专利名称：使用融合至肝素结合序列的生长因子促进心脏修复的方法
技术领域：
本发明涉及其中促进细胞的生长和/或存活的多肽融合至结合肝 素的肽的蛋白质。可将此类蛋白质与心肌细胞结合并且施用至损伤的 心脏组织以帮助促进修复。
背景技术：
胰岛素样生长因子-l(IGF-l)是促进心肌细胞的生长和存活的蛋 白质。缺乏IGF-1的小鼠在心肌梗塞(myocardial infarction)后展 示增加的凋亡(Palmen， 等人，Cardiovasc. Res. 50:516-524 (2001))，然而心肌特异性IGF-1的过表达在梗塞形成后保护肌细胞 免受凋亡和心室扩张的侵害(Li，等人，J. Clin. Invest. 100:199卜1999 (1997); Torella， 等人，Circ. Res. 94:514-524 (2004))。 IGF-1的过表达还增加心脏干细胞数目和生长，从而导致肌 细胞周转和老化心脏的作用的增加。梗塞形成后，IGF-1促进移植入 心肌的胚胎干细胞的移入(engraf tment )、分化和功能的提高(Kofidis 等人，Stem Cells 22:1239-1245 (2004))。此外，IGF-1的血清水平 与老年患者的亚群中的先天性心脏衰竭(congenital heart failure) 的风险呈负相关(Vasan， 等人，Ann. Intern. Med. 139: 642-648 (2003))。
上述特征使IGF-1成为对已经历心脏组织的损伤的患者，例如， 已经历心肌梗塞的患者来说诱人的治疗剂。然而，IGF-1是易于扩散
7通过组织的小蛋白质。因此，难以在组织损伤部位长时间保持高浓度
的该因子。已被采用以保持高局部浓度的一个方法是将IGF-1与自我 装配的生物膜结合(参见US20060088510)。通过使用心肌梗塞的大鼠 模型，发现当将该膜与新生心肌细胞一起植入时，植入的细胞的存活 和生长与和未结合的IGF-1—起植入的细胞相比得到提高。因此，细 胞定居损伤的心脏和提高功能的能力得到增加。通过使用相似的方法， 使用PDGF也获得积极的结果(US20060148703)。尽管这些结果具有前 景，但避免对构建和移植膜的需要的可选方法将是期望得到的。
发明概述
本发明基于将IGF-1与心肌细胞结合(在它们植入损伤的心脏组 织之前)的方法的发展。已发现，可能将IGF-1与肝素给合肽(HBP) 连接并且获得保持对培养细胞的存活的有益效应的融合蛋白。融合蛋 白结合心肌细胞(推测结合细胞表面肝素)比单独的IGF-1效果更好。 因为许多不同的细胞类型具有细胞表面肝素，因此不预期简单地全身 性注射IGF-1/HBP蛋白对心脏病患者十分有益。然而，靶向作用可通 过在植入之前将心肌细胞与IGF-1/HBP—起温育来获得。在更低的程 度上，局部化还可通过将蛋白质直接注射入心脏组织来获得。相似的 方法在治疗对生长因子起反应(使用或不使用细胞移植)的其他病况 (例如，创伤)中应当是有用的。
在其第一方面，本发明涉及具有式B-(J)n-(Z)q或(Z)q-(J)n-B 的化合物，其中n是从0至10的整数；q是从l至5的整数；B是促 进心肌细胞的生长和/或存活(如例如使用4皮剥夺血清的细胞所测定 的)的肽，Z是肝素结合肽。可使用本领域内已知的任何肝素结合肽， 包括所有本文中描述的肽。J是蛋白质形成性(proteinogenic)氨基 酸或可用于将肽连接在一起的化合物例如生物素/抗生物素蛋白。为了 本发明的目的，从N端(极左)至C端(极右)书写所有肽序列，并且除 非另外指出，所有肽由"蛋白质形成性"氨基酸组成，即，它们是 丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮 氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨 酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)或缬氨酸(V)的左旋体 (L一isomer )。
在优选实施方案中，上文所示的式的化合物是融合蛋白，其中， L是蛋白质形成性氨基酸，A是胰岛素衍生生长因子-1 (IGF-l)或血小 板源性生长因子(PDGF)。人IGF-1的全长序列(GenBank登录号NM
00618) 如 下
MGKISSLPTOLFKCCFCDFLKVKMHTMSSSHLFYLALCLLTFTSSATAGPETL CGAELVDALOFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPOTGIVDECCFRSCDLRRL EMYCAPLKPAKSARSVRAORHTDMPKTOKEVHLKNASRGSAGNKNYRM
(SEQIDN0:1)。然而，按照本文中描述的方法，下划线标示的序列足 以促进心肌细胞生长和存活。因此，为了本发明的目的，IGF-1定义
ECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPTKSA (SEQ ID NO: 2)并且可任选地包含SEQ ID NO: 1的序列的任何另外部分。例如，C端可始于G、 AG、 TAG等。类似 地，SEQ ID NO: 2的N末端可按照SEQ ID NO: 1延伸。因此，肽可以 在R、 RS、 RSV等处终止。PDGF的全长氨基酸序列在本领域内也是熟 知的(参见，Rao，等人，Proc, Nat'1 Acad. Sci. USA 83: 2392-2396 (1986))并且尤其可发现为GenBank登录号P01127。在上文所示的式 中，n优选为0, q优选为1。
