专利名称：一种复合生长因子及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种复合生长因子及其制备方法，同时还涉及利用该复合生长因子加工获得的凝胶剂。本发明还涉及该复合生长因子及复合生长因子凝胶剂在急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口等中的治疗作用。
背景技术：
慢性难治性溃疡，其定义为在各种内在或外界因素作用下，创面不能通过正常的创面愈合进程达到愈合，进入一种病理性炎症反应状态，导致创面经久不愈。随着我国逐渐进入老龄化社会，老年人口增多，尤其是在合并糖尿病、脉管炎及下肢静脉回流障碍的老年人群更为常见。这类患者伤口愈合较慢，需要长期住院，长期换药，往往经过多次清创手术却疗效不佳，甚至要截肢手术等，严重影响患者的生活质量。慢性难愈合伤口修复缓慢甚至修复停止主要有以下四种原因1、伤口感染或有坏死组织存在；2、伤口血供微循环差；3、局部生长因子数量减少，活性降低或多种生长因子网络调节失控；4、修复细胞支架改变和 过度凋亡，细胞膜上受体结构变化，导致生长因子与受体之间失耦联。传统的伤口换药和清创手术仅能清除局部感染灶或坏死组织，无法解决难愈合伤口的其他因素如重建供血，提高局部生长因子数量和活性，防止细胞过度换药多次清创后伤口往往越来越大。皮瓣移植能较好地修复慢性难愈合伤口，重建供血、对创伤后感染的慢性难愈合伤口有较好的修复效果。然而，对于糖尿病溃疡、褥疮、血管源性、神经源性或放射性慢性伤口，由于生长因子少，活性低，与受体失耦联增加，皮瓣移植在这些创面不易存活。慢性难愈合伤口治疗现状(1)手术治疗由于慢性溃疡患者大多同时合并有全身性疾患，手术治疗受到了很大限制。对可以耐受手术、术式可采用溃疡切除后游离植皮术或溃疡切除后局部皮瓣、肌皮瓣转移术。(2)物理治疗激光照射，目前选用He-Ne激光，也有用CO2激光或两者联用的；微波治疗，微波是一种超高频定向电磁波，对于改善局部血循环，增强机体免疫力有显著作用；封闭负压吸引、负压吸引给创口施加局部机械牵引力，使创面局部血运增加，促进肉芽组织健康生长。另外，还有高压氧疗法、离子导入法等物理疗法。(3)单一生长因子类治疗表皮细胞生长因子，表皮细胞因子作为主要的修复生长因子，调控创面修复的多个环节，影响创面修复质量和修复后重建。重组表皮细胞生长因子对老年人皮肤溃疡有明显的促进愈合作用，尤其是糖尿病患者。血管内皮细胞生长因子。血管内皮细胞生长因子是一种糖蛋白，能特异性地作用于血管内皮细胞，促进血管内皮细胞分裂、增殖和迁移，直接调节血管的新生、促血管生成的作用。同时，血管内皮细胞生长因子还能够促进血管内皮细胞产生降解血管外基质的蛋白酶类，降解细胞外基质，有利于新生血管长入，利于内皮细胞迁移和趋化，诱使汇聚的微血管内皮细胞侵入胶原凝胶，促进肉芽组织的生成；碱性成纤维细胞生长因子，碱性成纤维细胞生长因子促进毛细血管形成，可以加速慢性溃疡创面愈合。(4)组织工程皮肤，组织工程皮肤不仅提供能促进创面愈合所需的基质成分，而且通过不断分泌生长因子和细胞因子来加速创面愈合。组织工程皮肤为临床治疗各类型的皮肤缺损提供了新的途径，但仍没有一种产品可以满足创面修复在功能和外观上的需要。免疫排斥问题一直是组织工程皮肤的难题之一。(5)骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞具有很强的自我复制和多向分化的潜能。血小板凝胶(plateletgel, PG)是富血小板血衆(platelet rich plasma, PRP)按照一定比例与激活剂混合凝固而成凝胶状物质。近年来研究发现，血小板经凝胶酶/钙剂激活后，其α颗粒可释放出多种生长因子，这些生长因子对于治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口具有显著促进作用。同源异体的血小板来源广泛，可以充分利用无偿捐献的血液这一宝贵的资源，不用采集病人的自体血液，临床上可以广泛推广，同时解决了重组的生长因子价格昂贵，纯化困难，涉及基因重组的生物安全性等问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种血小板来源的复合生长因子，所述的复合生长因子包含多种符合人体比例的天然生长因子，血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β I (TGF-β I)、表皮生长因子(EGF)和类胰岛素样生长因子-1(IGF-1)0·本发明的另一个目的在于提供由上述复合生长因子添加壳聚糖微球载体加工获得复合生长因子凝胶剂。