专利名称：一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种采用现代药剂学技术制备的肝癌靶向治疗新制剂。超声波辐照产生的生物效应使肿瘤血流量增多，血管通透性加大，进而使多烯紫杉醇纳米粒大量聚集在肿瘤局部，并通过受体介导的内吞途径进入肿瘤细胞内，从物理学、生物学双重途径发挥肝癌革巴向治疗作用。
背景技术：
肝癌全球发病率已超过62. 6万/年，其中55%的病例发生在中国。目前肝癌的治疗手段主要有外科手术切除和局部介入治疗，各种技术尤其是肿瘤局部消融技术发展迅猛并广泛应用于临床。但研究结果表明，肝癌患者的5年生存率并没有明显提高。因此，探索更为有效的肝癌治疗方法对延长患者的生命，提高生活质量具有极为重要的意义。·
多烯紫杉醇是一种半合成抗肿瘤药物，已经广泛应用于如乳腺癌、非小细胞肺癌、前列腺癌、胃癌和头颈部肿瘤等多种恶性肿瘤的化疗。体内外研究表明，多烯紫杉醇具有较强的抗肝细胞癌作用。但由于多烯紫杉醇难溶于水，目前临床上使用制剂多采用吐温增溶，容易引起过敏反应。此外，系统化疗引起的骨髓抑制、神经、心脏及肝肾毒性等不良反应较明显。因此，改变多烯紫杉醇剂型，提高其水溶性与肿瘤靶向性，对提高其抗肿瘤疗效、降低毒副作用具有重要意义。肿瘤靶向治疗是现代肿瘤治疗研究的重点与热点之一，其利用特异性载体，将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性成分选择性地运送到肿瘤靶部位，具有高效、低毒的抗肿瘤优势。肝癌细胞表面存在去唾液酸糖蛋白受体，可特异性识别末端带有半乳糖残基的糖蛋白并与之结合，再通过细胞内吞作用，主动转入细胞内发挥抗肿瘤作用。去唾液酸糖蛋白受体已经成为肝癌靶向治疗研究的重要靶点之一。
单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸是一种两嵌段聚合物，常用于制备各种载药纳米粒。疏水性的聚乳酸羟基乙酸位于纳米粒的核心，包裹各种难溶性抗肿瘤药物。亲水性的聚乙二醇分布在纳米粒表面，明显改善了纳米粒的亲水性和表面稳定性，并可显著减少网状内皮系统对纳米粒的摄取清除作用，使纳米粒具有长循环的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂以及在制备烯紫杉醇靶向纳米粒联合超声辐照治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的目的是这样实现的，所述的一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂，为乳化-溶剂挥发法制备的多烯紫杉醇靶向纳米粒，采用单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸、多烯紫杉醇和半乳糖化胆固醇溶于二氯甲烷形成有机相；吸取有机相，缓缓注入到聚乙烯醇水溶液中，超声乳化，获得的乳化液倒入另一聚乙烯醇水溶液中，搅拌去除二氯甲烷，经聚碳酸酯膜过滤，真空冷冻干燥，6tlCo辐照灭菌后获得多烯紫杉醇靶向纳米粒。所制得的多烯紫杉醇靶向纳米粒的平均粒径为209. 3nm,多元分散系数为O. 40 ；多烯紫杉醇靶向纳米粒的载药率为3. 79%。本发明所述的一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂的制备方法，步骤为精密称取IOOmg单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸轻基乙酸、5mg多烯紫杉醇、15mg半乳糖化胆固醇Gal-C4-Chol，溶于I ml 二氯甲烷，60°C涡旋震荡，使其充分溶解，为有机相；用注射器吸取有机相，缓缓注入到3ml 5 % (体积分数)聚乙烯醇水溶液中，超声乳化，50 W,工作30 sec，间歇5 sec，乳化5次，乳化液倒入到8ml I % (体积分数)聚乙烯醇溶液，磁力搅拌去除二氯甲烷，聚碳酸酯膜过滤，真空冷冻干燥，6°Co辐照灭菌后4°C保存。本发明所述的一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂在制备烯紫杉醇靶向纳米粒联合超声辐照治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的优点为超声波在生物体内传播时，可产生热效应、空化效应、机械效应等，进而使组织血流量增多，血管通透性加大。正常组织血管内皮间隙多小于lOOnm，粒径大于IOOnm的颗粒难以通过血管内皮到达组织间隙。本发明采用乳化溶剂挥发法制备靶向 肝癌的载多烯紫杉醇高分子纳米粒，粒径约200nm，静脉注射后难以进入正常组织间隙，再通过超声波辐照提高肿瘤局部血流量，扩张肿瘤血管通透性，使纳米粒大量聚集在肿瘤局部，并且通过去唾液酸糖蛋白受体进入肝癌细胞内，发挥高效、低毒的肝癌靶向治疗效果。体内抗肿瘤实验得出，多烯紫杉醇靶向纳米粒联合超声辐照进行治疗效果最佳，抑瘤率达74. 2%，明显高于其它各组，二者联合具有协同抗肿瘤作用。
