用于使用抗-整合素改善抗血管生成疗法的方法和组合物的制作方法
【专利摘要】本文描述了用于治疗肿瘤和转移的方法和组合物，其改善了抗-血管生成疗法。通过用抗-β1整合素组合物和抗-血管生成组合物组合抑制生物系统中的这些机制，肿瘤和转移可以被剥夺充足的血液供给，从而导致肿瘤细胞生长停滞和可能的消退，包括肿瘤细胞死亡。在一种药物组合物或多种药物组合物中，本组合物包含抗-β1整合素剂与抗-VEGF剂的组合。还描述了治疗方法和成像方法。
【专利说明】用于使用抗-整合素改善抗血管生成疗法的方法和组合物
[0001]发明人:WarrenShawn Carbonell 和 Manish Aghi
[0002]相关申请的交叉引用
[0003]本申请要求2011年3月23日提交的美国临时专利申请号61/466，791的优先权，其在此通过引用整体被并入。
[0004]政府支持的声明
[0005]无
[0006]序列表、计算机程序或光盘的引用
[0007]本申请包含已通过EFS-Web以ASCII格式提交的序列表并在此通过引用整体被并入。所述ASCII拷贝，于2012年I月31日创建，被命名为“479-lOOSequence Listing,txt”且大小为5，287字节。
[0008]发明背景
发明领域
[0009]本发明涉及用于癌症包括转移癌的治疗组合物和疗法、特别是针对肿瘤血管化的疗法的领域。
[0010]相关技术
[0011]下面呈现了关于本发明某些方面的背景信息，尽管它们可能涉及详述中提及的技术特征，但不必然地被详细描述。`即，本发明所使用的单独的部分或方法可在下面所讨论的材料中被更详细地描述，这些材料可向本领域技术人员提供用于制造或使用如所要求保护的本发明的某些方面的进一步的指导。下面的讨论不应被解释为承认信息与本文任何权利要求的相关性或所描述的材料的现有技术效果。
[0012]已鉴定许多分子为具有血管生成的特征。然而，迄今为止被鉴定最有效的是血管内皮生长因子-A (VEGF-A)o这是药物贝伐单抗(又名，阿瓦斯汀? Genentech, SouthSan Francisco, CA)的祀标，其已在患有包括结肠和直肠[Hurwitz等人，New EnglandJournal of Medicine350:2335-2342 (2004)]、乳腺[Miller 等人，New England Journalof Medicine357:2666-2676 (2007)]、肺[Sandler 等人，New England Journal ofMedicine355:2542-2550(2006)]、肾[Escudier 等人，The Lancet370:2103-2111 (2007)]和脑[Friedman 等人，Journal of Clinical Oncology,do1: 10.1200/JC0.2008.19.8721(2009)]的各种晚期-阶段的癌症的患者中显示临床前景。与VEGF-A本身不同，被设计抗VEGF-A受体的药物也已在最近的临床试验中显示相似的前景。
[0013]雷珠单抗⑧(兰尼单抗)也是重组的人源化抗-VEGF抗体。兰尼单抗与多种VEGF-A亚型结合。作为抗体片段，兰尼单抗被设计为具有48kD分子量的小分子。它被包装用于玻璃体内使用，而非静脉内或瘤内使用。
[0014]VEGF-A是血管生长因子家族的最具特征的并可能是最有效的成员[Ferrara和Gerber, Acta Haematological06:148-156 (2002)]。目前，其他成员包括 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF。这些因子通过至少三个已知的受体酪氨酸激酶:VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3传递信号。
[0015]不幸地，抗-血管生成假说的预测迄今为止还没有在临床中实现[Greenberg和Cheresh, Expert Opinion on Biological Therapy9:1347-1356 (2009)]。贝伐单抗治疗和化疗结合最多导致存活延长仅4.7个月的中值[Hurwitz等人，New England Journal ofMedicine350:2335-2342 (2004)]。患者最终死于持续的癌症发展。该耐药性机制是有争议的并可反映血管生成假说的无效或肿瘤细胞获取可替代的血管源的能力。
[0016]本领域的治疗策略过分依赖于基于血管生成的肿瘤血管化的单一的概念。对抗-血管生成疗法的临床耐药性很可能是由于肿瘤细胞利用用于获得血管结构的可替代的方法。已描述了多种类型的肿瘤血管化过程，包括血管扩张、血管重塑、血管共选择(co-option)、血管套叠(vascular intussusception)、肾小球样血管形成、伪血管形成和循环内皮祖细胞[在 Dome 等人,American Journal of Patho logy 170:1-15 (2007)中被综述]。
[0017]本领域中一些策略已提出用于抑制肿瘤血管化的组合治疗策略。然而，这些策略仅靶向肿瘤血管化的血管生成方面或提出新的肿瘤血管的靶向血管破裂。迄今为止，现有技术中没有提供通过向生物系统施用靶向血管生成生长信号传导和基于粘附的共选择信号传导二者组合的化合物用于完全抑制肿瘤和/或转移血管化的治疗策略。
[0018]具体的专利和出版物
[0019]Park 等人(2009 年 11 月 17 日授权的美国 7，618，627，“Method of increasingradiation sensitivity by inhibition of beta-one integrin”)使用抗-β I 整合素抗体ΑΙΙΒ2与电离辐射联合以促进肿瘤细 胞凋亡。
[0020]Theodore Yednock[美国专利 6，O33，665 (2OOO) ] “Compositions and methodsfor modulating leukocyte adhesion to brain endothelial cells.，，这是已被FDA批准用于临床使用的导致抗-整合素治疗药物的首批专利之一(抗α 4-β I的Tysabri ?用于治疗多发性硬化，Elan Pharmaceuticals, Inc.)。
[0021]Friess等人[美国专利申请0050385A1 (2008)]提出了用靶向血管生成相关的生长因子的抗-VEGF抗体和抗-HER2抗体二者的组合治疗。
[0022]Senger等人[美国专利6，596，276 (2003)]提出了施用抗α I和/或α 2整合素亚基的抑制抗体以靶向VEGF介导的血管生成的这些下游效应子。
[0023]Bissell 等人[美国专利 5，846，536 (1998)和美国专利 6，123，941 (2000)]公开了用于通过向需要此治疗的组织的P1整合素受体施用有效量的^整合素功能-封闭抗体或整合素功能的肽抑制剂逆转组织中的恶性表型的方法。
[0024]发明概述
[0025]以下的概述并不预期包含本发明的所有特征和方面，也不暗示本发明必须包含该概述中所讨论的所有特征和方面。
[0026]本发明总体上包含用于抑制肿瘤细胞生长的药物组合物，包括:为VEGF活性诸如VEGF信号传导和/或与VEGF受体结合的抑制剂的第一剂；和阻断β I整合素的第二剂。阻断β I整合素能够阻断细胞附着、阻断细胞附着后发生的β_整合素细胞内信号传导或二者。所使用的剂是物质，诸如肽或小分子的组合物。它们可以是抗体或抗体-样分子。剂的组合具有协同效应，即，比单独的任一剂更有效。剂可以是单一组合物或匹配配对的组合物。
[0027]在某些方面，本发明包含用于抑制肿瘤细胞生长的方法。通常，本方法包括用于抑制肿瘤细胞生长的方法，包含向患有所述肿瘤的受试者施用以下物质的步骤:为抗-血管生成剂的第一剂；和阻断由β I整合素介导的肿瘤细胞与细胞外基质(extracellularmatrix)相互作用和β I整合素信号传导的第二剂的组合，据此肿瘤细胞生长被抑制至比由单独的第一剂或第二剂所引起的抑制更大的程度，即，协同地抑制。优选的受试者是患有肿瘤的人受试者。