本发明的又一个目的在于提供上述复合生长因子和复合生长因子凝胶剂在制备治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口等药物中的应用。本发明的再一个目的是提供上述复合生长因子和复合生长因子的制备方法或加工程序。本发明所采取的技术方案为复合生长因子的制备方法，以浓度800X 109-1500X 109/L，优选为1000X 109/L的血小板为原料制备，具体包括以下步骤
(1)血小板浓缩液的病毒灭活米用S/D法病毒灭活对血小板浓缩液(PC)进行病毒灭活处理；
(2)去除病毒灭活处理后的血小板浓缩液中的有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)；
(3)血小板浓缩液的激活处理后的血小板浓缩液中加入钙剂或/和凝血酶激活，将混合物旋转混合，形成血小板凝胶，至上清析出，即得复合生长因子。所述钙剂为CaCl2或葡萄糖酸钙。所述凝血酶为人血凝血酶。本发明复合生长因子凝胶其制备方法为
(1)制备空白壳聚糖微球；
(2)精确称取空白壳聚糖微球，置于EP管中，加入乙酸缓冲液及富含血小板生长因子的溶液，充分振荡均勻，超声振荡，置于4°C、135rpm的摇床，6h后离心并用纯水洗漆,微球沉淀，冷冻冻干，得到壳聚糖复合生长因子缓释微球；
(3)取80%重量的纯化水，加入氯化钠、抑菌剂，加热使溶解；
(4)将上述溶液放在室温，加入PH调节剂，使其溶解；
(5)在上述溶液中加入氢氧化钠、增稠剂，溶胀过夜，高压灭菌(在121.6°C，0.1Mpa下灭菌20分钟)，得凝胶A;
(6)将步骤(2)所制备的壳聚糖复合生长因子缓释微球精确称重后，放在EP管中，加入PBS缓冲液中，充分振荡，使其充分溶胀，然后加入保湿剂、蛋白稳定剂，搅拌使其溶解，微孔滤膜过滤后得混合溶液B;
(7)将混合溶液B与凝胶A混合，搅拌均匀，调节PH值到6.5^7. 5 ；
(8)加入余量的纯化水，灭菌，即得复合生长因子凝胶剂。本发明所获得的复合生长因子符合人体天然比例，克服了临床上的单一重组生长因子制品价格昂贵、纯化困难、涉及基因重组的生物安全性等问题。本发明利用上述复合生长因子通过添加壳聚糖微球载体加工获得的复合生长因子凝胶剂，使用过程中可以缓慢释放生长因子，有明显促进糖尿病慢性难愈合创面肉芽组织增殖、毛细血管增殖、巨噬细胞增殖和创缘新生上皮生长移行的作用。可应用于治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口等，而且使用方便，安全性高。
图1是不同血小板浓度对于ECV304细胞增殖的影响。
具体实施例方式为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述。实施例1适合临床治疗的生长因子浓度的确定
富血小板血浆(PRP)中不同浓度血小板制备的血小板凝胶(PG)上清对ECV304细胞增殖实验对照组血小板浓度为0X109/L，实验组浓度分别为500X107L、1000X 109/L、1500X 109/L、2000X 109/L、2500X 109/L、3000X 109/L 六种浓度；激活剂选择含有 1000U/ml人血凝血酶的10%葡萄糖酸钙溶液，PRP与激活剂比例为10:1，在24h检测细胞增殖情况。结果显示在血小板浓度范围150(T2500X 109/L时，随着血小板浓度的增高，所制备的血小板凝胶(PG)上清促进细胞的增殖效果明显；当血小板个数达到1000 2500X107L时，其细胞增殖能力缓慢增加，但增加效果不够明显；而当血小板个数达到3000X 109/L时，其增殖能力反而有所下降(附图1)。临床实际制备的机器单采血小板浓度波动于1000 X 109/L上下，并且血小板浓度增加，成本将大大增加，效果却增加不显著，故我们实验中选用1000 X 109/L作为血小板的使用浓度来制备血小板凝胶(PG)较为经济、实用。实施例2复合生长因子的制备方法