优选的肝素结合肽，即，式中的Z,是
KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQ ID NO:3); RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQ ID NO:4); PYWLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQIDNO:5); KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQ ID NO:6); KDGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQIDNO:7); CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQ ID NO:8); YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ IDNO:9); AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ ID NO:IO);LRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO: 11);
PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQ ID NO: 12); KGKMHKTCYY (SEQ ID NO: 13); MGKMHKTCYN (SEQ ID NO: 14);
PPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO: 15); KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16); KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGERGPRGITGK (SEQ ID NO: 17); GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18); HRHHPREMKKRVEDL (SEQ ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和 AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:2"。
本发明还包括编码上述任何融合蛋白的DM分子、包含此类DNA 分子的载体和用所述载体转化的宿主细胞。所述宿主细胞可用于产生 用于本文中描述的治疗方法的融合蛋白。DM还可用于转化在组织损 伤部位分泌融合蛋白的细胞。分泌后，蛋白质将结合附近的其他细胞， 从而保持相对高的局部浓度。
本发明还包括使用一种或多种融合蛋白或化合物治疗患有对 IGF-1或PDGF起反应的任何病状的患者的方法。在一个实施方案中， 直接对治疗部位施用化合物或融合蛋白以允许它们结合内源细胞的表 面。更优选，将它们用于治疗其中需要组织生长或修复并且存在可获 得的可用于帮助该过程的细胞的病状。在此类情况下，可将化合物或 融合蛋白与细胞一起预温育以使它们在植入前结合。在特别优选的方 法中，通过将心肌细胞与化合物或融合蛋白在足以允许它们结合的条 件下一起温育一段时间来治疗患者的损伤的心脏组织(例如，由于心 肌梗塞引起的)。然后将细胞注射入或植入患者的心脏组织。
还可使用化合物和融合蛋白修复损伤的软骨。通常，IGF-l扩散 出软骨，从而其对移植的软骨细胞的作用减小或消失。通过在植入前 将软骨细胞与肝素结合IGF-1 —起温育，生长因子的局部浓度将增加 并且，作为结果，软骨细胞将产生更多的软骨。
经基因工程改造而结合肝素的生长因子，特别地IGF-1，还可结 合将被植入以修复和再生例如患者的神经元的细胞，所述患者患有神 经退行性疾病(neurodegenerative disease)例如ALS， 患有中风，或由于损伤已丧失神经功能。IGF-1是用于ALS的临床试验的候选物， 并且已发现其促进皮质脊髓运动神经元中的轴突向外生长(6zdinler， 等人，Nature Neurosci. 9:1371-1381 (2006))。通过在植入前将 IGF-1与神经元结合，将增强它们的体内生长。
发明描述
本发明基于概念损伤后组织的修复可通过保持高局部浓度的生 长因子例如IGF-1或PDGF来促进。本领域内描述的实验支持使用生物 相容性膜来在施用部位保留治疗剂的该方法(参见US20060088510和 US20060148703)。现已发现，生长因子可融合至肝素结合肽并且可在 它们植入心脏组织之前将其与心肌细胞结合。融合蛋白保持其促进细 胞生长和存活的能力并且在植入部位得到保持而无需制备和使用生物 相容性膜。
肽的制备
将肝素结合肽与治疗剂连接的一个方法是通过非肽连接体的使 用。例如，生物素和抗生物素蛋白用于连接分子的用途在本领域内是 熟知的，可使用标准方法将肝素结合肽与生长因子例如IGF-1结合。
为了防止生物素/抗生物素蛋白基团和肽之间的位阻影响(steric interference),可在两者之间包含间隔子。间隔子可采取1-15 (优 选1-IO)个脂肪酸或1-15 (优选l-10)个氨基酸的形式。用于整合该类 型的间隔子的方法在本领域内是熟知的。