[0028]在一个实施方案中，本方法包含施用抗- β I整合素抗体与拮抗性抗-VEGF受体、抗-VEGF(例如抗-VEGF-A)抗体联合的剂量。下面进一步详细描述了多种抗-VEGF和抗-整合素剂。用于向患者递送被组合的抗体的方法将是临床肿瘤学领域中具有普通医疗、护理或类似医疗保健技能的人员众所周知的。可通过任何临床手段、特别是肠胃外或瘤内注射施用本组合物。还可在手术切除之后将本组合物直接施加至机体内的实际的或潜在腔，包括肿瘤床。也可以以临床上适当的间隔施用提高血管通透性的剂。这些可增强某些器官诸如中枢神经系统(CNS )中治疗物质 的递送。另外，可在包括放疗和化疗的治疗之前、期间或之后给予辅助治疗方案。可提供实施方案的重复施用以获得期望的临床效果。
[0029]附图简述
[0030]图1A、1B和IC分别是显示响应急性低氧损害的U87MG神经胶质瘤细胞(1A)、MDA-MB-231乳腺癌细胞(IB)和SW1080结直肠癌细胞(I)的β I整合素(MFI)的增加的一系列的三张条形图。
[0031]图2Α和2Β是显示具有(2Α)和不具有(2Β)贝伐单抗处理的处理下染色神经胶质瘤肿瘤异种移植物以确定整合素βI表达的一组照片。
[0032]图3Α是显示不同增殖条件的U87MG神经胶质瘤细胞中整合素β I表达的条形图；图3Β是显示整合素β I表达和增殖之间相关性的散点图。
[0033]图4Α和4Β是来自多形性胶质母细胞瘤的患者样本的一组照片，显示经染色以确定存在正常血管结构(4Α)中和血管生成肾小球样血管(4Β)处整合素β I表达的细胞。
[0034]图5是在原代胶质母细胞瘤和抗血管生成逃避(evasive)胶质母细胞瘤的情况下绘制整合素β I表达的条形图。
[0035]图6是显示由不同剂量的ΑΙΙΒ2对原代胶质母细胞瘤细胞系的细胞生长抑制和当ΑΙΙΒ2与低氧(1%氧气持续48小时)组合时对其的协同生长抑制的条形图。
[0036]图7Α和7Β是显示三种不同的敲低细胞系的整合素β I表达(7Α)和增殖(7Β)的一组条形图，其中整合素βI敲低显示大体上较低的表达和增殖。
[0037]图8是显示处于不同浓度的ΑΙΙΒ2时，抗血管生成耐受性胶质母细胞瘤细胞系中月旲联蛋白和Ki67调亡标志物的表达的条形图。
[0038]图9是显示不同浓度的AIIB2抗体下原代GBM细胞系的细胞生长的条形图。
[0039]图10是显示不同的抗体处理下小鼠肿瘤模型中肿瘤体积变化的图。标记“组合(combo)”的图是AIIB2和贝伐单抗的组合。箭头显示处理的开始。
[0040]图11是显示用不同浓度的AIIB2处理超过2天的生长期和汇合培养(生长停滞)中GBM细胞的细胞生长随时间推移的条形图。IgG被用作对照。
[0041]图12是显示经受持续2天的低氧、随后在常氧下生长的GBM细胞的细胞生长随时间推移的条形图。给予细胞IgG (对照)和不同浓度的AIIB2。
[0042]图13是显示两周一次测量对照IgG (10mg/kg)(菱形)、贝伐单抗(10mg/kg)(正方形)或贝伐单抗(lmg/kg)和AIIB2 (lmg/kg)的低剂量交替的组合疗法(圆形)情况下的U87MG神经胶质瘤肿瘤的肿瘤生长随时间推移的线性图。
[0043]优选实施方案的详述
[0044]定义
[0045]除非另外定义，本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域内普通技术人员所普遍理解的相同的含义。尽管与本文所描述的方法和材料相似或等同的任何方法和材料可被用于本发明的实施或检测，描述了优选的方法和材料。通常，使用与细胞和分子生物学和化学相关的术语及细胞和分子生物学和化学的技术是本领域众所周知的和普遍使用的术语和技术。没有具体定义的某些实验技术，通常根据本领域众所周知的常规方法和如贯穿本说明书被引用和被讨论的多种一般的和更具体的参考文献中描述的被实施。为了清楚的目的，下面定义了以下的术语。
[0046]“VEGF”指的是血管内皮生长因子，还称为血管内皮生长因子(vasoendothelialgrowth factor),在Genbank登录号AAA35789中具有示例性的氨基酸序列，在Leung等人“Vascular endothelial growth factor is a secreted angiogenic mitogen, ”Science246(4935), 1306-1309(1989)中被进一步描述。VEGF是与血小板衍生生长因子(“TOGF”)有关的二聚的、二硫键连接的46-kDa的糖蛋白。它由正常的细胞系和肿瘤细胞系产生；是内皮细胞选择性有丝分裂原；在体内检测体系(例如，兔角膜)中显示血管生成活性；是内皮细胞和单核细胞趋化的；并在内皮细胞中诱导纤溶酶原激活物，其参与毛细血管形成过程中的细胞外基质的蛋白水解的降解中。一些VEGF的亚型是已知的，尽管它们显示可比的生物活性，但其在分泌它们的细胞类型和它们的肝素结`合能力方面存在不同。VEGF的细胞受体(VEGFR)是跨膜受体酪氨酸激酶。它们通过具有7个免疫球蛋白-样的结构域和I个细胞内酪氨酸激酶结构域的胞外域被表征。已表征了不同类型的VEGF受体，包括VEGFR-1 (还称为flt-1)、VEGFR-2 (还称为KDR3)和VEGFR-3。大量的人类肿瘤，特别是神经胶质瘤和癌，表达高水平的VEGF和VEGFR。这已导致了以下假说:由肿瘤细胞释放的VEGF以旁分泌的方式刺激毛细血管的生长和肿瘤内皮的增殖并通过改善的血液供给加快肿瘤生长。
[0047]术语“VEGF抑制剂”指的是减弱通过VEGF-VEGFR通路的信号传导的物质或方法。VEGF抑制剂可以是，例如，小分子，肽，多肽，蛋白、更具体地包括抗体、包括抗-VEGF抗体、抗-VEGFR抗体、胞内抗体、大抗体(maxibody)、微抗体(minibody)、双体，Fe融合蛋白诸如肽抗体、受体抗体(receptibody)、可溶性VEGF受体蛋白和片段和多种其他的。目前优选的VEGF抑制剂是肽，诸如基于抗体的抑制剂。许多VEGF抑制剂通过与VEGF或与VEGF受体结合起作用。其他的则通过与结合至VEGF或结合至VEGF受体的因子或与VEGF信号传导通路中的其他组成部分结合较为间接地起作用。又其他的VEGF抑制剂通过改变调节VEGF通路信号传导的调节性翻译后修饰起作用。根据本发明的VEGF抑制剂还可通过较为间接的机制起作用。无论参与什么机制，如本文所用的，相对于在不存在抑制剂时处于相同环境中的VEGF信号传导通路的有效活性，VEGF抑制剂减弱了给定环境中的VEGF信号传导通路的有效活性。另一种VEGF抑制剂是基于核酸的，使用RNAi的抑制剂，如下面所描述的。
[0048]术语“人源化”指的是为包含源自非-人免疫球蛋白的最少序列的嵌合抗体的非-人(例如，啮齿动物)抗体的形式。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受者抗体)，其中，来自受者高变区的残基被来自非-人物种诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物的具有期望的特异性、亲和性和能力的高变区(供体抗体)的残基所代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的构架区(FR)残基被相应的非-人残基所代替。此外，人源化的抗体可包含受者抗体或供体抗体中没有发现的残基。做出这些修饰以进一步完善抗体性能。通常，人源化的抗体将包括至少一个且通常两个可变域的基本上所有，其中所有或基本上所有的高变环对应于非-人免疫球蛋白的高变环且所有或基本上所有的FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化的抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。关于进一步的详细信息，见Jones等人，Nature321:522-525 (1986) ;Riechmann等人，Nature332:323-329(1988);和 Presta, Curr.0p.Struct.Biol.2:593-596 (1992)。