(1)血小板浓缩液的病毒灭活将血小板浓缩液装在含有有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)的容器中，所述有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)选用1%的TnBP和l%TritonX_45的混合物，将有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)与血小板浓缩液的混合物振荡一分钟使其充分混合，然后放置于31°C的水槽中，不断振荡至少一小时；
(2)油的萃取在步骤(I)振荡后的有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)与血小板浓缩液的混合物中加入适量(10% (v/v))大豆油中，摇匀，然后放到旋转的振荡器上振荡20分钟，血小板部分(下层)从油(上层)中倒出来，在重力作用下放入另一个容器中，进行第二次油萃取；油萃取后使得TnBP和TritonX-45均减少至低于IO-1OOp. p. m.；
(3)柱层析将步骤(2)油萃取后的有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)与血小板浓缩液的混合物在室温下离心，经疏水作用色谱处理，色谱材料填充在柱里，并用5倍体积的IM的氯化钠和20%的酒精以一定流速注入，流出物就是富含生长因子的血小板浓缩液；
(4)血小板的激活释放物的制备100ml的富含生长因子的血小板浓缩液通过添加IMCaCl2，至CaCl2终浓度为23mM，产生内源性的凝血酶，诱导纤维蛋白原聚合和血小板的激活，轻柔旋转混合物，直到血小板凝胶形成，Ih后，上清恢复，即得复合生长因子。所述步骤(I)中血小板浓缩液(PC)是用全自动血液成份分离机通过白膜法制备，用计数仪计数，所述血小板浓缩液的浓度为1000X 109/L，所述血小板浓缩液(PC)要在制备的24小时之内用有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)处理。实施例3生长因子的测定
分别从原始的血小板浓缩液中、油萃取后的血小板浓缩液中、柱层析之后的血小板浓缩液中各提取Iml样本，均进行以下处理将样本在IOOOOXg的离心力下离心15min，获得血小板和细胞裂解的上清，然后迅速冰冻在_80°C的冰箱。用ELISA试剂盒测定，按照ELISA试剂盒的说明书操作即可，在37°C融化，Ih之内分析。标准品和样本都是测定双份，计算平 均值。结果乘以样本的稀释倍数。采用上述方法测定实施例2所制备的复合生长因子，检测得知，实施例2制备得到的复合生长因子中，每IL血小板浓缩液中含有血小板生长因子(PDGF)为7 33μ g，血管内皮生长因子(VEGF)为O. 2、. 6 μ g，转化生长因子-β I (TGF-β I)为3广113 μ g，表皮生长因子(EGF)为O. 2 O. 5 μ g，类胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)为33 65 μ g。实施例4复合生长因子凝胶剂的制备
(O制备空白壳聚糖微球参照Berthold方法并加以改进。将O. 2g壳聚糖溶解于80ml 2%冰乙酸溶液中，加入吐温-80 1ml，磁力搅拌1. (Γ2. 0h，超声振荡除去气泡，得澄清液体。室温磁力搅拌下缓慢滴加2. 5g/L三聚磷酸钠溶液16ml，至溶液浑浊，继续磁力搅拌lh，在IOOOOrpm离心15min，所得沉淀纯水反复离心洗涤3次，收集送冷冻冻干；
(2)制备壳聚糖复合生长因子缓释微球精确称取壳聚糖冻干微球20mg于EP管中，力口入乙酸缓冲液O. 9ml及富含血小板生长因子的溶液O. 1ml，充分振荡均匀，超声振荡，置于4°C摇床(135rpm),6h后离心并用纯水洗涤3次，微球沉淀，冷冻冻干，收集离心液和洗涤上清液；
(3)复合生长因子凝胶剂的制备
每IOOOg复合生长因子凝胶剂中含有
血小板衍生生长因子 7. 7Γ32. 75 μ g 血管内皮生长因子 0.29 O. 59 μ g 转化生长因子-β I 31. 8Γ112. 57μ g 表皮生长因子O. 23、. 43 μ g