优选，以融合蛋白的形式将肝素结合肽和生长因子例如IGF-1和 PDGF连接在一起。可以化学合成或使用重组DNA技术制备融合蛋白。 化学方法包括使用标准N-叔-丁氧羰基(t-Boc)化学试剂的固相肽合 成和使用n-甲基吡咯烷酮化学试剂的循环。在合成肽后，可使用方法 例如在反相柱上进行的高压液相色谱法纯化它们。纯度还可通过HPLC 来估量，并且正确组合物的存在可通过氨基酸分析来确定。与勿應^潜合
心肌细胞或其他细胞可使用标准方法来获得，然后可将其与融合 组合物或蛋白一起温育足以使融合蛋白结合细胞表面的时间。温育可 持续从大约1小时至数天的任何时间，并且应当在允许细胞存活的条
件下(例如在大约37°C、中性pH下)和在确保细胞存活的培养基中 进行。存在的蛋白质的量通常应当足以包被细胞但确切的量不是至关 重要的。细胞可通过注射器或导管施用至心脏组织。所使用的细胞的 精确量不是至关重要的，但通常将使用1X1()S至1X10'个细胞的量。
秀參jg合參希浙量
可将融合蛋白并入含有载体例如盐水、水、林格氏溶液和其他试 剂或赋形剂的药物组合物中，并且可将细胞维持在标准培养基中以保 持生活力。通常设计用于植入、输注或注射入特别是心脏组织的制剂， 但局部治疗也可用于例如创伤的治疗。所有药物组合物可使用本领域 内的才示准方法(参见例如，Remington's Pharmaceutical Sciences, 第16版.A. Oslo, ed. ， Eastern, PA (1980))来制备。
预期本领域技术人员将使用临床医学中良好建立的方法逐案
整剂量。最佳的剂量将通过本领域内已知的方法来测定，并且将受到 因素例如患者的年龄、疾病状态和其他临床相关因素的影响。
实施例
实施例1:心肌细胞的存活
本实施例证明IGF-1提高了 ES ;肝生的心肌细胞的存活和描述了 经基因工程改造以提高注射细胞的存活的新型肝素结合(HB)-IGF-1 融合蛋白的开发。
为了使畸胎瘤形成最小化，我们研究了定向分化成心肌细胞谱系的ES细胞。通过悬滴法(hanging drop method)将用ot-心肌肌球蛋 白重链启动子驱动的增强型绿色焚光蛋白(EGFP)稳定转染的小鼠ES 细胞分化成心肌细胞，通过荧光细胞分选纯化EGFP阳性细胞。在此类 ES衍生的心肌细胞中，IGF-1减少由血清剥夺诱导的细胞死亡(13. 6 +/- 1. 9 %对25. 9 +/- 2. 5 % (对照中),p<0. 05)和减少由血清剥夺 诱导的凋亡(分别地TUNEL-阳性细胞8. 0 +/- 1. 5 %对4. 3 +/- 0. 5 %， p<0. 05)。此外，IGF-1减少阿霉素(liuM， 24小时)或白屈菜赤碱(3 HiM， 1小时)诱导的凋亡(p〈0. 01)。磷酸肌醇-3激酶抑制剂LY294002 (10pM)抑制IGF-1对阿霉素诱导的凋亡的保护作用(p<0. 05)。因为 IGF-1快速地从注射的部位扩散开，因此我们设计和表达具有N末端 HB结构域的新型重组IGF-1融合蛋白。通过镍亲和层析纯化蛋白质， 然后使其经历氧化重新折叠，从而恢复生物活性。HB-IGF-1比IGF-1 显著更好地结合细胞表面，并且HB-IGF-1与天然IGF-1同样有效地在 新生心肌细胞和3T3成纤维细胞中激活Akt。
潜论
因为IGF-1在体外提高ES衍生的心肌细胞的存活，因此该新型 肝素结合IGF-1可通过结合注射细胞的表面来改善细胞疗法。这表明 了通过局部递送的治疗性蛋白改变细胞微环境的可能性。
实施例2:软骨修复
在本实施例中，我们设计和纯化了新蛋白质，肝素结合 IGF-1 (HB-IGF-l),该蛋白质是天然IGF-1与肝素结合表皮生长因子样 生长因子的肝素结合结构域的融合蛋白。HB-IGF-1与肝素以及3T3成 纤维细胞、新生心肌细胞和正在分化的胚胎干细胞的细胞表面选择性 结合。HB-IGF-1以与IGF-1相同的动力学和剂量依赖性激活IGF-l受 体和Akt，表明没有因肝素结合结构域而导致的生物活性的减弱。因为 软骨是富含蛋白聚糖的环境以及IGF-1是已知的软骨细胞生物合成的 刺激物，因此我们研究了 HB-IGF-1在软骨中的功效。HB-IGF-1通过软骨外植体得到选择性保留并且与IGF-1相比导致持续的软骨细胞蛋 白聚糖生物合成。这些数据显示对"远距离(long-distance)"生长 因子如IGF-1进行基因工程改造以用于局部递送的策略可用于组织修 复和使全身效应最小化。
材料和方法 威'雄种建
大鼠 IGF-1 cDNA 通过使用引物 (5'至 30 GGACCAGAGGACCCTTTGCG (正向，SEQ ID NO: 22)和 AGCTGACTTT GTAGGCTTCAGC (反向，SEQ ID NO: 23)进行聚合酶链式反应(PCR )来 扩增。我们使用成熟肽IGF-1 (70个氨基酸)，其编码外显子3和4 (Hameed，等人，J. Physiol. 547:247-254 (2003); Shavlakadze， 等人，Growth Horm IGF Res 15:4-18 (2005); Musaro,等人，Exp Gerontol. 42:76-80 (2007))。将产物亚克隆入pTrcHis-T0P0载体 (Invitrogen， Carlsbad, CA， USA)，在IGF-1的C末端加入终止密 码子(TAG)，从而编码带Xpress-标签的IGF-1 (Xpress-IGF-l)。 为编码HB-IGF-1，通过诱变在X-press标签和IGF-1序列之间插入大
TAAGAAATACAAG (SEQ ID NO: 24))的肝素结合序列(AA 93-113)。
