专利名称：一种二维液相色谱－质谱联用制备高纯度芦丁的方法
技术领域：
本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法。
背景技术：
芦丁(Rutin)，亦称芸香苷，广泛存在于植物界中。现已发现的含芦丁的植物已有50种以上。芦丁属于黄酮类化合物，能降低毛细血管通透性和脆性，促进细胞增生和防止血细胞凝聚，在心脑血管疾病的治疗上起到了举足轻重的作用。同时，芦丁还具有抗炎、抗过敏、利尿、解痉、镇咳、降血脂等方面的作用。临床上芦丁主要用于高血压病的辅助治疗和用于防治因芦丁缺乏所致的其它出血症，如防治脑血管出血、高血压、视网膜出血、紫癜、急性出血性肾炎、慢性气管炎、血液渗透压不正常、恢复毛细血管弹性等症，同时还用于预防和治疗糖尿病及合并高血脂症。国内外医药工业中用芦丁作原料生产芦丁片、维脑路通(羟乙芦丁)、芦丁镁铬盐、多维葡萄糖羟丁芦丁、槲皮素等心血管药物。特别是羟乙基芦丁片因其适合于闭塞型脑血管病、中心性视网膜炎、动脉硬化、冠心病、梗塞前综合征、血栓性静脉炎等，扩大了芦丁产品的应用范围和疗效，使芦丁的需求量进一步增大。对于芦丁的提取，通常采用碱提取酸沉淀方法，此法是利用芦丁具有酸性，可与碱成盐而溶于水，再加酸使其成酸性后游离析出，再经重结晶得到较纯的芦丁。此法虽然多年来一直被视为较理想的方法，但是因为加热提取，常有一定的水解产物存在，并且产率较低。近年来，人们开始逐步探索运用新技术、新方法提取纯化芦丁，包括热水提冷析出方法，热水提大孔树脂吸附纯化法，超声法，超临界C02提取法，连续回流提取法，煎煮法，渗漉法等(孟祥颖。芦丁的来源、用途及提取纯化方法，长春中医学院学报，2003，第19卷第2期:61-64)。但是目前的这些方法，处理步骤都比较繁琐，大部分的方法都存在高温加热而出现水解产物，使后续处理步骤增加。为了充分利用药材，使芦丁能够从药材中以原本状态被制备出来，无需经过酸碱添加，无需加热，避免水解产物的掺杂，因此需要发展一种操作简便、易于规模化生产、高 效率、高纯度芦丁的制备方法。银杏叶为银杏科植物银杏(Ginkgo biloba)的干燥叶，其提取物具有活血化瘀通络的功效。现在药理研究表明，银杏叶中富含大量黄酮和银杏内酯。我国是银杏资源的古国和大国，全国有20多个省市区大面积种植银杏树，银杏资源占全世界的70%，银杏叶的总产量每年在2X 107kg以上，资源极大丰富。而目前我国芦丁的生产主要以槐米为原料进行提取。槐米是槐花的花蕾，资源少，不能充分满足市场的需求。因此利用银杏叶提取芦丁，可以缓解芦丁原料供应紧张的现状，扩大心血管药物的来源，具有重要的现实意义。二维液相色谱技术是一门新兴技术，是用两根性质相同或不同的色谱柱对复杂样品进行分离。作为一种分析复杂样品的理想工具，它已被广泛应用于医药卫生、食品科学、环境和农业科学等各个领域。近年来，随着二维液相色谱理论及应用的发展，二维制备液相色谱也逐渐发展起来。与单维制备液相色谱相比，二维制备液相色谱不但具有更高的峰容量，而且两维具有不同的选择性。经过第一维简化的组分可以在第二维上根据不同的选择性而实现互补分离。结构相似的化合物可能在第二维得到有效分离，从而提高制备的效率和化合物纯度。
发明内容
针对上述缺陷，针对目前芦丁的提取制备中会有水解产物掺杂，操作繁琐，药材利用率低，药材资源不足的问题，本发明提供了一种以银杏叶提取物为原料，采用二维液相色谱一质谱技术制备芦丁的方法。为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是:一种二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:步骤如下:从中药提取物中制备高纯度芦丁 ；将中药提取物溶于甲醇一水溶液，制得中药提取物溶液；采用分离纯化技术从中药提取物中制备高纯度芦丁 ；进一步地说:所述中药提取物为银杏叶提取物。更进一步地说:所述银杏叶提取物溶于25% - 75%的甲醇一水溶液，制得银杏叶提取物溶液，银杏叶提取物浓度为10 - 500mg/mL ；
所述银杏叶提取物溶于40 - 60%的甲醇一水溶液，银杏叶提取物浓度最佳为150 — 250mg/mL ；更进一步地说:所述分离纯化技术为二维液相色谱一质谱联用进行银杏叶提取物制备芦丁 ；采用液相色谱进行一维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG0采用液相色谱进行二维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG ；一维液相色谱制备采用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机相5 -65%等度或O — 50分钟有机相由5%提高到70%梯度进行；有机相为甲醇或乙腈，水相为水；对保留时间5 - 30分钟主成分为芦丁的组分进行收集，旋转蒸发至干，作为一维制备芦丁粗品；将一维制备芦丁粗品用25% - 75%的甲醇一水溶液溶解，至浓度为10 -80mg/mL ；对一维制备芦丁粗品，进行二维液相色谱制备；采用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机相5 - 30%等度或经O — 30分钟有机相由5%提高到40%梯度进行，二维制备根据质谱选择离子指导组分收集；有机相为甲醇或乙腈，水相为水；制备时流动相流速为60 - 120mL/min,制备时柱温为室温或25 — 40°C，制备时进样量为200 - 3000 μ L/针，检测器为DAD紫外检测器和质谱检测器；制备时流动相最佳流速为80 - lOOmL/min,制备时柱温为室温，制备时进样量为2000 — 2500 μ L/针，紫外检测器为360nm ；将二维液相色谱制备收集到的芦丁馏分进行旋转蒸发浓缩至干，得到芦丁化合物。