[0049] 术语“对流曾弓黾的递.送(convection enhanced delivery)，，丰旨的是.用于通.1寸克服血脑屏障将药物递送至脑的方法。对流增强的递送由R.Hunt Bobo等人在Proc.Natl.Acad.Sc1.USA(1994 年 3 月，第 91 卷，第 2076-2080 页；uConvection-enhanced deliveryof macromolecules in the brain”)中首次描述。对流增强的递送包括通过颉骨钻孔将一些导管立体定向地放置入脑实质及后续治疗剂通过微量注射泵的注入。通过静脉内注射并穿过血脑屏障或通过脑室内注射的大部分药物的局部递送进入脑的标准方法依赖于扩散，其导致大部分剂的非均匀的分布。静脉内施用药物至脑被血脑屏障所阻碍，其阻止了大分子的通过。脑血屏障由血管内皮细胞之间的紧密连接所表征，其阻止或阻碍多种天然存在和合成的物质(包括抗癌药物)进入脑。不同于依赖于扩散的技术，对流增强的递送使用在注入导管的尖端所建立的压力梯度将药物推进细胞外间隙。目的是比通过单独的扩散施用时更均匀地、以更高浓度地并经更大区域地分布药物。治疗剂的对流增强的递送可在使用肿瘤切除的开颅术之后进行。药物的对流增强的递送由Yael Mardor等人在Cancer Research (2005 年 8 月，第 65 卷，第 6858-6863 页；〃Convection_enhanced drugdelivery:1ncreased efficacy and magnetic resonance image monitoring")中详细描述。
[0050]术语“人单克隆抗体”指的是基本上没有非-人(例如，小鼠)序列的抗体。它可以是完全人的或如本领域已知的通过去除除了抗体结合区之外的小鼠序列，Fv部分或CDR区而人源化的。
[0051]术语“ 抗体”还包括多种形式的经修饰的或经改变的抗体，诸如多种片段诸如Fv片段、仅包含轻链和重链可变区的Fv片段、由二硫键连接的Fv片段(Brinkmann等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 90:547-551 (1993))、包含可变区和部分恒定区的 Fab或(Fab)’2片段、单链抗体和类似的抗体(Bird等人，Science242:424-426 (1988)；Huston 等人，Proc.Nat.Acad.Sc1.USA85:5879-5883 (1988))。抗体最初可以是动物的(特别是小鼠或大鼠)或人源的或可以是嵌合的(Morrison等人，Proc Nat.Acad.Sc1.USA81:6851-6855 (1984)) ο 它可如 Jones 等人，Nature321:522-525 (1986)和公布的 UK 专利申请#8707252中所描述的被人源化。
[0052]术语“细胞外基底物质(extracellular substrate)”指的是用于细胞结合的物质，并可包含所定义的组织诸如血管结构(血管内皮细胞)或细胞外基质(ECM)，即，除了执行多种其他重要功能之外通常向动物细胞提供结构支撑的动物组织的细胞外部分；它由纤维蛋白和糖胺聚糖的交错的网构成。
[0053]术语“shRNA”指的是短发夹RNA。
[0054]术语“RNAi”指的是RNA干扰。RNAi是转录后、靶向基因沉默的技术，其使用双链RNA (dsRNA)以降解包含与dsRNA相同序列的信使RNA (mRNA) (Sharp, P.A.和Zamore, P.D.287，2431-2432 (2000) ；Zamore, P.D.等人，CelllOl, 25-33 (2000).Tuschl, T.等人，Genes Dev.13，3191-3197 (1999) ； Cottrell T R 和 Doering T L.2003.TrendsMicrobiol.11:37-43 ；Bushman F.2003.Mol Therapy.7:9-10 ；McManus M T 和 Sharp PA.2002.Nat Rev Genet.3:737-47)。当内源的核糖核酸酶将较长的dsRNA裂解为较短，例如，21-核苷酸或22-核苷酸-长的RNA，称为小干扰RNA或siRNA时，发生该过程。随后，较小的RNA区段介导祀mRNA的降解。用于合成RNAi的试剂盒是例如从New England Biolabs或Ambion市售可得。在一个实施方案中，本文所描述的用于反义RNA的一种或多种化学品可在介导RNAi的分子中被采用。
[0055]术语“药物组合物”指的是包含以指定量与药学上可接受的稀释剂、稳定剂、赋形剂等组合的所列举的治疗剂的产品或一组产品。术语“药学上可接受”指的是具有足够的纯度和质量用于制备本发明的药物组合物、药品或药剂，并当适当地施用至动物或人时不会产生不利的、过敏的或其他不良反应的分子实体和组合物。由于人类使用和兽医使用二者同样被包含在本发明的范围内，药学上可接受的制剂将包括用于人或兽医使用的药物组合物、药品或药剂。
[0056]在本发明涉及方法、药物组合物的某些方面，可包含单一的剂，但根据本方法，在疗程中与其他剂一起被施用。
[0057]一般方法和材料
`[0058]本文描述了用于治疗肿瘤和转移的改进的方法和组合物，其通过I)血管的新生或重塑(B卩，血管生成)与2)通过直接的粘附互作(B卩，共选择(co-option))利用现有血管的组合识别肿瘤血管化的双重机制。通过抑制生物系统中两种机制的组合，肿瘤和转移可被剥夺足够的血液供给，导致肿瘤细胞生长停滞和可能的消退，包括肿瘤细胞死亡。本方法在科学研究和医疗保健中具有多种用途，其中血管化是疾病过程特别是癌症中的促进因素。在另外的实施方案中，可通过同时或顺序地加强血管生成和粘附血管共选择二者实现用于组织修复或代替的血管化的增强。
[0059]目前靶向VEGF通路的抗血管生成疗法是由Genentech的阿瓦斯汀? (贝伐单抗)带领下的具有2009年销售总额61亿美元的快速增长的市场。然而，阿瓦斯汀⑧仅显示中度的临床成功。其在结肠癌中最多增加4.7个月的总存活期且在脑癌(多形性胶质母细胞瘤，GBM)中最多增加4.2个月的无进展存活期。甚至更令人沮丧的是，如已在UK发生的，FDA正考虑推翻他们关于在转移性乳腺癌中使用阿瓦斯汀?的批准。
[0060]阿瓦斯汀?被认为通过阻止新血管形成(血管生成)发挥作用，因此使肿瘤细胞经受葡萄糖和氧的饥饿。尤其，β I整合素在肿瘤细胞中的氧缺乏(又名，低氧)过程中被上调。在取自具有失败的阿瓦斯汀?治疗的患者的GBM细胞中，与未处理的原代GBM细胞相比，该靶标被上调了 50χ至200χ。有趣的是，它在肿瘤细胞增殖过程中和Y辐照之后也被上调，表明了在有丝分裂和细胞存活中的双重角色。抑制该靶标还可在ECM支架(例如，间质和血管基底膜)上阻止肿瘤细胞的依赖整合素的入侵。[0061]本发明的一个方面包括在具有用抗-VEGF抗体诸如阿瓦斯汀? (贝伐单抗)治疗失败的患者中使用抑制β I整合素的剂。如下面描述的，这已被体外和体内证明。短语“失败的抗VEGF抗体治疗”此处以其临床意义使用。贝伐单抗失败的临床定义为:1)从开始就无响应(通常70%的患者)和2)初始响应之后面对治疗时疾病进展。对于进展存在多种客观的临床标准，但最常用的(并特别在贝伐单抗临床试验中所使用的)一个标准是McDonald标准。通常让任一组中的患者服用贝伐单抗并随后被再次手术(28天之后，由于贝伐单抗使得你容易出血)并被服从于可能的三线治疗或临终关怀。因此，人们认为抗_β I组合物能够作为用于具有失败的贝伐单抗的3L GBM的单一疗法。
[0062]血管共诜择
[0063]Holash 等人(1999; Science284:1994-1998 “vessel co-option, regression andgrowth in tumors mediated by angiopoietins and VEGF”)在小鼠神经胶质瘤模型中说明了最初通过共选择现有宿主血管而生长的一种亚类肿瘤。该共选择的宿主血管结构及时地显示了上调的VEGF和血管生成。本发明人的关于脑转移的研究已显示，已存在的血管的血管共选择或利用是在早期实验脑转移建立过程中和在反映疾病的早期阶段的人临床样本中由肿瘤细胞使用的血管的主要形式。该发现排除了在小集落形成之前对从头血管生成的要求。CNS实质很大程度上缺少对于上皮细胞和癌细胞粘附和存活必需的非-血管间质基底膜成分。血管共选择，因此，为非神经癌细胞的恶性生长供给基底物质，其在神经纤维网中不是以其他方式广泛可得的。当粘附至基底膜基质时，高度加强了转移瘤细胞的增殖并通过体外抑制MEK被减弱。与组织培养中的实验一致，在体内集落形成的早期阶段，发现绝大多数微转移与现有脑血管的VBM直接接触且这些细胞中的许多是增殖的。因此，血管基底膜(VBM)被表明是用于脑中肿瘤细胞生长的活性物质。VBM促进恶性细胞的粘附和入侵并在任何明显的血管生成之前足够用于肿瘤生长。