用PfuUltra HF DM聚合酶(Stratagene， Cedar Creek, TX， USA) 进行扩增，并且在于大肠杆菌(E. coli)中转化前用"/wl (New England Biolabs， Beverly, MA， USA)消化模板质粒。通过DNA测序确认所有 序列。
将Xpress-IGF-1和HB-IGF-1在大肠杆菌BL21细胞中表达并且 以4升的批次培养于LB培养基中。用lmM异丙基P-D-硫代半乳糖苷 诱导蛋白质合成，进行4小时，然后通过离心收获细胞，将其在裂解 緩冲液(6 M盐酸胍，20 mM磷酸钠，500 mM NaCl， pH 7. 8)中裂解，并进行均质化。第一纯化步骤由使用Ni-NTA (Invitrogen)，利用融 合蛋白中的多组氨酸标签进行的亲和纯化组成。Ni-NTA树脂用清洗緩 冲液(8 M尿素，500 mM NaCl， 20 mM磷酸盐，pH 6. 2)清洗，然后在 pH 4下洗脱结合的蛋白质。然后使洗脱的蛋白质经历氧化重新折叠， 从而恢复生物活性。将蛋白质与重新折叠緩冲液(50 raM Tris， 75 mM NaCl， 100 jaM氧化型谷胱甘肽和100 jaM还原型谷胱甘肽，pH 7. 8) 在4。C下一起温育过夜。在重新折叠后，将样品调整至0. 1%三氟乙酸， 然后装载于C18反相高效液相色镨(RP-HPLC)柱子(Delta-Pak C18， Waters, Milford， MA， USA)上，作为终纯化步骤。使柱子经历从25% 至40%的乙腈的线性梯度(在0. 1%的三氟乙酸中)。
从新生Sprague Dawley大鼠的心室制备心肌细胞的原代培养物， 将其培养在含有7%胎牛血清(Invitrogen)的达尔伯克氏改良伊格尔 氏培养基(Dulbecco' s modified Eagle's medium) (DMEM, Invitrogen) 中；24小时后，用无血清培养基替换培养基。将3T3成纤维细胞培养 在含有10。/。新生牛血清(Invitrogen)的DMEM中，在实验前24小时用 无血清培养基替换培养基。将小鼠胚胎干细胞(ES)在不含有饲养细胞 的明胶涂覆的培养皿中培养于补充有15% KNOCKOUT SR (Invitrogen) 和白血病抑制因子(Chemicon， Billerica， MA， USA)的格拉斯哥极限 必需培养基(Glasgow Minimum Essential Medium) (Invitrogen)中。 每3天对细胞进行传代。为了诱导分化，首先酶促分离细胞，以前述 用于胚状体形成的悬滴形式培养细胞(Takahashi， 等人， Circulation 107: 1912-1916 (2003))。加入含有10% ES细胞级胎牛 血清(Invitrogen)、不含白血病抑制因子的分化培养基。此类ES细胞 在分化成心肌细胞后变成绿色荧光蛋白(GFP)P曰性，因为它们已用oc-肌球蛋白重链启动子驱动的增强型GFP载体稳定转染。在胚状体形成 后(第7天)，将细胞涂布在明胶涂覆的培养皿上。从1-2周龄的初生小牛的髌股骨滑槽(fe,opatellar groove) 获取牛关节软骨外植体(3-mm-直径、l-mm-厚的盘)，将其在37'C于5% C0z气氛中培养于含有10 mM HEPES、 0. lmM非必需氨基酸、0. 4 mM L-脯氨酸、20 /ag/ml抗坏血酸盐、100 U/ml青霉素和100 |u g/ml链 霉素的低葡萄糖DMEM中。
用含有1% Triton-X、 0. 25%脱氧胆酸钠、lmM乙二胺四乙酸 (EDTA)、 lmM苯甲磺酰氟(PMSF) 、 lmM NaF、 lmM Na3V04和1: 1000蛋白 酶抑制剂混合物(Sigma， St. Louis， MD， USA)的磷酸盐緩沖液(PBS) 裂解新生心肌细胞和3T3成纤维细胞。将软骨盘研磨成粉并且用100mM NaCl、 50mM Tris、 0.5% Triton-X、 5mM EDTA、 lraM PMSF和1:1000 蛋白酶抑制剂混合物(Sigma)进行裂解。通过Bradford测定法测量蛋 白质浓度，在各小孔中加载10 pg蛋白质以进行Western印迹分析。 如通过DMMB染料结合所测量的，在所有样品中观察到相似的GAG含量。 使用抗-Xpress抗体(Invitrogen)、抗-多克隆IGF-1抗体(Abcam， Cambridge, MA， USA)、抗-磷酸-IGF-l受体抗体(Cell Signaling, Danvers， MA， USA)、抗-磷酸-Akt抗体(Cell Signaling)和抗-肌动 蛋白抗体(Sigma) 。 IGF-1作为对照蛋白质购自Sigma。
为了通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测融合蛋白，用抗 -Xpress抗体(10jag/ml)涂覆96孔板过夜。向各小孔中加入相同量的 来自软骨提取物的蛋白质。多克隆IGF-1抗体用作一抗，抗-兔-辣根 过氧化物酶(Bio-Rad， Hercules, CA， USA)用作二抗。在加入ABTS 过氧化物酶底物(KPL， Gaithersburg, MD, USA)后，在405nm处对板 进行读数。
