使用甲氨蝶呤诱导免疫耐受性的制作方法
【专利摘要】本发明提供了通过使用甲氨蝶呤治疗在患者中降低不想要的免疫应答，诸如抗药物抗体(ADA)应答和其它T和/或B细胞介导的免疫应答的方法。
【专利说明】使用甲氨蝶呤诱导免疫耐受性
[0001]对其它申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年5月16日提交的美国临时申请N0.61/486，697的优先权，其公开内容通过提及完整收入本文。
发明领域
[0003]本发明一般涉及免疫学，且更具体地，涉及甲氨蝶呤降低患者中不想要的免疫应答的用途。
[0004]发明背景 [0005]目前，美国食品和药品管理局(FDA)已经批准超过130种蛋白质治疗剂用于临床使用(Leader 等，Nat Rev Drug Discov, 7(1): 21-39 (2008)) ? 这些治疗剂包括肽、重组人蛋白、蛋白质疫苗、自多种动物物种衍生的多克隆抗体制剂、和单克隆抗体。根据其与内源自身抗原的序列和构象同源性，糖基化状态、剂量水平、施用路径、局部化、和制造方法相关特征，治疗性蛋白质可能在患者中引发抗体应答(Schellekens, Nat Rev Drug Discov, I (6):457-62 (2002);Zinkernagel, Semin Immunol,12(3):163-71 (2000)，discussion257_344;Thorland等，Haemophilia, 5(2):101-5(1999);Goodeve, Blood Coagul Fibrinolysis, 14Suppll:S17-21 (2003))。这些应答(称为抗药物抗体(ADA)应答)有时会影响患者安全性和药物效力。
[0006]在溶酶体贮积病症，即蓬佩(Pompe)病的情况中，在酶替换疗法(ERT)中会形成针对重组人酸性α-葡糖苷酶的ADA。在不表达可测量量的内源酶的患者中，持续的高抗体滴度水平与患者衰退(CRIM-蓬佩患者)相关联(Kishnani等，Mol GenetMetab., 99(I):26-33(2010);Hunley 等,Pediatrics, 114(4):e532_5(2004);Amalfitano等，Genet Med, 3 (2): 132-8 (2001))。已经在形成针对因子IX的ADA的血友病患者中观察到对药物安全性和效力的类似危害(Thorland等，Haemophilia, 5(2): 101-5 (1999) ; Ewenstein等，Blood, 89(3): 1115-6 (1997))。在罕见的情况中，ADA还会诱导自身免疫性疾病，如在重组人促红细胞生成素的情况中(Schellekens, Clin Ther, 24 (11): 1720-40 (2002), discussionl719;Locatelli 等，Perit Dial Int,27Suppl2:S303-7(2007))。
[0007]不管治疗剂是非人衍生的、人源化的或甚至是完全人的，抗体治疗剂也会发生ADA应答。单克隆和多克隆抗体治疗剂两者的免疫原性会影响患者安全性和药物效力。针对治疗性单克隆抗体诸如英夫利昔单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、利妥昔单抗(rituximab)和那他珠单抗(natalizumab)形成的抗体已经与治疗性抗体的降低的血清水平和效力联系起来(Bendtzen等,Arthritis Rheum, 54 (12): 3782-9 (2006);Schmidt 等,Clin Immunol,132(3):334-41(2009);Bartelds 等,Ann RheumDis, 66 (7): 921-6 (2007) ; Baert 等，N Engl J Med, 348 (7): 601-8 (2003) ; Tahir 等，Rheumatology (Oxford), 44 (4): 561-2 (2005) ;Maini 等,Arthritis Rheum, 41 (9): 1552-63 (1998))。变应性反应已经与抗英夫利昔单抗抗体联系起来(Baert等，N Engl JMed, 348(7):601-8 (2003))。已经在小百分比的用那他珠单抗治疗的复发-缓解性多发性硬化患者中观察到输注相关超敏感性反应(Phillips等，Neurology，67 (9):1717-8(2006))O
[0008]阿仑单抗是另一种会在复发-缓解性多发性硬化患者中产生ADA的抗体治疗剂(Coles 等，N Engl J Med, 2008.359 (17): 1786-801 (2008))。阿仑单抗是一种与 CD52 (—种在免疫细胞上表达的细胞表面抗原)相互作用的淋巴细胞消减性单克隆抗体。阿仑单抗处于治疗复发-缓解性多发性硬化的晚期临床试验，并且还已经在类风湿性关节炎中评估。一组研究人员已经显示了在一项单剂增加研究中治疗的类风湿性关节炎患者中63%形成抗阿仑单抗抗体(Weinblatt 等,Arthritis Rheum, 1995.38 (11): 1589-94 (1995))。在所述研究中，阿仑单抗的效力表现为受到ADA的存在而改变(同上)。
[0009]多克隆抗体治疗剂Thymoglobulin?也与较小患者子集中有害的ADA有关。已