[0064]血管共选择中β I整合素的作用
[0065]发现肿瘤细胞粘附至血管的血管基底膜是由β I整合素介导的。肿瘤细胞中β?整合素亚基的阻断或丢失阻止了与血管基底膜的粘附并减弱了转移形成和体内生长。脑中的转移癌细胞在转移期间对粘附和入侵中的血管结构需求可能更类似于在胰岛的形成期间对VBM的需求。胰岛细胞使用β I整合素与VBM相互作用且该互作对于增殖和内分泌功能是必需的。Nikolova等人把该基底膜微环境叫作“血管微生态”(Nikolova等Α,2006;Dev CelllO:397-405;^The vascular basement membrane:a niche for insulingene expression and beta cell proliferation”)。相似地，血管壁细胞需要 β I 整合素亚基用于与血管适当的粘附并用于维持血管稳定。随后，以类似的方式，在脑转移过程中癌细胞表现为劫持脑VBM用于必需的功能。有趣地，在有限的、行之有效的CNS黑色素瘤转移中抑制血管生成引起血管共选择生长的逆转。这表明肿瘤细胞的连续的血管利用，其可代表用于治疗研究的可行的靶标。
[0066]肿瘤细胞和血管之间的互作依赖于β I整合素-介导的肿瘤细胞与血管的血管基底膜的粘附。该互作足够促进脑中肿瘤系的直接增殖和微转移形成。该亲血管性机制对CNS中的癌(贴壁依赖型细胞)和淋巴瘤(贴壁非必需型细胞,anchorage-dispensible cell) 二者是通用的。βI整合素在正常细胞生物学的许多方面发挥主导作用并涉及癌发生、进展和转移。存在有至少10种β I整合素异二聚体，其作为不同的配体诸如胶原和层粘连蛋白的可变的杂性粘附受体。但是，我们的数据表明单独的βI整合素亚基的拮抗作用在用于脑转移的治疗策略中可能是有用的。事实上，Park等人发现抑制性抗-β I整合素亚基抗体在三维培养中生长的乳腺癌细胞中诱导凋亡，但没有在单层培养中生长的细胞中诱导凋亡(Park 等人 2006; “ β lintegrin inhibitory antibody induces apoptosis of breastcancer cells,inhibits growth, and distinguishes malignant from normal phenotypein three dimensional cultures and in vivo，，Cancer Res.66:1526-1535)。用相同抗体处理具有来自那些细胞系的乳腺癌异种移植物的小鼠导致减小的肿瘤体积。除了所描述的体外凋亡机制，抑制血管共选择也可减弱生长。在评价β I整合素的作用的可选的策略中，在乳腺癌的MMTV/PyMT转基因模型中分析肿瘤。诱导肿瘤发生之后，β I整合素的条件缺失导致FAK磷酸化作用和增殖的损害，与对用于肿瘤生长的贴壁依赖型信号传导的依赖—致。
[0067]本方法可适用于治疗具有β I整合素受体的任何类型的上皮或非上皮哺乳动物肿瘤，特别是，胶质母细胞瘤、间变性星形细胞瘤、乳腺(breast) /乳腺(ma_ary)癌、肺癌、黑色素瘤、结肠和直肠癌、膀胱癌、子宫内膜癌、卵巢癌、肾癌、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、前列腺癌和甲状腺癌。
[0068]因此，本方面的优势是靶向肿瘤血管化的两种机制包括血管生成和粘附血管共选择。如下面描述的，抑制β I整合素的优势是不仅阻断由肿瘤使用的血管的共选择，而且直接抑制肿瘤增殖并阻止由低氧激活的存活信号通路。这避免了仅依赖于单独的抗-血管生成的现有技术策略中所确定的治疗耐药性。用于评价治疗疗效包括肿瘤休眠和消退的手段将是具有普通医疗技能的人员所众所周知的。这些将包括使用医疗成像技术诸如MR1、CT、PET和SPECT及物理尺寸测量和患者的临床状态。这两种形式的抗血管生成剂和整合素-阻断剂一起具有协同作用。
[0069]在实行本方法中有用的针对整合素的抗体，且，特别是针对β I整合素的抗体是本领域已知的。见Bissell等人美国专利号6，123，941关于通过应用抗-β I整合素抗体ΑΙΙΒ2逆转癌细胞中恶性表型的描述。针对⑶-29表位的抗-β I整合素从ResearchDiagnostics, Inc., Flanders, N.J.可得。另一种抗_ β I 整合素抗体为 CSAT,从Universityof 1wa Hybridoma Bank可得。另外的`商业可得的抗-β I整合素抗体为4B7R,是从AncellImmunology Research Products 可得的鼠 IgGl κ 抗体。
[0070]ΑΙΙΒ2是最初从人绒毛膜癌杂交瘤中被分离的大鼠单克隆IgGl，并被鉴定为与β I整合素胞外域的所有异二聚体非特异性结合的抗-β I整合素抗体。使用经酶消化的ΑΙΙΒ2的F(ab)’片段的实验显示抗体的表位结合部分是有活性的，并导致β I整合素介导的信号传导和下游信号传导中间物的下调。关于βI整合素生物学的进一步的细节因为5种已知的剪接变体而变得更加复杂，其主要区别是关于胞质结构域，下面联合用于免疫制备抗β I整合素抗体的多肽进一步描述。已发现ΑΙΙΒ2通过胞外域识别所有的变体。Park 等人(2009 年 11 月 17 日授权的美国 7，618，627,“Method of increasing radiationsensitivity by inhibition of beta-one integrin”)使用 AIIB2 抗体与电离福射联合起来以促进肿瘤细胞凋亡。
[0071]如在 Hall 等人，“The alphal/betaland alpha6/beta-lIntegrinHeterodimers Mediate Cell Attachment to Distinct Sites on Laminin” J.CellBiol.110:2175-2184(1990)所报道的，抗-整合素抗体AIIB2根据以下被制备:以2周的间隔，给予Lewis大鼠与Ribi佐剂1:1混合的107EDTA-收获的JAR绒毛膜癌细胞的两次腹腔内注射。2周后，在不存在佐剂时，以2周的间隔，给予两次另外的脾内注射。给予Balb/c小鼠四次、每两月一次的5xl06早期-妊娠的人细胞滋养层细胞的腹腔内注射。最后的注射后4d，根据Kennett等人的方法(1980)，如Wheelock等人所改良的(1987)将每一个脾与Sp2/0小鼠浆细胞瘤细胞融合。使用以上描述的附着分析，筛选杂交瘤上清液关于它们抑制JAR人绒毛膜癌细胞附着至FN、LN或Col IV的能力。发现两种大鼠杂交瘤上清液仅抑制与FN的附着(BIE5和BIIG2)，而两种其他大鼠抑制与LN、FN和Col IV的附着(AIIB2和BIE11)。一种小鼠的杂交瘤上清液仅抑制JAR细胞与Col IV的附着(S2G3)。通过有限的稀释克隆了这些杂交瘤。使用山羊抗-大鼠琼脂糖通过亲和色谱法从培养上清液中纯化大鼠抗体。于4°C通过50%饱和的硫酸铵沉淀将小鼠上清液S2G3，一种IgM，浓缩10倍。在进一步使用之前，再次检测这些抗体对FN、LN和Col IV涂覆的物质的附着抑制活性。
[0072]可通过与Werb, Z.、Tremble, P.、Berensten, 0.、Crowley, E.和 Damsky, C.H.(1989)中描述的方法类似的方法制备适于与本方法和组合物一起使用的抗-整合素抗体。通过纤连蛋白受体的信号传导诱导胶原酶表达。J.Cell Biol.109,877-890 ;和Damsky, C.H., Fitzgerald, Μ.和Fisher, S.J.(1992)。这提供了用于潜在抗体的筛选检测。所使用的免疫原为完全人JAR绒毛膜癌细胞。抗体阻断细胞附着至Fn、Col-1、IV和LN，并因此可以以这些方式被进一步表征。
[0073]用大鼠单克隆抗体AIIB2抑制β I整合素联合低氧协同地减弱了 GBM细胞的体外生长。ΑΙΙΒ2还直接减弱阿瓦斯汀?逃避GBM细胞的体外生长。此组合物还可被用于体内肿瘤成像或作为细胞增殖的生物标志物或对细胞损害(例如，低氧或电离辐射)的响应。还观察到未经处理的GBM的血管生成的血管中β I整合素的显著的上调。因此,其对于直接抑制和/或成像体内血管生成过程也是有用的。