将肝素琼脂糖珠粒(Sigma)与 300 pmol HB-IGF-1或Xpress-IGF-1 一起温育2小时，然后用PBS清洗3次。通过用SDS-PAGE 样品緩沖液(Invitrogen)煮沸来提取与肝素琼脂糖珠粒结合的融合蛋 白。将3T3成纤维细胞或新生大鼠心肌细胞与100nMHB-IGF-l或对照 IGF-l(Sigma)—起温育2小时，然后用PBS清洗3次。用裂解緩冲液 裂解细胞，然后使其经历使用抗-IGF-l抗体的Western印迹分析。将 胚状体(在诱导分化后10天)与融合蛋白一起温育2小时，用PBS清洗 3次，在用抗-Xpress抗体进行免疫组织化学分析之前用多聚甲醛将其 固定。将软骨盘培养在补充有500nMHB-IGF-l或500nM Xpress-IGF-l 的无血清DMEM中。在48小时后(第0天)，用PBS清洗盘3次，然 后将其与不含有IGF-1的DMEM—起温育。在第0、 1、 2和4天收集盘。 通过Western印迹分析和ELISA检测保留在软骨提取物中的蛋白质。
通过[35S]硫酸盐(PerkinElmer， Waltham, MA， USA)的整合测量 软骨细胞蛋白聚糖的合成，如之前所描述的(Sah，等人，J. Orthop. Res. 7:619-636 (1989))。使软骨盘于无血清培养基中平衡1天，然 后在含有100nM HB-IGF-1、 Xpress-IGF-1或对照IGF-1 (Sigma)的培 养基中温育2天。然后用PBS清洗盘3次，然后更换至无IGF-1的培 养基中。用5juCi/ml ["S]硫酸盐放射性标记培养的盘，进行最后24 小时的培养。标记后，在4。C下在1. Oml含有0. 8mM脯氨酸和lmM Na2S04 的PBS中清洗各个盘3次以除去游离放射性标记。将盘于1. Oml蛋白 酶K (125Mg/ml于O. lMNa2S04， 5mM EDTA和5mM半胱氨酸，pH 6.0 中)中进行消化。通过20ju 1消化物与180 n 1赫斯特染料(Hoechst dye) 33258 (24)的反应借助荧光分析来分析样品的DNA含量。然后在 闪烁计数器(Wallac MicroBeta TriLux， PerkinElmer， Waltham， MA， USA)中测量消化物的["S]硫酸盐含量，对溢出和猝灭进行校正。
通过Student's t检验进行统计分析，接受水平oc-0.05。使用ot -1- (1- a 。)1/n就多重比较对t检验进行校正，其中a 。- 0. 05并且n= 比较的总数。所有数据表示为平均值土SE。
结果
t^-/^W ^趁必
IGF-1具有3个二疏键，包含70个氨基酸。IGF-l融合蛋白包含 用于蛋白质纯化的多组氨酸标签和用于蛋白质检测的Xpress标签。 HB-IGF-1和Xpress-IGF-1的分子量分别为14， 018 Da和11， 548 Da。 HB-IGF-1在IGF-1的N末端上具有HB结构域。HB结构域具有21个氨 基酸，其包含12个带正电荷的氨基酸。重新折叠后的新型融合蛋白使 用RP-HPLC进行最终纯化。如之前所述(Milner，等人，Biochem. J. 308 (Pt 3): 865-871 (1995))鉴定正确折叠的蛋白质，并使用生物活性 测定法对其进行验证。在进行RP-HPLC后，重新折叠的IGF-1蛋白的 考马斯蓝染色和使用抗-Xpress抗体的Western分析显示单个条带。
v^-/f7F-i潜合，;^希勿^羞面
我们首先检测HB-IGF-1是否选择性结合肝素。在将肝素琼脂糖 珠粒与300 pmol HB-IGF-1或Xpress-IGF-1温育2小时后，通过煮 沸从珠粒提取结合的蛋白质。与Xpress-IGF-1相比，与肝素琼脂糖珠 粒结合的蛋白质的考马斯蓝染色显示HB-IGF-1选择性结合肝素。然后 我们使用3T3成纤维细胞和新生大鼠心肌细胞来检测HB-IGF-l结合具 有硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycan)的细胞表面 的能力。在用0 - lOOnM的HB-IGF-1预处理2小时后，用PBS清洗细 胞3次。关于这些实验，将商购获得的IGF-1用作对照。当用10nM 和100nM浓度处理时，HB-IGF-1结合3T3成纤维细胞。与新生心肌细 胞结合的HB-IGF-1在10nM和lOOnM时显示明显的HB-IGF-l的选择性 结合，在lOOnM时显示非常弱的IGF-1的条带。这些结果与该HB结构 域在亚微摩尔范围内对肝素的结合相符。我们还研究了 HB-IGF-1结合 胚状体中的胚胎干细胞的能力，所述胚状体包含多种细胞类型。通过 针对Xpress表位标签的免疫荧光容易地在胚状体中的细胞的表面上检测到HB-IGF-1，这表明HB-IGF-1可结合多种细胞类型。
为了确定HB结构域是否干扰生物活性，进行IGF-1受体磷酸化 和Akt激活的生物测定。对照IGF-l、 HB-IGF-1和Xpress-IGF-1全 都以剂量依赖性的方式激活新生心肌细胞的IGF-l受体并同等地诱导 Akt的磷酸化。对照IGF-1、 HB-IGF-1和Xpress-IGF-1全都在相似的 时程内激活Akt。这些数据证明肝素结合结构域的加入不干扰IGF-l 的生物活性。
朋-/W-J ^欢#
软骨是富含蛋白聚糖的组织，软骨细胞以增加的细胞外基质合成 对IGF-l作出反应。因为IGF-1信号转导的延长的局部刺激可由此有 益于软骨修复，所以我们研究了 HB-IGF-1结合软骨的能力。将相同大 小的牛关节软骨盘与500nM HB-IGF-1或Xpress-IGF-1 —起温育1天、 3天或6天，在该时间内扩散入软骨的IGF-1蛋白的量没有差异。在 与HB-IGF-1或Xpress-IGF-1 —起预温育48小时后，在第0天用PBS 清洗软骨盘，检测到相似量的IGF-1。然而，在除去IGF-1蛋白后第1、 2和4天，只有HB-IGF-1保留在软骨中，这表明HB-IGF-1结合富含 蛋白聚糖的细胞外基质。相反，即使在清洗后1天，也未能检测到 Xpress-IGF-l。 我们还4吏用软骨提取物和ELISA测量进行了该选择 性结合实验。这些结果确认HB-IGF-1被软骨选择性保留，而 Xpress-IGF-1快速丢失。