更进一步地说:所述一维制备收集10 - 25分钟为主要含芦丁的组分，一维制备芦丁粗品用40% - 60%的甲醇一水溶液制成浓度为40 - 60mg/mL的芦丁粗品溶液。所述一维制备最佳流动相为乙腈(或含0.1%甲酸)与水(或含0.1%甲酸)，采用梯度方式，乙腈比例由10%经15 — 20分钟增加到15% — 25% ；更进一步地说:所述二维制备最佳流动相为乙腈(或含0.1%甲酸)与水(或含0.1%甲酸)，采用等度条件，乙腈(或含0.1%甲酸)浓度为10 - 15%，二维制备质谱选择离子为m/z = 303。由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明与现有技术相比具有以下特
占-
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I)、芦丁纯度高。由于本发明所用的技术方法，直接针对植物中所含的芦丁进行制备，无需经过加热、酸碱的变化，芦丁以在药材中本身存在的状态被制备出来，没有水解产物掺杂，因此得到的芦丁纯度高，达到80%以上。2)、方法简单易行，操作简便。本发明所涉及的制备高纯度芦丁的方法，仪器自动化程度高，操作方便、简单，常温常压下就可进行，适合大规模生产的需要。3)、药材来源广，易获得，价格便宜。银杏是我国特有的珍贵树种，占全世界资源的70%，银杏叶的总产量每年在2 X 107kg以上，资源极大丰富。三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂作为应用时间久、疗效明确、使用安全的中药注射剂，有着广泛的应用，而本发明 制得的高纯度芦丁是三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂中一种重要的原料。而本发明提供的制备方法，过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求，可用于舒血宁注射液、银杏叶酊剂原料高纯度芦丁的制备。
具体实施例方式实施例:本发明是以银杏叶提取物为原料，采用二维液相色谱一质谱技术制备高纯度芦丁的方法，芦丁的纯度可以达到80%以上。本发明为从银杏叶提取物中制备高纯度芦丁的方法，步骤如下:1、银杏叶提取物溶于25% - 75%的甲醇一水溶液，制得银杏叶提取物溶液，银杏叶提取物浓度为10 - 500mg/mL,最佳银杏叶提取物溶于40 — 60%的甲醇一水溶液，银杏叶提取物浓度最佳为150 — 250mg/mL。2、采用液相色谱进行一维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG0采用液相色谱进行二维制备的色谱柱为反相C18，反相CS，Click OEG0最佳二维色谱柱组合为一维为反相C18, 二维为反相C18。3、一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈与水混合，洗脱条件按照有机相5 - 65%等度或O — 50分钟有机相由5%提高到70%梯度进行。一维制备最佳流动相为乙腈(或含0.1%甲酸)与水(或含0.1%甲酸)，采用梯度方式，有机相比例由10%经15 - 20分钟增加至Ij 15 — 25%。4、对保留时间5 - 30分钟主成分为芦丁的组分进行收集，旋转蒸发至干，作为一维制备芦丁粗品。将一维制备芦丁粗品用甲醇一水溶解，至浓度为10 — 80mg/mL。一维制备最佳收集时间为10 - 25分钟，为主要含芦丁的组分，浓缩至浓度为40 - 60mg/mL。
5、对一维收集浓缩后的样品，进行二维液相色谱制备。采用的流动相为甲醇或乙腈与水混合，洗脱条件按照有机相5 - 30%等度或经O — 30分钟有机相由5%提高到40%梯度进行。二维制备最佳流动相为乙腈(或含0.1%甲酸)与水(或含0.1%甲酸)，采用等度条件，乙腈(或含0.1%甲酸)浓度为10 - 15% ;二维制备根据质谱选择离子指导组分收集，质谱选择离子为m/z = 303。6、制备时流动相流速为60 - 120mL/min，制备时柱温为室温或25 — 40°C，制备时进样量为200 - 3000 μ L/针，检测器为DAD紫外检测器和质谱检测器，质谱选择离子指导组分收集；最佳流速为80 - lOOmL/min,柱温为室温，进样量为2000 — 2500 μ L/针，紫外检测器为360nm。7、将二维液相色谱制备收集到的芦丁馏分旋转蒸发浓缩至干，得到高纯度的芦丁化合物。以下是根据本发明的具体实施方式