[0074]如上所述，多种VEGF抑制剂可被用于本方法和组合物。如在Oliner等人2009 年 12 月 10 日公布的、题为 “ANG2AND VEGF INHIBITOR COMBINATIONS” 的美国2009/0304694A1中所描述的，适合用于本方法的VEGF抑制剂包括以下:(a)4TBPPAPC,如在美国2003/0125339或美国专利号6，995，162中所描述的，其通过引用以其整体、特别是以其公开4TBPPAPC的部分并入本文；(b)AMG706，如在美国2003/0125339或美国专利号6，995，162或美国专利号6，878，714中所描述的，其通过引用以其整体特别是以其公开AMG706的部分并入本文；(c)阿瓦斯汀? ;(d)多吉美?，如在W000/42012、W000/41698、美国 2005/0038080A1、美国 2003/0125359A1、美国 2002/0165394A1、美国 2001/003447A1、美国2001/0016659A1和美国2002/013774A1中所描述的，其通过引用以其整体、特别以其公开多吉美?的部分并入本文；(e)PTK/ZK ;(f)索坦?，和(g)如美国2006/0241115中所描述的式IV的VEGF抑制剂。在这方面，目前优选的VEGF抑制剂是AMG706。
[0075]可根据一些方法制备人源化的抗-VEGF或抗-整合素抗体。Sliwkowski等人的2005 年 9 月 27 日授权的、题为 “Humanized ant1-ErbB2antibodies and treatment withant1-ErbB2antibodies”的美国6，949, 245描述了用于人源化抗体的方法，其根据本教导可以是适合的。本文的单克隆抗体特别包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的部分与源自特定物种或属于特定抗体种类或亚类的抗体的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与源自另外的物种或属于另外的抗体种类或亚类的抗体、及此类抗体的片段的相应序列相同或同源，只要它们呈现期望的生物活性(美国专利号4，816，567 ;和Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA, 81:6851-6855 (1984))。本文的感兴趣的嵌合抗体包括包含源自非-人灵长类动物(例如，旧大陆猴、猿等)的可变域抗原-结合序列和人恒定区序列的“灵长类源化”抗体。
[0076]如以上引用的美国6，949，245中进一步描述的，人源化的抗体具有非-人来源的被引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非-人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其典型取自“输入”可变域。可遵循Winter和合作者的方法(Jones等人，Nature, 321:522-525 (1986) ；Riechmann 等人，Nature, 332:323-327 (1988) ；Verhoeyen等人，Science, 239:1534-1536 (1988))，通过用人抗体的相应序列取代高变区序列基本上执行人源化。因此，此“人源化”抗体为嵌合抗体(美国专利号4，816，567)，其中基本上小于完整的人可变域已被来自非-人物种的相应序列取代。实践中，人源化的抗体通常是一些高变区残基和可能的一些FR残基被来自啮齿动物抗体中类似位点的残基所取代的人抗体。
[0077]还可使用单链重组抗体,如例如Williams等人、题为“Methods and compositionscomprising single chain recombinant antibodies” 的美国专利号 5，840，300 中所描述的，此处为了描述用于制备此组合物的方法的目的通过引用被并入。简要地，分别扩增K、重和λ免疫球蛋白链并随后使用重组PCR组合为单链，即，通过重叠延伸(SOE)PCR方法的剪接，其中，单链包含重链加κ链或重链加λ链。在引物中使用了柔性线性接头肽，其因此包含被用于连接\与Vh以形成包含包括轻链和重链二者作为单链的整合素结合可变区的新的重组Fv片段的接头。Fv片段可被开发为针对β I整合素亚基的Fv片段的库。
[0078]还可在经遗传改造旨在表达人抗体的小鼠中制备适合的抗体。可用包含人β I整合素片段的抗原免疫小鼠并将包含活性B细胞的小鼠脾细胞与合适的骨髓瘤系融合。具有人Ig所有组成成分的小鼠市售可得。见Hemachandra等人，“Human MonoclonalAntibodies against Ps`eudomonas aeruginosa Lipopolysaccharide Derived fromTransgenic Mice Containing Megabase Human Immunoglobulin Loci Are Opsonic andProtective against Fatal Pseudomonas Sepsis”，INFECTION AND IMMUNITY，2001 年 4月，第2223-2229页，第69卷，第4期。
[0079]用于制备本抗体的另外的技术，噬菌体展示组合库技术，提供了产生可被筛选抗-整合素活性的人Mab的大库的有用的方法。从淋巴细胞mRNA制备的库可由直至IO8个单克隆Fab所有组成成分的重组体组成。通过在丝状噬菌体表面展示库并针对模式表位(如下面描述的β I整合素片段)的淘选(panning)，可选择单克隆Fab抗体并分析它们的免疫特征和生物活性(整合素抑制)。Fab用于治疗和诊断方法二者是理想的，由于它们能够大量廉价地被制备且它们是天然的非免疫原性的。见Witzum等人的美国专利号6，716，410关于该技术的描述，此处通过引用被并入。
[0080]如Marks等人所描述的，结合β I抗原的人单链Fv (scFv)可从非免疫曬菌体库中被分离。所选择的抗体的轻链(V(L))和重链(V(H))可变区的CDR3随后可顺序地被突变，突变的scFv展示在噬菌体上，并选择与抗原具有较高亲和力的突变株。见Schier等人,“Isolation of picomolar affinity ant1-c-erbB-2 single-chain Fv by molecularevolution of the complementarity determining regions in the center of theantibody binding site，，J Mol Biol.1996Nov.8; 263 (4): 551-67。
[0081]还可采用与其他抗原交联的双特异性抗体(例如，双体)。不像其他的双特异性形式(format),可以以功能形式从细菌(大肠杆菌(E.coli))或酵母(巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris))分泌产生双体。详细的操作说明可见于:Tomlinson 1.和Holliger P.(2000)Methods for generating multivalent and bispecific antibodyfragments, Methods Enzymol, 326, 461-479 ；和 Holliger，P.(2001)Expression ofantibody fragments in Pichia pastoris.Meth.Mol.Biol.。可以以多种已知方式产生二聚抗体片段或微抗体。这些产生非共价或共价的二聚体(sc (FV) 2)。可用已知的稳定剂和赋形剂将本抗体组合物制备为呈无菌粉末或液体形式的纯化的药物组合物用于静脉内施用，如本领域已知的和在美国专利号6，165，467中描述冷冻干燥单克隆抗体中所示例的，在此通过引用被并入。
[0082]本文所使用的术语“协同的”以其传统意义，指的是组分的组合，其中组合的活性大于该组合的每一个组分的单`独的活性之和。
[0083]可将VEGF活性的其他抑制剂用于本方法和组合物。例如，阿柏西普(VEGF-Trap，AVE-0005)是完全人的重组融合蛋白，由被融合至人IgGl的Fe区的血管内皮生长因子受体I (VEGFRl)的第二 Ig结构域和血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)的第三Ig结构域组成。阿柏西普与所有的VEGF-A亚型及胎盘生长因子(PIGF)结合，从而阻止这些因子刺激血管生成。与化疗联合，每两周一次以4mg/kg通过静脉注入施用阿柏西普。
