卵黄原液中加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；
4)将卵黄溶液放入60°C水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH4. 9温度4°C的盐酸水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，15000rpm离心20min，
取上清液；5)向上清液中加入辛酸，辛酸加入量为溶液体积的0. 8%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，20000rpm离心IOmin,取上清液,静置；6)用0. 45 ii m的滤膜对步骤5)所得上清液过滤，得到卵黄抗体溶液，再经MCW300KD的滤膜过滤，得到精制的含有卵黄抗体的溶液。实施例3本实施例提供的卵黄抗体，由以下方法制备获得 I)用细菌灭活疫苗，每间隔10天对健康产蛋鸡群进行基础免疫、加强免疫和強化免疫三次免疫，基础免疫接种疫苗I. 5ml，加强免疫和強化免疫接种加量I倍，加强免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达I :64、鹅圆环病毒抗体效价达I :64以上吋，收集闻免蛋；2)流水清理、新洁尔灭消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液；3)向卵黄原液中加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；4)将卵黄溶液放入65°C水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH5. 2温度6°C的盐酸水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，15000rpm离心20min，取上清液；5)向上清液中加入辛酸，辛酸加入量为溶液体积的I. 0%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，20000rpm离心IOmin,取上清液,静置；6)用0. 45 ii m的滤膜对步骤5)所得上清液过滤，得到卵黄抗体溶液，再经MCW300KD的滤膜过滤，得到精制的含有卵黄抗体的溶液。实施例4本实施例提供的卵黄抗体，由以下方法制备获得I)用细菌灭活疫苗，每间隔8天对健康产蛋鸡群进行基础免疫、加强免疫和強化免疫三次免疫，基础免疫接种疫苗I. 5ml，加强免疫和強化免疫接种加量I倍，加强免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达I :64、鹅圆环病毒抗体效价达I :64以上吋，收集闻免蛋；2)流水清理、新洁尔灭消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液；3)向卵黄原液中加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液；4)将卵黄溶液放入63°C水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH5. 0温度5°C的盐酸水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，15000rpm离心20min，取上清液；5)向上清液中加入辛酸，辛酸加入量为溶液体积的0. 9%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，20000rpm离心IOmin,取上清液,静置；6)用0. 45 ii m的滤膜对步骤5)所得上清液过滤，得到卵黄抗体溶液，再经MCW300KD的滤膜过滤，得到精制的含有卵黄抗体的溶液。实施例5本实施例提供的含有实施例2卵黄抗体的注射液，包括实施例2卵黄抗体溶液I份、甲醛0. 002份，硫柳汞0. 0001份。卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤将实施例2精制的卵黄抗体溶液I份，经除菌滤膜过滤，取滤液，加入0. 002份甲醛和0. 0001份硫柳汞，得到卵黄抗体注射液。为了检测本实施例卵黄抗体注射液在常温下的放置时抗体效价变化，以此来确定本产品的保质期，做了以下试验将本品保存在37°C培养箱中，保存24个月，分别I周、2周、I月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散(AGP)法，测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化，结果见表I。表I常温放置注射液不同时间段效价的变化
项_ I周 2周 I月 2月 4月 8月 12 JI 16 JI 20月24月PCV-2 I 32 I 32 I； 32 I 32 I 32 I； 32 I 16 I 16 I 16 I 16GOCV I: 32 I 32 I 32 I； 32 I 32 I 32 I 16 I 16 I； 16 I； 16 质量标准[性状]本品为淡黄色，呈致密的团块。[无菌检验]按《中国兽药典》进行，无菌生长。[支原体检验]按《中国兽药典》进行，无支原体生长。[外源病毒检验]按《中国兽药典》进行，符合規定。[安全检验]用12日龄SPF鸡5只，各肌肉注射羽份，观察2周，应全部健活，注射部位没有病变。[保质期]根据常温效价检测实验结果，可以存放2年。[效カ检验]按生产的规格进行稀释至I头份/mL。I)保护カ检测用保育猪30只，分为3组，每组10只，分别为试验组、对照组和空白组。向试验组的10只猪肌肉注射0. lmL/kg卵黄抗体注射液，对照组和空白组隔离饲养。