，结合实际，本发明提供了四种实施例。实施例1:称取银杏叶提取物10g，溶于50mL 50%的甲醇一水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为200mg/mL，过0.45 μ m微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用XUnionC18，流动相采用乙腈(含0.1%甲酸)为有机相，水(含0.1%甲酸)为水相，梯度洗脱方式:有机相浓度由10%经20分钟提高到25%。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为500 μ L/针，流动相流速为90mL/min，收集12 — 14分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备芦丁粗品。用40%的甲醇一水溶液溶解芦丁粗品，浓度为50mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为XUnionC18，流动相选择乙腈(含0.1%甲酸)为有机相，水(含0.1%甲酸)为水相，采用10%有机相等度洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为303，制备温度为室温，进样量为1000 μ L/针,流动相流速为90mL/min,收集m/z为303的懼分,旋转蒸发至干,得到芦丁化合物，经液相色谱分析， 纯度为99%，一维制备芦丁粗品中芦丁的含量为45%。实施例2:称取银杏叶提取物10g，溶于IOOmL 25%的甲醇一水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为10mg/mL，过0.45μπι微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用XTerra,流动相采用甲醇为有机相，水为水相，有机相浓度为65%等度，采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为40°C，进样量为200 μ L/针，流动相流速为60mL/min，收集
5- 7分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备芦丁粗品。用50%的甲醇一水溶液溶解芦丁粗品，浓度为10mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为XUnionC18，流动相选择甲醇(含0.1%甲酸)为有机相，水(含0.1%甲酸)为水相，采用梯度洗脱方式:有机相浓度由5%经30分钟提高到40%。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为303，制备温度为室温，进样量为3000 μ L/针，流动相流速为100mL/min，收集m/z为303的馏分，旋转蒸发至干，得到芦丁化合物，经液相色谱分析，纯度为80%，一维制备芦丁粗品中芦丁的含量为20%。实施例3:称取银杏叶提取物10g，溶于20mL 75%的甲醇一水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为500mg/mL，过0.45 μ m微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用ClickOEG，流动相采用甲醇(含0.1%甲酸)为有机相，水(含0.1%甲酸)为水相，采用5%有机相等度方式洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为30°C，进样量为3000 u L/针，流动相流速为120mL/min,收集25 — 30分钟的懼分,进行旋转蒸发浓缩至干,为一维制备芦丁粗品。用60%的甲醇一水溶液溶解芦丁粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为Click 0EG，流动相选择甲醇(含0.1%甲酸)为有机相，水(含0.1%甲酸)为水相，采用30%有机相等度洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为303，制备温度为25°C，进样量为200 u L/针，流动相流速为120mL/min,收集m/z为303的馏分，旋转蒸发至干，得到芦丁化合物，经液相色谱分析，纯度为85%，一维制备芦丁粗品中芦丁的含量为19%。实施例4:称取银杏叶提取物10g，溶于50mL 55%的甲醇一水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为200mg/mL，过0.45 y m微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用Click0EG，流动相采用甲醇(含0.1%甲酸)为有机相，水(含0.1%甲酸)为水相，采用梯度:有机相浓度由5%经50分钟提高到70%，采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为250C，进样量为2000 u L/针，流动相流速为80mL/min，收集18 — 22分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备芦丁粗品。用50%的甲醇一水溶液溶解芦丁粗品，浓度为50mg/mL,经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为XUnion CS,流动相选择甲醇(含