[0084]命名为KDR-bp (KDR-结合蛋白)的VEGF受体结合蛋白，来自东部棉口蛇(Eastern Cottonmouth)(食鱼峻，Agkistrodonpiscivoruspiscivorus)的毒液，是无催化活性的PLA2同源物，Lys49PLA2,其具有有效的肌毒性并被发现是拮抗VEGF受体的外源分子，如在 Fujisawa 等 AuCatalytically inactive phospholipase A2homologuebinds to vascular endothelial growth factor receptor~2via a C—terminal loopregion, ”Biochem.J.(2008)411，515-522 中所描述的。
[0085]在某些方面，本发明包括用于抑制肿瘤细胞生长的方法，包含向患有所述肿瘤的受试者施用为抗血管生成剂的低剂量第一剂；与阻断由βI整合素介导的肿瘤细胞结合的第二剂的组合的步骤，据此肿瘤细胞生长被抑制与由较高临床剂量的第一剂所引起的等同的量。低剂量的第一剂可以是例如VEGF抑制剂，其以如产品标签或印刷品上所显示的最小剂量被施用。根据本发明，肿瘤生长将被抑制至与如同VEGF抑制剂以最高批准剂量被给予至少相同的程度。例如，当治疗结肠癌或直肠癌时，贝伐单抗的建议剂量为每14天通过IV给予每kg5mg或IOmg (每磅约2.3mg至4.5mg)。所建议的剂量将基于所给予的化疗的类型而不同(每kg5mg或IOmg)。
[0086]为VEGF抑制剂的剂和阻断β -整合素的剂的治疗组合
[0087]可以一起施用或在规定的时间间隔之后顺序地施用调节粘附血管共选择和血管生成的剂。当一起施用时，可通过可接受的生物相容的递送平台递送它们。这可以是纳米缀合物或聚合物。可选地，可将剂与彼此直接融合。另外，可同时或顺序地施用多种血管生成和/或粘附血管共选择调节剂。最终，可将任何实施方案与辅助治疗诸如放疗、化疗和/或增加血管通透性的剂组合。[0088]可使用用于抑制血管生成信号传导方面的实施方案，其在信号传导的下游或与其细胞外受体(VEGFR-1/Flt-l、VEGFR-2/Flk-l)结合的能力中对VEGF-A具有抑制作用。也可靶向血管生成的其他介导物，包括其他VEGF家族成员(VEGF-B、VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E和 PIGF)和它们的受体(VEGFR-l/Flt-1、VEGFR2/Flk_l、VEGFR_3/Flt_4)、成纤维细胞生长因子(FGF-1和FGF-2)和它们的受体(FGFR-1、FGFR-2、FGFR-3、FGFR4)、表皮生长因子成员(EGF和HB-EGF)和它们的受体(EGFR)、CEACAM_l/CD_66a、孤儿受体HER-2、血管生成素(Angl、Ang2、Ang3和Ang4)和它们的受体(Tie-1和Tie2)、血小板衍化生长因子(PDGF)和它们的受体(PDGFRa型 和TOGFRP型)、转化生长因子-β家族成员(TGF-β 1、TGFβ 2、TGF-β 3)和它们的受体(TGFBR2)、δ -样配体4和其受体(Notch)和先已存在的结构蛋白的天然存在的抗血管生成片段，诸如血管抑素和肿瘤抑素。
[0089]可使用用于靶向粘附血管共选择信号传导方面的实施方案，其在信号传导的下游或与其细胞外受体结合的能力中对βI整合素具有抑制作用。这些可包括去整合素、细胞外基质的组分/片段、粘着斑激酶(FAK)、FAK-相关非激酶和细胞外信号相关激酶(ERK/MAPK)ο
[0090]抗-血管生成组合物可包含人单克隆抗体或抗体片段、人源化抗体或抗体片段、抑制肽、激酶抑制剂、内源抑制剂、小分子抑制剂、纳米抗体、RNA1、适体、反义物(antisense)、或任何这些剂与药学上可接受的载体或运载体(carrier)的组合。
[0091]抗-基于粘附的血管共选择组合物可包含人单克隆抗体或抗体片段、人源化抗体或抗体片段、抑制肽、激酶抑制剂、内源抑制剂、小分子抑制剂、纳米抗体、RNA1、适体、反义物、或任何这些剂与药学上可接受的载体或运载体的组合。
[0092]在本发明优选的实施方案中，具有复发性多形性成胶质细胞瘤(GBM)的患者将经受瘤内放置在切除腔内的或硬膜下放置的一个或多个导管的植入。患者将以临床上合适的剂量和间隔被施用标准的贝伐单抗疗法1.V.。贝伐单抗注射后至少24小时或理想48小时至120小时，将以临床相关剂量和频率通过对流增强的递送(CED)装置通过所述导管施用抑制性抗- β I整合素组合物。
[0093]在另一个实施方案中，以上方案将与另外的辅助疗法诸如电离辐射和/或化疗组合。在另外的实施方案中，上述方案将被施用至新的经诊断GBM。在另外的实施方案中，将通过CED施用抗血管生成组合物和抑制性抗_β I整合素组合物二者。在另一个实施方案中，将肠胃外施用抗血管生成组合物和抑制性抗-β I整合素组合物二者。在另一个实施方案中，将在惰性运载体诸如可溶解的生物相容的聚合物中将一种或两种组合物直接施用至肿瘤床。在另一个实施方案中，将同时施用两种组合物作为二价抗体。在另一个实施方案中，将单独施用抑制性抗-β I整合素组合物至具有先前抗血管生成疗法失败的患者。在另一个实施方案中，将单独施用抑制性抗-β I整合素组合物至未经历抗血管生成疗法的患者。在另一个实施方案中，抗_β I整合素组合物还可包含附着至其的放射性同位素，特别是β _放射兀素。
[0094]除了抗-血管生成疗法之外，用于引起低氧的可选的剂是使用用于血管栓塞的血管内技术(超选择栓塞/靶向栓塞)。该方法是已知用于高度血管脑损伤诸如脑膜瘤和AVM，以减少损伤因此为手术切除提供更好的环境。
[0095]抑制该靶标对于除GBM以外表达β I整合素的一些癌症可以是有效的，包括大部分上皮肿瘤和非上皮肿瘤诸如乳腺癌、肺癌、肝癌、肾癌、结肠癌、黑色素瘤和淋巴瘤。抗- β 1组合物可具有用于非肿瘤疾病诸如年龄相关性湿性黄斑变性中抑制血管生成的另外的用途。最终，抗-β 1组合物可具有用于抗炎适应症的用途，由于β 1整合素信号传导对于一些免疫细胞功能包括粘附和增殖是重要的。
[0096]可选的实施方案涉及生物系统中增强血管化如再生医疗策略中。在此实施方案中，选择性调节血管生成和粘附血管共选择二者可导致改善的组织修复或再生。
[0097]本发明的另外的实施方案包含使用shRNA (短发夹RNA)以敲低肿瘤细胞中β I整合素基因表达。这在下面的实施例中被实施，其中在对抗-VEGF抗体有耐受性的细胞系中显示肿瘤细胞生长的显著减弱。在示例性的研究中，ShRNA是短干扰RNA (siRNA)的前体，短干扰RNA是RNA干扰(RNAi)的强大的介导物。在RNAi中，序列与siRNA同源的基因在转录后状态被沉默。存在可以引起有效的siRNA的多种不同的发夹结构。慢病毒，诸如人类免疫缺陷病毒(HIV)能够感染非分裂细胞，包括脑的分化神经元。可从慢病毒中表达短发夹RNA，允许多种细胞类型的高效转染。可基于待被沉默的基因的序列设计有效的RNA发夹构建体。整合素β I是人中由ITGBl基因编码的蛋白。关于整合素β I亚基的全部人mRNA在Genbank基因座X07979和登录号BC020057中被阐明。该序列的3656个核苷酸(SEQ ID NO:1)，还在 J.Cell Biol.105 (3)，1183-1190 (1987)中被给出，为了简洁起见此处没有复述，但特别通过引用并入本文。该已知序列可被用于设计干扰核酸构建体诸如示例性的shRNA。
[0098]尽管不是每一个发夹构建体都将产生有效的RNAi响应，已形成了关于富集成功的构建体的规则。这些规则是基于大量的有效构建体的检查和微RNA和有效的siRNA的热力学分析。规则在例如Ambion technical bulletin#506中发布,在线可得。
[0099]从DNA载体中制备复制病毒包括将构建体包装进入细胞系。包装RNAi慢病毒本质上与包装携带cDNA的慢病毒相同。本质上，将DNA载体瞬时转染进入包装细胞系-诸如人293细胞,且在2-3天之后,上清液中将包含病毒。