类胰岛素样生长因子-1 33. Γ64. 08 μ g 壳聚糖l(T20g
增稠剂l(T20g
蛋白稳定剂0.25 0.45g
保湿剂O. 4^0. 6g
PH调节剂调节PH至6. 6 7. O
抑菌剂1. 2^2. 2g加入纯化水至IOOOg 所用的原料来源如表1:
权利要求
1.一种血小板来源复合生长因子，其特征在于，是以浓度800X 109-1500X 109/L的血小板为原料首先通过S/D法病毒灭活后加入钙剂或/和凝血酶激活形成血小板凝胶，得到的上清。
2.根据权利要求1所述的复合生长因子，其特征在于，是以最佳浓度IOOOX109/L的血小板为原料首先通过S/D法病毒灭活后加入钙剂或/和凝血酶激活形成血小板凝胶，得到的上清。
3.根据权利要求1所述的复合生长因子，其特征在于，所述复合生长因子中包含血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β I (TGF-β I)、表皮生长因子(EGF)和类胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)0
4.根据权利要求1或2所述的复合生长因子，其特征在于，所述钙剂为CaCl2或葡萄糖酸钙。
5.根据权利要求1或2所述的复合生长因子，其特征在于，所述凝血酶为人血凝血酶。
6.根据权利要求1-3任一项所述复合生长因子在制备治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口药物中的应用。
7.一种复合生长因子凝胶，其特征在于，是由权利要求1-3任一项所述的复合生长因子添加壳聚糖微球、增稠剂、蛋白稳定剂、保湿剂、PH调节剂、抑菌剂和水等物质加工形成的。
8.根据权利要求1-3任一项所述的复合生长因子，其制备方法为 (1)血小板浓缩液的病毒灭活米用S/D法病毒灭活对血小板浓缩液(PC)进行病毒灭活处理； (2)去除病毒灭活处理后的血小板浓缩液中的有机溶剂/去污剂混合物(S/D溶液)； (3)血小板浓缩液的激活处理后的血小板浓缩液中加入钙剂或/和凝血酶激活，将混合物旋转混合，形成血小板凝胶，至上清恢复，即得复合生长因子。
9.根据权利要求7所述的复合生长因子凝胶，其制备方法为 (1)制备空白壳聚糖微球； (2)精确称取空白壳聚糖微球，置于EP管中，加入乙酸缓冲液及富含血小板生长因子的溶液，充分振荡均勻，超声振荡，置于4°C、135rpm的摇床，6h后离心并用纯水洗漆,微球沉淀，冷冻冻干，得到壳聚糖复合生长因子缓释微球； (3)取80%重量的纯化水，加入氯化钠、抑菌剂，加热使溶解； (4)将上述溶液放在室温，加入PH调节剂，使其溶解； (5)在上述溶液中加入氢氧化钠、增稠剂，溶胀过夜，高压灭菌，得凝胶A; (6)将步骤(2)所制备的壳聚糖复合生长因子缓释微球精确称重后，放在EP管中，加入PBS缓冲液中，充分振荡，使其充分溶胀，然后加入保湿剂、蛋白稳定剂，搅拌使其溶解，微孔滤膜过滤后得混合溶液B ； (7)将混合溶液B与凝胶A混合，搅拌均匀，调节PH值到6.5^7. 5 ； (8)加入余量的纯化水，灭菌，即得复合生长因子凝胶剂。
10.根据权利要求7或9所述的复合生长因子凝胶在制备治疗急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口药物中应用。
全文摘要
本发明公开了一种血小板来源的复合生长因子及其制备方法与应用。采用富血小板血浆为原料，首先通过S/D法病毒灭活后，去除其中的有机溶剂和去污剂等试剂，然后加入钙剂或/和凝血酶激活，提取激活后的上清液，即得到符合人体天然比例的复合生长因子，克服了临床上的单一重组生长因子制品价格昂贵、纯化困难、涉及基因重组的生物安全性等问题。本发明还公开了利用上述复合生长因子通过添加壳聚糖微球载体加工获得复合生长因子凝胶剂，使用过程中可以缓慢释放生长因子，对于急性创伤、烧伤、整形美容、慢性难愈合伤口具有显著的促进作用，而且使用方便，安全性高。
文档编号A61K35/14GK102988964SQ20121043407
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月2日 优先权日2012年11月2日
发明者单桂秋, 马静, 李艳辉, 丘金浪, 谭美芳, 耿文艳 申请人:广州军区广州总医院