0.1%甲酸)为有机相，水(含0.1%甲酸)为水相，采用5%有机相浓度洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为303，制备温度为40°C，进样量为200 u L/针，流动相流速为60mL/min,收集m/z为303的懼分,旋转蒸发至干,得到芦丁化合物,经液相色谱分析，纯度为90%，一维制备芦丁粗品中芦丁的含量为23%。三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂作为应用时间久、疗效明确、使用安全的中药注射剂，有着广泛的应用，而本发明制得的高纯度芦丁是三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂中一种重要的原料。而本发明提供的制备方法，过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求，可用于舒血宁注射液、银杏叶酊剂原料高纯度芦丁的制备。申请人:声明， 本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，单本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
权利要求
1.一种二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:步骤如下: 从中药提取物中制备高纯度芦丁； 将中药提取物溶于甲醇一水溶液，制得中药提取物溶液； 采用分离纯化技术从中药提取物中制备高纯度芦丁。
2.根据权利要求1中所述的二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:所述中药提取物为银杏叶提取物。
3.根据权利要求2所述的二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:所述银杏叶提取物溶于25% - 75%的甲醇一水溶液，制得银杏叶提取物溶液，银杏叶提取物浓度为10 - 500mg/mL。
4.根据权利要求3所述的二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:所述银杏叶提取物溶于40 - 60%的甲醇一水溶液，银杏叶提取物浓度最佳为150 -250mg/mLo
5.根据权利要求1所述的二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:所述分离纯化技术为二维液相色谱一质谱联用进行银杏叶提取物制备芦丁； 采用液相色谱进行一维制备的色谱柱为反相C18，反相CS，Click OEG0采用液相色谱进行二维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG ； 一维液相色谱制备采用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机相5 - 65%等度或O — 50分钟有机相由5%提高到70%梯度进行；有机相为甲醇或乙腈，水相为水； 对保留时间5 - 30分钟主成分为芦丁的组分进行收集，旋转蒸发至干，作为一维制备芦丁粗品；将一维制备芦丁粗品用25% - 75%的甲醇一水溶液溶解，至浓度为10 - SOmg/mL ； 对一维制备芦丁粗品，进行二维液相色谱制备；采用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机相5 - 30%等度或经O — 30分钟有机相由5%提高到40%梯度进行，二维制备根据质谱选择离子指导组分收集；有机相为甲醇或乙腈，水相为水； 制备时流动相流速为60 - 120mL/min,制备时柱温为室温或25 — 40°C，制备时进样量为200 - 3000 μ L/针，检测器为DAD紫外检测器和质谱检测器；制备时流动相最佳流速为80 - 100mL/min，制备时柱温为室温，制备时进样量为2000 — 2500 μ L/针，紫外检测器为360nm ； 将二维液相色谱制备收集到的芦丁馏分进行旋转蒸发浓缩至干，得到芦丁化合物。
6.根据权利要求5所述的二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:所述一维制备收集10 - 25分钟为主要含芦丁的组分，一维制备芦丁粗品用40% - 60%的甲醇一水溶液制成浓度为40 - 60mg/mL的芦丁粗品溶液。
7.根据权利要求5所述的二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:所述一维制备最佳流动相为乙腈(或含0.1%甲酸)与水(或含0.1%甲酸)，采用梯度方式，乙腈比例由10%经15 — 20分钟增加到15% — 25%。
8.根据权利要求5所述的二维液相色谱一质谱联用制备高纯度芦丁的方法，其特征在于:所述二维制备最佳流动相为乙腈(或含0.1%甲酸)与水(或含0.1%甲酸)，采用等度条件，乙腈(或含0.1%甲酸)浓度为10 - 15%，二维制备质谱选择离子为m/z = 303。
全文摘要
本发明涉及医药技术领域，是一种二维液相色谱－质谱联用制备高纯度芦丁的方法，采用二维液相色谱－质谱联用技术，以甲醇－水或乙腈－水为流动相，以反相色谱柱为一维制备色谱柱，对银杏叶提取物进行组分切割，收集目标组分为芦丁粗品。再以反相色谱柱为二维制备色谱柱，在质谱选择离子峰指导下，对芦丁粗品进行组分切割，收集，旋转蒸发浓缩，得到高纯度的芦丁，纯度可以达到80%以上。本发明无需加热，避免水解产物的掺杂，制备过程简单、重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，降低了成本，适合大规模生产。
文档编号A61P9/12GK103120706SQ201210407589
公开日2013年5月29日 申请日期2012年10月23日 优先权日2012年10月23日
发明者丰加涛, 付冬梅, 王海涛, 冯志琼 申请人:北京华润高科天然药物有限公司