[0100]在大多数情况下，慢病毒载体制备体系基于“断裂(split)”体系，其中天然病毒基因组被断裂为单独的辅助质粒构建体。将不同病毒元件断裂为三个或四个单独的载体降低了通过慢病毒基因组的偶然重组产生能够复制的病毒的风险。
[0101]当选择用于制备根据本发明的β整合素敲低的慢病毒制备体系时，技术人员可制备具有被限制的宿主范围(即，仅可感染啮齿动物的病毒)对广谱宿主范围(可感染小鼠、禽、人等的病毒)的病毒。在大多数情况下，病毒表面外壳蛋白决定了物种特异性。由于慢病毒制备体系是断裂的，通过使用例如水疱性口炎病毒(VSV/G)糖蛋白(其展示宽宿主范围取向)对嗜麦芽糖结合表面糖蛋白(其展示有限的特异性)可转换外壳蛋白。
[0102]使用 Gene link siRNA explorer(http colon slash slash www dot genelink.com/sirna/shrna1.asp),鉴定483条shRNA序列为人β I整合素mRNA的抑制剂,包括,例如，序列 TTCTGGATTGGACTGATCAGTTC(SEQ ID NO:2)。
[0103]优选以适于人施用的药物组合物的形式向患有此处所描述的肿瘤的有相应需要的患者递送此处提及的剂。组合物将包含剂，例如呈被分离和大体上纯的形式的抗体或核酸，与如本领域已知的稳定剂、缓冲液、赋形剂等混合，且无外源因子(adventitiousagent)。[0104]下面的实施例说明此处描述的某些发明概念。实施例
[0105]实施例1:与高β I整合素表达相关的低氧
[0106]此处显示，在快速生长的癌情况下并在抗血管生成疗法之后另一个常见的细胞应激，低氧，与患者多形性胶质母细胞瘤(GBM)样本中高β I表达相关。为了直接确证该机制，我们将神经胶质瘤细胞经受6h至48h的1%氧以刺激微环境低氧。我们观察到体外神经胶质瘤细胞中β I整合素表达的显著增加(图1)。这是快速且可逆的细胞响应并在乳腺癌和结直肠癌细胞中也被证明。为了验证抗-血管生成疗法能够强烈地增加体内生长肿瘤中β I的表达，我们染色了在最后的贝伐单抗处理的几天内取自小鼠的神经胶质瘤肿瘤。与对照相比，我们在被处理的肿瘤中、特别是在低氧的肿瘤中心观察到β I的显著增加(图2)。
[0107]实施例2:在肿瘤细胞增殖过程中观察到增加的β I整合素表达
[0108]在肿瘤细胞本身增殖期间观察到体外肿瘤细胞中β I表达的进一步增加。在U87MG神经胶质瘤细胞中，体外细胞汇合和β I水平之间具有负相关(图3)。另外，如FACS所显示的，U87MG神经胶质瘤细胞中增殖标志物K1-67的表达与β I表达正相关。这与其他人在乳腺癌细胞中所观察到的一致。最后，我们直观地观察到来自原代GBM的人手术样本中血管生成血管中β I整合素表达的显著增加(图4)。该增加的β I整合素表达被认为与神经胶质瘤细胞中所观察到的β I与细胞增殖的关联相关，如以上所讨论的。因此，除了入侵和在血管上生长，β I整合素呈现密切参与肿瘤细胞增殖、低氧和IR后的存活信号传导、及血管生成过程中血管内皮细胞。这多个特征使得βI整合素是潜在地直接抑制肿瘤生长和作为减弱抗-血管生成耐受性的形成的与抗-血管生成的结合疗法(conjunctivetherapy)的极具吸引力的祀标。
[0109]实施例3: β I整合素参与肿瘤细胞中抗-VEGF抗体耐受性
[0110]为了检验β I整合素可能参与贝伐单抗耐受性的假说，我们对在贝伐单抗治疗之前和在获得性贝伐单抗耐受性形成之后取得的GBM的成对的患者样本中的β I整合素使用免疫荧光组织化学。与未处理的样本相比，在12对中的9对中观察到贝伐单抗后GBM组织中清楚的增加(75%，图5)。
[0111]为了直接验证获得性贝伐单抗耐受性之后肿瘤细胞中β I整合素表达的增加，我们分析了源自原代GBM (第一次手术)和源自抗血管生成疗法耐受性形成后至少30天所分离的组织的细胞系。事实上，与前一组相比，来自后一组的细胞中β I整合素表达是平均13倍高(图6)。
[0112]为了验证所观察到的β I整合素的上调是有功能的，我们染色临近的患者肿瘤切片关于被激活的粘附斑激酶(磷酸化-FAKtyri97)。与治疗之前取得的样品相比，获得性贝伐单抗耐受性之后取得的患者样品中的磷酸化-FAKti"397染色显著较高(图7)。
[0113]因此，在获得性贝伐单抗耐受性形成之后取得的临床患者样品中β I整合素被功能性上调。
[0114]实施例4:抑制β I整合素之后抗-VEGF抗体耐受性细胞系中减少的攻击性
[0115]慢病毒颗粒中整合素PlshRNAUSanta Cruz Biotechnology, Inc.,目录#sc-35675购得。提供了四种不同的shRNA序列的混合物。将该物质用于转化源自贝伐单抗失败的患者的细胞系SF8106-Axl和SF7796-Ax3 (还分别称为BRG3和BRG2)。我们使用慢病毒载体创建了 β?和β 3整合素的稳定的敲低系。我们验证了与GFP载体对照细胞或β 3敲低细胞相比，BRG3细胞中β I的70%的敲低和对应的I周后细胞生长的60%的减少(图8)。为了更详细地研究这些细胞，我们分离了具有超过90%敲低的β I的BRG3敲低克隆并评价了指示增加的肿瘤细胞攻击性的功能，包括粘附、细胞扩散、细胞迁移和细胞增殖。与载体对照细胞相比，这些敲低克隆的所有四种功能都被显著损害(图9)。
[0116]为了体内验证以上的发现，我们在裸鼠中皮下植入以上的BRG30 I整合素敲低克隆中的三种并持续6个月追踪肿瘤生长。载体对照肿瘤细胞正常生长，而我们在整个研究阶段没有观察到任何敲低克隆的生长(图10)。事实上，15个敲低肿瘤中的13个(87%)被完全消退。为了验证这些发现是β I敲低的直接结果，我们皮下植入来自BRG2和BRG3的多克隆敲低系并相似地监测体内生长。这些系显示平均70%的β?敲低。如预测的，这些系比载体对照系生长慢。然而，与90%敲低克隆相比之下，几周之后，两种系都展示了潜在的体内生长，表明增殖和β I整合素水平的剂量-响应关系(数据未显示)。
[0117]因此，贝伐单抗耐受性的神经胶质瘤系中βI的90%或更大的敲低减弱了体外攻击表型并完全阻止了异种移植模型中的体内生长。
[0118]实施例5:抗-VEGF抗体耐受性细胞系的抗β I整合素抗体处理
[0119]为了验证以上结果具有β I抑制的临床相关模式，我们在体外抑制实验中使用充分表征的ΑΙΙΒ2抑制性大鼠单克隆抗-β I整合素抗体。同种型匹配的IgG被用作对照。贝伐单抗耐受性神经胶质瘤系显示与β I敲低相似的功能抑制，包括减少的粘附(数据未显示)和以10yg/ml的迁移(动态影片分析，未显示)。用免疫荧光染色关于凋亡/细胞死亡(膜联蛋白V)或增殖(K1-67抗原)显示对细胞生长的影响。染色之后，通过流式细胞术/荧光激活细胞分选术(FACS)分选细胞。该分析显示用AIIB2处理的GBM细胞中Ki_67染色的显著减少，但是对膜联蛋白V免疫反应性没有影响，与抑制细胞效应一致(数据未显示)。
[0120]用原代GBM系体外重复了用AIIB2的该处理，以观察细胞生长是否将被增殖状态影响。分汇合培养(生长期)中的细胞，而不是汇合培养(生长停滞)中的细胞，被持续2天的AIIB2处理显著地抑制了生长(图11)。
[0121]最后,用直至5mg/kg剂量的AIIB2、每周2次体内处理显著抑制了皮下异种移植模型中BRG3贝伐单抗耐受性系的生长(数据未显示)。末端脱氧核糖核酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记法(Terminal deoxynucleotidyItransferasedUTP nick end labeling,TUNEL)揭示了 BRG3系中AIIB2处理的肿瘤中增加的凋亡(数据未显示)。
[0122]因此，与β I敲低类似，用功能阻断抗体诸如ΑΙΙΒ2的β I整合素抑制体外减弱了攻击表型。此外，ΑΙΙΒ2的肠胃外施用对于抑制典型的和贝伐单抗耐受性的神经胶质瘤异种移植物的肿瘤体内生长是有效的。
[0123]实施例6: β I的抑制逆转上皮-间质转化(EMT)和干细胞_样表型
[0124]培养中的球状肿瘤细胞生长是干细胞-样表型的替代并能够被应激因素诸如低氧和酸性PH促进/ 富集。在典型的神经胶质瘤细胞系(U87MG)和BRG3贝伐单抗耐受性细胞系二者中敲低β I显著损害了球状体形成(数据未显示)。ΑΙΙΒ2还抑制了由48小时低氧引起的U87MG神经胶质瘤细胞的球状生长(数据未显示)。