24h后，取试验组和对照组保育猪肌注接种稀释细胞病毒液，记录96h死亡情況，试验组的保护率在96%以上，攻毒对照组死亡率在82%以上，空白组猪无任何变化。2)治愈力測定用保育猪30只，10只作为阴性对照组，20只接种稀释后的细胞病毒液，感染12h后，其中10只作为治疗组，每只肌肉注射本品0. lmL/kg，毎日I次，连续3日，另10只作为阳性对照组，隔离饲养。治疗后72h，记录各组死亡情況，攻毒阳性对照组死亡率83%以上，治疗组存活率在90%以上，健康阴性对照组10只无任何变化。实施例6本实施例提供的含有实施例3卵黄抗体的注射液，包括实施例3卵黄抗体溶液I份、甲醛0. 003份，硫柳汞0. 0002份。卵黄抗体注射液的制备方法，包括以下步骤将实施例3精制的卵黄抗体溶液I份，经除菌滤膜过滤，取滤液，加入0. 003份甲醛和0. 0002份硫柳汞，得到卵黄抗体注射液。为了检测本实施例卵黄抗体注射液在常温下的放置时抗体效价变化，以此来确定本产品的保质期，做了以下试验将本品保存在37°C培养箱中，保存24个月，分别I周、2周、I月、2月、4月、8月、12月、16月、20月、24月后，用琼脂扩散(AGP)法，测定每个时间点取样品的卵黄抗体效价变化，结果见表2。表2常温放置注射液不同时间段效价的变化
权利要求
1.一种细胞灭活疫苗，其特征在于，由以下方法制备获得 1)取病料制成匀浆，反复冻融后离心，10000-12000rpm离心15_20min，取上清液，过滤，接种敏感单层PK-15细胞； 2)将PK-15细胞连续传代，细胞冻融，提取PCV2病毒的DNA，针对PCV2病毒ORFl基因，由具有序列表中SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2的核苷酸序列以及SEQ ID NO 3和SEQ IDNO 4的核苷酸序列组成的两对特异性PCR引物对目的基因扩增； 3)扩增产物克隆入PMD-18T载体进行测序，鉴定； 4)筛选多个具有抗原免疫活性的病毒表位，经过特异引物PCR、产物电泳、测序、克隆、纯化、检测每个表位的蛋白免疫活性，选择5个抗原表位点； 5)将5个抗原表位点连接，插入到鹅圆环病毒标准毒株基因中，然后病毒在敏感性细 胞PK-15单层上传代，获得免疫原性的毒株； 6)扩大增殖,用IPMA法测定病毒效价； 7)当病毒在PK-15细胞中传代表现稳定细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在103-9TCID50/1. 0ml，收集细胞，甲醛灭活加弗式佐剂制得细胞灭活疫苗。
2.根据权利要求I所述的一种细胞灭活疫苗，其特征在于，所述的步骤I)中细胞反复冻融3次。
3.根据权利要求I所述的一种细胞灭活疫苗，其特征在于，所述的步骤I)中过滤采用O.22 μ m 滤膜。
4.根据权利要求I所述的一种细胞灭活疫苗，其特征在于，所述的步骤2)中PK-15细胞连续传代6代，步骤5)病毒在细胞PK-15单层上传代45代。
5.一种如权利要求I所述的细胞灭活疫苗制备的卵黄抗体，其特征在于，由以下方法制备获得 1)用细菌灭活疫苗，每间隔7-10天对健康产蛋鸡群进行基础免疫、加强免疫和强化免疫三次免疫，加强免疫后开始检测抗体效价，当猪圆环病毒抗体效价达I :64、鹅圆环病毒抗体效价达I :64以上时，收集高免蛋； 2)清理、消毒高免蛋，晾干，无菌术取卵黄，得到卵黄原液； 3)向卵黄原液中加入等体积的无菌水，搅拌混匀至颜色发白，得到卵黄溶液； 4)将卵黄溶液放入60-65°C水浴锅内均匀加热30min，然后加入pH4.9-5. 2温度4_6°C的酸化水溶液，加入量为卵黄溶液体积的6倍，混匀，静置沉淀，取上清液，15000rpm离心20min,取上清液； 5)向上清液中加入辛酸，辛酸加入量为溶液体积的O.8-1. 0%，混匀，静置，弃去杂质漂浮物，20000rpm离心IOmin,取上清液,静置； 6)用O.45 μ m的滤膜对步骤5)所得上清液过滤，得到卵黄抗体溶液，再经型号MCW300KD的滤膜过滤，得到精制的含有卵黄抗体的溶液。
6.根据权利要求5所述的一种卵黄抗体，其特征在于，所述的步骤I)中基础免疫接种细菌灭活疫苗的量为I. 5ml，强化免疫和强化免疫接种加量I倍。
7.根据权利要求5所述的一种卵黄抗体，其特征在于，所述的步骤4)中酸化水溶液是盐酸配制的酸化水，预冷时间为l_2h。
8.一种含有如权利要求5所述的卵黄抗体的注射液，其特征在于，包括卵黄抗体溶液I份、甲醛O. 002-0. 003份和硫柳汞O. 0001-0. 0002份。
9.一种含有如权利要求5所述的卵黄抗体的冻干粉,其特征在于，包括卵黄抗体溶液I份、甲醛O. 002-0. 003份、硫柳汞O. 0001-0. 0002份、葡萄糖O. 03-0. 04份、山梨醇O.01-0. 02份、甘氨酸O. 02-0. 03份和甘露醇O. 02-0. 03份。
全文摘要
本发明公开了一种细胞灭活疫苗，该疫苗同时包含猪圆环病毒抗原表位和鹅圆环病毒抗原表位，由以下方法制得从猪圆环病毒中选筛出高致病性毒株，并从毒株中挑选出多个具有抗原免疫活性的病毒表位，并将这些抗原表位点连接后插入到鹅圆环病毒基因组中增殖，甲醛灭活加弗式佐剂即得细胞灭活疫苗。本发明同时公开了该细胞灭活疫苗制得的卵黄抗体、卵黄抗体注射液和冻干粉，本产品将猪的圆环病毒基因插入到鹅圆环病毒基因组中，增强对鹅圆环病毒的免疫原性和对鹅机体的免疫系统的刺激，使其产生抗体要比单一使用猪圆环病毒疫苗产生的卵黄抗体效价高，临床应用效果好，同时产生鹅的圆环抗体对猪圆环疾病具有辅助治疗效果。
文档编号A61P31/20GK102861327SQ201210364920
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者吴红云, 郭俊清, 徐进 申请人:郑州后羿制药有限公司