7潜*炎#勿應參合4 HB-IGF-1至软骨的选择性保留表明该融合蛋白可递送持续的刺 激以进行软骨细胞生物合成。因此，我们通过["S]硫酸盐的整合来测 量细胞外基质蛋白聚糖的软骨细胞生物合成。将软骨盘与100nM HB-IGF-1、对照IGF-1或Xpress-IGF-1 —起温育2天，用PBS清洗3 次，然后在不含IGF-1的培养基中进行培养。在第0天(洗掉前)、
19第2天(刚洗掉后)、第4天、第6天和第8天测量TS]硫酸盐整合， 进行24小时。在第0天，在与IGF-1构建体温育期间，如所预期的， 对照IGF-1、 Xpress-IGF-l和HB-IGF-1组全都刺激蛋白聚糖合成。然 而，在清洗后，对照IGF-1和Xpress IGF-1在第4天或之后都不剌激 蛋白聚糖合成。相反，HB-IGF-1导致持续刺激蛋白聚糖合成6天。与 Xpress-IGF-l相比，在第2、 4和6天，与HB-IGF-1—起温育的软骨 中蛋白聚糖的合成显著更高。这些数据证明选择性保留在软骨中的 HB-IGF-1在更长的持续时间内刺激软骨细胞生物合成。
讨论
IGF-1的局部递送具有促进组织修复和再生同时使全身性不利效 应最小化的潜能。在本实施例中，我们描述了结合富含蛋白聚糖的组 织和细胞表面且具有与IGF-1相同的生物活性的新型IGF-1蛋白 HB-IGF-1。我们的数据表明HB-IGF-1可激活IGF-1受体和Akt，从而 表明肝素结合结构域不干扰IGF-1与其受体的相互作用。IGF-1具有4 个结构域B结构域(AA1-29) 、 C结构域(AA30-41) 、 A结构域(AA42-62) 和D结构域(AA63-70) ， C结构域在与IGF-1受体的结合中起着最重要 的作用。整个C结构域的替代引起对IGF-1受体的亲和力减少30倍。 因此，预期向IGF-1的N末端添加肝素结合结构域不干扰与IGF-1 C 结构域的相互作用。
细胞外基质和细胞表面都富含蛋白聚糖，它们可用作蛋白聚糖结 合生长因子的l&库(reservoir )。经典实例是成纤维细胞生长因子-2 (FGF-2)系统，其中蛋白聚糖受体的低亲和力、高容量库用作用于其高 亲和力受体的FGF-2的贮库。我们的实验显示HB-IGF-1在一些情况下 可以以相似的方式起作用，因为HB-IGF-1选择性保留在细胞表面上。 IGF-1还可通过IGF结合蛋白(IGFBP)与细胞外基质结合；在循环中， 至少99%的IGF-1与IGFBP(IGFBP-1至6)结合。
IGF-1可促进软骨细胞外基质的合成和抑制软骨的降解 (Bonassar，等人，Arch. Biochem. Biophys. 379:57—63 (2000));然而，IGF-1递送至软骨的实际模型仍然有待发展(Schmidt,等人， Osteoarthritis Cartilage 14:403-412 (2006))。石克酸肝素蛋白聚 糖主要存在于(特别地以基底膜蛋白多糖(perlecan)和多配体聚糖 -2 (syndecan-2)上的链的形式)软骨的细胞外周基质中，并且已知 其结合其他配体例如FGF-2。我们的实验表明HB-IGF-1蛋白可结合基 质和增加至软骨细胞的局部、长期生物利用度，从而促进软骨修复。
除了软骨以外，HB-IGF-1具有用于其他组织的潜能。例如，IGF-l 诱导PC12细胞和皮质脊髓运动神经元的轴突向外生长，从而IGF-1 可有益于运动神经元退行性疾病。在皮肤创伤愈合中，IGF-1也是有 效的，因为IGF-1刺激胶原合成和刺激成纤维细胞和角质形成细胞的 有丝分裂。HB-IGF-1结合细胞表面的能力可增强细胞疗法和其他再生 策略。
本文中引述的所有参考文献全部通过引用合并入本文。现已完全 描述了本发明，本领域技术人员应当理解，可在广泛和等同的条件、 参数等的范围内实施本发明而不影响本发明或其任何实施方案的精神 或范围。
权利要求
1. 具有式B-(J)n-(Z)q或(Z)q-(J)n-B的化合物，其中B是促进心肌细胞的生长和/或存活的肽；J是蛋白质形成性氨基酸或连接体；Z是肝素结合肽；n是从0至10的整数；和q是从1至5的整数。
2. 权利要求1的化合物，其中所述化合物是融合蛋白，其中J 是蛋白质形成性氨基酸，并且B是胰岛素衍生生长因子-1 (IGF-1)或血 小板源性生长因子(PDGF)。
3. 权利要求2的融合蛋白，其中Z选自 KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQIDNO:3);RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQ ID NO:4);PYWLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQ ID NO:5);KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQIDNO:6);KDGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQ DO NO:7);CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQIDNO:8);YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ E) NO:9);AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ IDNO:10);LRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO:l 1);PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQID NO: 12);KGKMHKTCYY (SEQ ID NO:13);MGKMHKTCYN (SEQ ID NO: 14);PPTnWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO: 15);KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16);KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGERGPRGITGK (SEQ ID NO: 17);GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18);HRHHPREMKKRVEDL (SEQ ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:21)。
4. 权利要求1至3中任一项的融合蛋白，其中n-0。
5. 权利要求1至4中任一项的融合蛋白，其中q= 1。
6. 包含编码权利要求2至5中任一项的融合蛋白的核苷酸序列 的DM分子。
7. 治疗具有损伤的心脏組织的患者的方法，该方法包括a) 将心肌细胞与权利要求1的化合物在足以允许所述化合物结合 所述心肌细胞的条件下 一 起温育 一 段时间；b) 将步骤a)的经温育的心肌细胞注射或植入所述患者的心脏组织。
8. 权利要求7的方法，其中所述化合物是融合蛋白，其中J是 蛋白质形成性氨基酸，并且B是胰岛素衍生生长因子-l (IGF-1)或血小 板源性生长因子(PDGF)。
9. 权利要求8的方法，其中所述融合蛋白中的Z选自 KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQIDNO:3); RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQ ID NO:4); PYVVLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQIDNO:5); KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQEDNO:6); KDGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQIDNO:7); CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQ ID NO:8); YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ ID NO:9); AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ ID NO:IO); LRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO: 11);PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQ ID NO: 12);KGKMHKTCYY (SEQ ID NO: 13); MGKMHKTCYN (SEQ IDNO:14); PPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO: 15); KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16); KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGERGPRGITGK (SEQ ID NO: 17); GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18); HRHHPREMKKRVEDL (SEQ ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和 AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:21)。
10. 权利要求9的方法，其中在所述融合蛋白中n=0。
11. 权利要求9或权利要求10的方法，其中在所述融合蛋白中q=l。
12. 权利要求7的方法，其中所述心肌细胞来源于胚胎干细胞。
13. 权利要求7的方法，其中所述心脏组织损伤是心肌梗塞的结果。
14. 治疗患者以修复损伤的软骨的方法，该方法包括a) 将软骨细胞与权利要求1的化合物在足以允许所述化合物结 合所述软骨细胞的条件下一起温育一段时间；和b) 在软骨损伤部位注射或植入步骤a)的经温育的软骨细胞。
15. 权利要求14的方法，其中所述化合物是融合蛋白，其中J 是蛋白质形成性氨基酸，并且B是胰岛素衍生生长因子-1 (IGF-l)或血 小板源性生长因子(PDGF)。