[0125]除了损害球状生长，β I整合素的抑制促进了如肿瘤细胞区域的显著增加所显示的EMT的逆转和间质细胞受体c-met50%的减少(数据未显示)。
[0126]实施例7:用β I整合素抑制增强抗血管生成疗法
[0127]作为抗血管生成疗法的效应的体外模型，我们将生长期的原代GBM细胞经受持续2天的低氧，随后在常氧中持续2天继续生长。低氧被用作抗-血管生成疗法诸如贝伐单抗的体外替代。如与单独的低氧或ΑΙΙΒ2处理相比，持续2天的恢复阶段添加ΑΙΙΒ2抗体导致肿瘤细胞生长进一步的减少(图12)。因此，β I整合素抑制和抗血管生成的组合预测加强了治疗疗效。[0128]为了验证以上的体外结果,我们用对照IgG (10mg/kg)、贝伐单抗(10mg/kg)或贝伐单抗(lmg/kg)和AIIB2 (lmg/kg)的低剂量交替组合疗法,两周一次地处理具有皮下生长U87MG神经胶质瘤肿瘤的小鼠。几周处理之后，低剂量交替的组合疗法抑制肿瘤生长被证明与单独的标准剂量的贝伐单抗同样有效(图13)。因此，用AIIB2抑制β?整合素允许贝伐单抗剂量的20倍的降低。
[0129]因此，概括地说，显示β I整合素的抑制可通过I)阻止血管共选择和血管周的入侵(或在任何典型的ECM基底物质上的入侵)，2)在诸如IR和低氧损害之后可能通过促进凋亡减少肿瘤细胞的活性，3)直接抑制肿瘤细胞增殖，4)通过靶向增殖和迁移的内皮细胞直接抑制血管生成和5)逆转攻击性的干细胞-样的表型包括上皮-间质转化(ΕΜΤ)，抑制肿瘤的生长。重要地，通过慢病毒敲低或用ΑΙΙΒ2拮抗β I受体可显著减弱贝伐单抗-耐受性神经胶质瘤异种移植物的体内生长。此外，ΑΙΙΒ2处理可减少神经胶质瘤异种移植模型中贝伐单抗的必需剂量达至少20χ。
[0130]结论
[0131]以上的具体描述意在例证并阐述本发明且不应被视为限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的字面上的及等同的范围所界定。本说明书中提及的任何专利或出版物意在传达实施本发明某些方面中有用的方法和材料的详细信息，其可能没有被明确陈述但其将被本领域工作人员所理解。此类专利或出版物在此与如同每一个被特定地并单独地通过引用被并入相同的程度通过引用被并入并被本文所包含，如描述和使得被提及的方法或材料可行的目的所需的。
【权利要求】
1.一种药物组合物，所述药物组合物用于抑制肿瘤细胞生长，所述药物组合物包含 为血管内皮生长因子(“VEGF”)的抑制剂的第一剂；和 阻断β_1整合素结合的第二剂的组合，据此所述组合抑制肿瘤细胞生长至比单独的所述第一剂或所述第二剂更大的程度。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述VEGF的抑制剂是结合VEGF的抗体。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述抗体是人源化的小鼠抗体。
4.根据权利要求1、2或3所述的组合物，其中所述第二剂是与β-l整合素结合的多肽。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多肽与缔合任何α亚基的β-l整合素结合并抑制肿瘤细胞与细胞外基底物质的结合。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述多肽是β-l整合素特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中所述β-l整合素特异性抗体是嵌合、单链或人源化抗体。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述抗体是ΑΙΙΒ2、ΒΙΕ11或源自ΑΙΙΒ2或BIEll的人源化抗体。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述第一剂和所述第二剂由具有识别VEGF的一个结合位点和识别βI整合素的一个结合位点的二价抗体提供。
10.一种用于抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向患有所述肿瘤的受试者施用以下物质的步骤:` 为抗血管生成剂的第一剂；和 阻断由β-l整合素介导的肿瘤细胞结合的第二剂的组合，据此肿瘤细胞生长被抑制至比单独的所述第一剂或所述第二剂引起的抑制更大的程度。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗血管生成剂是结合VEGF的抗体。
12.根据权利要求10所述的方法，其中所述抗血管生成剂选自由以下组成的组:人源化的小鼠单克隆抗体和完全人抗体。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述第二剂是与β-1整合素结合的多肽。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多肽与缔合任何α亚基的β-1整合素结八口 ο
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述多肽是分离的β-1整合素特异性抗体。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体是嵌合、单链或人源化抗体。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述抗体是ΑΙΙΒ2、ΒΙΕ11或其人源化的衍生物。
18.根据权利要求10所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组:胶质母细胞瘤、结直肠癌、肺癌、乳腺癌、肝癌、肾癌、结肠癌、黑色素瘤和淋巴瘤。
19.一种治疗神经上皮组织的肿瘤的方法，所述方法包括将所述肿瘤与β-1整合素结合抑制剂接触的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述抑制剂是与缔合任何α亚基的β-l整合素结合的抗体。
21.一种用于成像肿瘤的方法，所述方法包括: 向患有所述肿瘤的受试者施用与VEGF结合的第一剂；和阻断由β -1整合素介导的肿瘤细胞结合的第二剂的组合，其中所述第一剂和所述第二剂的一种或两种被标记。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述第二剂是与β-1整合素结合的嵌合、单链或人源化抗体。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述肿瘤选自由以下组成的组:胶质母细胞瘤、结直肠癌、肺癌、肾癌、肝癌、卵巢癌和乳腺癌。
24.一种用于抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向所述细胞递送干扰编码β_1整合素的基因的表达的核酸构建体的步骤。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述构建体是编码与β-1整合素mRNA结合以沉默β I整合素基因表达的shRNA的慢病毒载体。
26.—种治疗患有肿瘤的患者的方法,所述患者具有失败的抗-VEGF抗体治疗,所述方法包括向所述患者施用抗-整合素剂的步骤。
27.一种用于治疗患有复发性多形性胶质母细胞瘤(GBM)的患者的药盒，所述药盒包含: (a)用于瘤内放置在切除的腔内或硬膜下放置的导管；和 (b)抑制性抗-β I整合素组合物，所述组合物被配制用于通过对流增强的递送(CED)装置以临床相关的剂量和频率通过所述导管施用。
28.一种用于抑制肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括向患有所述肿瘤的受试者施用以下物质的步骤: 为抗血管生成剂的低剂量第一剂；和 阻断由β_1整合素介导的肿瘤细胞结合的第二剂的组合，据此肿瘤细胞生长被抑制至与由所述第一剂以更高的临床剂量引起的等同的量。
【文档编号】A61K38/18GK103561761SQ201280024596
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2012年3月22日 优先权日:2011年3月23日
【发明者】沃伦·肖恩·卡伯尼尔, 马尼什·库马尔·阿吉 申请人:加利福尼亚大学董事会