图I为多烯紫杉醇靶向纳米粒的扫描电镜图。图2为多烯紫杉醇靶向纳米粒在磷酸盐缓冲液中释放图，6h释放了 11. 3%，3天累积释放了 78. 1%。
具体实施例方式I、多烯紫杉醇靶向纳米粒的制备
采用乳化-溶剂挥发法制备多烯紫杉醇靶向纳米粒。精密称取IOOmg单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸轻基乙酸、5mg多烯紫杉醇、15mg半乳糖化胆固醇Gal-C4_Chol,溶于I ml 二氯甲烷，涡旋震荡，使其充分溶解，为有机相；用注射器吸取有机相，缓缓注入3ml 5 % (体积分数)聚乙烯醇水溶液中，超声乳化，50 W，工作30 sec，间歇5 sec，乳化5次，乳化液倒入8ml I % (体积分数)聚乙烯醇溶液，磁力搅拌去除二氯甲烷，聚碳酸酯膜过滤，真空冷冻干燥，6°Co辐照灭菌后4°C保存备用。2、多烯紫杉醇靶向纳米粒的表征
配制多烯紫杉醇靶向纳米粒水溶液，充分超声分散后，滴于覆盖碳膜的铜网上，干燥后用离子镀膜仪溅金，在扫描电子显微镜下观察可见纳米粒分散良好，呈类球形(见图I)。激光粒径仪测得多烯紫杉醇靶向纳米粒的平均粒径为209. 3nm，多元分散系数为O. 40。采用高效液相色谱检测多烯紫杉醇靶向纳米粒的载药率。流动相甲醇/水=75/25(体积比)，流速1. Oml/min,柱温30°C，检测波长227nm。精密称取多烯紫杉醇靶向纳米粒IOmg于5ml离心管中，加入O. 5ml 二氯甲烧,充分溶解后加入2. 5ml甲醇,润旋IOmin,5000rpm离心lOmin，取上清液20μ1进样，测得载药率为3. 79%。
3、多烯紫杉醇靶向纳米粒的体外释放
以O. 02 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7. 2)制备多烯紫杉醇靶向纳米粒溶液(含O. 02 %(体积分数)NaN3、0. I % (体积分数)吐温80)，于37°C，80rpm恒温摇床震荡进行体外释放，定时取样，5000rpm超滤离心10分钟，滤液行高效液相色谱测定多烯紫杉醇含量。结果多烯紫杉醇靶向纳米粒在磷酸盐缓冲液中平稳释放，6h释放了 11. 3%，3天累积释放了 78. 1%(图 2)。4、多烯紫杉醇靶向纳米粒的急性毒性试验
取昆明种小鼠80只，体质量为18 22 g，雌雄各半，随机分为10组，每组8只，分别经鼠尾静脉注射多烯紫杉醇靶向纳米粒溶液(多烯紫杉醇剂量分别为80、120、180、270、405mg/kg)和多帕菲注射液(多烯紫杉醇剂量分别为15、23、34、51、76 mg/kg)。给药后常规饲养2周，记录小鼠的外观、活动和死亡情况等。改良寇氏法测得多帕菲注射液小鼠半数致死量为47. 3mg/kg,而多烯紫杉醇祀向纳米粒的小鼠半数致死量升高到219. 5mg/kg。5、超声辐照对肿瘤血流灌注的影响
体外培养人肝癌细胞H印G2，大量扩增后用生理盐水调整细胞密度约I X 107/ml，每只裸鼠右腋下注射O. 2 ml细胞悬液。2周后选取肿瘤最大径I. 7 2. Ocm荷瘤裸鼠12只,分为对照组与超声辐照组，每组6只。对照组裸鼠尾静脉团注超声造影剂S0n0Vue(5ml/kg)，SEQUOIA 512超声诊断仪进行超声造影。超声辐照组裸鼠先行肿瘤超声辐照，频率840kHz、声强O. 75w/cm2,福照2min后立即进行超声造影。启动造影分析软件Syngo US Workplace,·比较两组肿瘤造影始增时间(AT)、达峰时间(TTP)、峰值-基础强度差(PBD)等参数。结果，超声辐照后，肿瘤峰值-基础强度差明显高于对照组(P〈0. 05)，表明肿瘤血流灌注明显增多。表I超声辐照对肿瘤血流灌注的影响(i 土s)
...... —割.................................................................AT..........................................................................ITP.......................................................................PBD.................................