16. 权利要求15的方法，其中所述融合蛋白中的Z选自KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQ ID NO:3); RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQIDNO:4); PYWLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQ ID NO:5); KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQIDNO:6); KDGRKICLDLQAPLYKKIIKKLLES (SEQ ID NO:7); CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQIDNO:8); YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ ID NO:9); AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ ID NO:10); LRKLRKRLLRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO:l 1); PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQ ID NO: 12);KGKMHKTCYY (SEQ IDNO:13); MGKMHKTCYN (SEQ ID NO: 14);PPTIIWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO:15); KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16); KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGpRGPRGITGK (SEQ ID NO: 17); GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18); HRHHPREMKKRVEDL (SEQ ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和 AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:2"。
17. 权利要求16的方法，其中在所述融合蛋白中n=0。
18. 权利要求16或17的方法，其中在所述融合蛋白中q=l。
19. 治疗患者以修复损伤的神经组织的方法，该方法包括a) 将神经元与权利要求1的化合物在足以允许所述化合物结合 所述神经元的条件下一起温育一段时间；和b) 在神经组织损伤部位注射或植入步骤a)的经温育的神经元。
20. 权利要求19的方法，其中所述化合物是融合蛋白，其中J 是蛋白质形成性氨基酸，并且B是胰岛素衍生生长因子-1 (IGF-l)或 血小板源性生长因子(PDGF)。
21. 权利要求20的方法，其中所述融合蛋白中的Z选自KKKRKGKGLGKKRDPCLKKYKG (SEQIDNO:3); RIQNLLKITNLRIKFVK (SEQIDNO:4); PYWLPRPVCFEKGMNYTVR (SEQIDNO:5); KQNCLSSRASFRGCVRNLRLSR (SEQIDNO:6); KDGRKICLDLQAPLYKKJIKKLLES (SEQ ID NO:7); CKNGGFFLRIAPDGRVDGVREK (SEQ ID NO:8); YSSWYVALKRTGQYKLGPKTGPGQKAILFLP (SEQ IDNO:9); AKLNCRLYRKANKSSKLVSANRLFGDK (SEQ IDNO:10); LRKLRKRIXRDADDLQKRLAVYQ (SEQ ID NO: 11); PLQERAQAAWQERLRARMEEMGSRTRDRLDEVKEQVAERAKL (SEQ ID NO: 12);KGKMHKTCYY (SEQ IDNO:13); MGKMHKTCYN (SEQ ID NO: 14);PPTHWKHKGRDVILKKDVRFIVLSNNY (SEQ ID NO: 15); KKHEAKNWFVGLKKNGSCKRGP (SEQ ID NO: 16); KGGRGTPGKPGPRGQRGPTGRGERGPRGITGK (SEQ ID NO: 17); GEFYDLRLKGDK (SEQ ID NO: 18); HRHHPREMKKRVEDL (SE。 ID NO: 19); EKTLRKWLKMFKKR (SEQ ID NO:20);和 AEAAARAAARRAARRAAAR (SEQ ID NO:2"。
22. 权利要求21的方法，其中在所述融合蛋白中n=0。
23. 权利要求21或22的方法，其中在所述融合蛋白中q=l。
24. 权利要求19的方法，其中所述损伤的神经组织是神经退行 性疾病、中风或创伤的结果。
25. 权利要求19的方法，其中所述损伤的神经组织是ALS的结果。
26. 权利要求19的方法，其中所述神经元是皮质脊髓运动神经元。
全文摘要
本发明涉及其中肝素结合肽融合至促进细胞生长和/或存活的生长因子的蛋白质。将所形成的化合物与细胞表面结合，所述细胞之后被施用至损伤的组织。生长因子由此保留在施用部位，在该部位中其促进修复。
文档编号A61K38/00GK101547704SQ200780044876
公开日2009年9月30日 申请日期2007年11月8日 优先权日2006年11月13日
发明者R·李 申请人:布里格海姆妇女医院公司