wi ,J ω Cs) uffi.o......涵.....................................................i7s9 + o7fM...........................Γ2 ±Γ 32.............................2 Γ6 Τ678；Γ
超卢_ 照 I, Π + ΛK 01 + 1. I I ；!9, 78 士 9, :F
6、超声福照对药物分布的影响
取肿瘤最大径I. 7 2. Ocm荷瘤裸鼠12只，分为多烯紫杉醇靶向纳米粒与多烯紫杉醇靶向纳米粒联合超声辐照组，每组6只。裸鼠尾静脉注射纳米粒(多烯紫杉醇10mg/kg)后，联合超声辐照组肿瘤行超声辐照，频率840kHz、声强0. 75w/cm2的超声辐照2min，间隔2h重复辐照I次，共3次。取肿瘤组织匀浆抽提多烯紫杉醇，高效液相色谱检测。结果，联合超声辐照组肿瘤组织多烯紫杉醇药物量为2. 9±0. 5μ g/g蛋白，是单纯多烯紫杉醇靶向纳米粒组的I. 8倍。7、体内抗肿瘤作用
选取肿瘤最大径约I. O Cm的荷瘤裸鼠25只，随机分为5组，每组5只，给予相应治疗。纳米粒采用尾静脉注射给药，多烯紫杉醇剂量为10mg/kg。联合超声辐照组于给药后，频率840kHz、声强0. 75w/cm2的超声辐照2min，间隔2h重复辐照I次，共3次。A组模型组
B组多烯紫杉醇纳米粒组C组多烯紫杉醇靶向纳米粒组 D组多烯紫杉醇纳米粒+超声辐照组 E组多烯紫杉醇靶向纳米粒+超声辐照组
以上治疗每周治疗I次，连续4次。治疗后第28天，处死裸鼠，剥离肿瘤称质量，计算抑瘤率，多烯紫杉醇靶向纳米粒联合超声辐照治疗效果最佳，抑瘤率达74. 2%，明显高于其它各组(表2)。表2各组肿瘤治疗效果比较(i ±s)
权利要求
1.一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂，为乳化-溶剂挥发法制备的多烯紫杉醇靶向纳米粒，采用单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸、多烯紫杉醇和半乳糖化胆固醇溶于二氯甲烷形成有机相；吸取有机相，缓缓注入到聚乙烯醇水溶液中，超声乳化，获得的乳化液倒入另一聚乙烯醇水溶液中，搅拌去除二氯甲烷，经聚碳酸酯膜过滤，真空冷冻干燥，6ciC0辐照灭菌后获得多烯紫杉醇靶向纳米粒。
2.根据权利要求I所述的一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂，其特征在于所制得的多烯紫杉醇靶向纳米粒的平均粒径为209. 3nm，多元分散系数为O. 40 ;多烯紫杉醇靶向纳米粒的载药率为3. 79%。
3.权利要求I所述的一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂的制备方法，步骤为精密称取IOOmg单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸轻基乙酸、5mg多烯紫杉醇、15mg半乳糖化胆固醇Gal-C4-Chol，溶于I ml 二氯甲烷，涡旋震荡，使其充分溶解，为有机相；用注射器吸取有机相，缓缓注入到3ml 5 %聚乙烯醇水溶液中，超声乳化，50 W，工作30 sec,间歇5 sec，乳化5次，乳化液倒入到8ml I %聚乙烯醇溶液，磁力搅拌去除二氯甲烷，聚碳酸酯膜过滤，真空冷冻干燥，6°Co辐照灭菌后4°C保存。
4.权利要求I所述的一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂在制备烯紫杉醇靶向纳米粒联合超声辐照治疗肿瘤的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开一种具有物理、生物双重靶向作用的肝癌治疗新制剂，为乳化-溶剂挥发法制备的多烯紫杉醇靶向纳米粒，采用单甲氧基聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸、多烯紫杉醇和半乳糖化胆固醇溶于二氯甲烷形成有机相；吸取有机相，缓缓注入到聚乙烯醇水溶液中，超声乳化，获得的乳化液倒入另一聚乙烯醇水溶液中，搅拌去除二氯甲烷，经聚碳酸酯膜过滤，真空冷冻干燥，60Co辐照灭菌后保存备用。所制得的多烯紫杉醇靶向纳米粒的平均粒径为209.3nm，多元分散系数为0.40；多烯紫杉醇靶向纳米粒的载药率为3.79%。本发明的载多烯紫杉醇高分子纳米粒，粒径约200nm；体内抗肿瘤实验得出，多烯紫杉醇靶向纳米粒联合超声辐照进行治疗效果最佳，抑瘤率达74.2%。
文档编号A61K9/14GK102920660SQ201210399268
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月18日 优先权日2012年10月18日
发明者陈志奎, 林礼务, 薛恩生 申请人:福建医科大学附属协和医院