经在经Thymoglobulin?治疗的移植物接受者中观察到血清病、急性肾衰竭和心血管反应(Boothpur 等，Am J Kidney Dis.，55 (I): 141-3 (2009) ; Lundquist 等，Liver Transpl, 13 (5):647-50 (2007) ; Busani 等,Minerva Anestesiol, 72 (4): 243-8 (2006) ; Tanriover 等，Transplantation, 80 (2): 279-81 (2005) ; Buchler 等，Clin Transplant, 17 (6): 539-45 (2003))。
[0010]研究已经尝试寻找使ADA的有害效应最小化的方式。已经对多种工具测试其诱导免疫耐受性及降低蛋白质疗法中的ADA的能力，包括例如非消减性抗CD4抗体(Cobbold等,Semin Immunol, 2(6):377-87(1990);Winsor-Hines 等,JImmunol, 173 (7):4715-23 (2004))、阿仑单抗的非细胞结合最小突变体(Gilliland等，J Immunol, 162(6):3663-71(1999) ; Somerfield 等,J Immunol., 185 (I): 763-8 (2010))、免疫抑制性疗法(Bennett 等,Blood, 106(10):3343-7(2005);Dickson 等，J Clin Invest,118(8):2868-76 (2008))、含有磷脂酰肌醇的结合因子VIII的脂质性颗粒(Peng等，AAPS.J.，12(3):473-81 (2010))、和重组酸性α -葡糖苷酶经由腺伴随病毒感染的肝特异性施用(Sun等，Am J HumanGenet, 81(5): 1042-9 (2007) ; Sun 等，Mol Therl8 (2): 353-60 (2009) ; Ziegler 等，Hum GeneTher, 19(6):609-21 (2008))。然而，仍然需要开发用于降低蛋白质疗法和其它背景中不想要的抗体应答的改善的方法。
[0011]发明概述
[0012]本发明提供了一种在需要用治疗剂治疗的受试者中诱导免疫耐受性的方法。在此方法中，在单个周期中对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中诱导针对所述治疗剂的免疫耐受性。
[0013]本发明还提供了一种在需要用治疗剂治疗的受试者中抑制针对所述治疗剂的抗体应答的方法。在此方法中，在单个周期中对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中抑制针对所述治疗剂的抗体应答。
[0014]本发明还提供了一种在需要用治疗剂治疗的受试者中减轻针对所述治疗剂的输注反应的方法。在此方法中，对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中减轻针对蛋白质治疗剂的输注反应。
[0015]本发明还提供了一种在需要用治疗剂治疗的自身免疫受试者中降低继发性自身免疫的方法。在此方法中，对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中降低继发性自身免疫。[0016]本发明还提供了一种在需要用治疗剂治疗的受试者中提高治疗剂的效力的方法。在此方法中，对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中提高所述蛋白质治疗剂的效力。
[0017]本发明还提供了一种在用淋巴细胞消减性疗法(例如阿仑单抗疗法或Thymoglobulin?疗法)治疗的受试者中增加T细胞群体中T调节细胞百分比的方法。在
此方法中，对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此增加所述受试者中的所述百分比。
[0018]本发明还提供了一种在需要用蛋白质治疗剂(诸如抗体治疗剂)治疗的受试者中增加B细胞群体中B调节细胞百分比的方法。在此方法中，对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此增加所述受试者中的所述百分比。在一些实施方案中，在单个周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。在相关实施方案中，本发明提供了一种在需要用蛋白质治疗剂治疗的受试者中增加TGF-β、IL-10、和/或FoxP3表达B细胞的方法，其包括在单个周期中施用有效量的甲氨蝶呤。
[0019]本发明还提供了一种延长治疗剂在受试者中的药动学的方法。在此方法中，在施用所述治疗剂之前或期间或之后以有效延长所述治疗剂的药动学的量对所述受试者施用甲氨蝶呤。
[0020]本发明进一步提供了一种在有此需要的人患者中消减淋巴细胞的方法。在此方法中，用淋巴细胞消减剂治疗患者，并在用淋巴细胞消减剂治疗之前或期间或之后以有效诱导患者中针对淋巴细胞消减剂的免疫耐受性或降低继发性自身免疫的量对患者施用甲氨蝶呤。在一些实施方案中，在单个周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。在一些实施方案中，淋巴细胞消减剂可以是单克隆抗体治疗剂(例如阿仑单抗或利妥昔单抗)。在这些中的某些实施方案中，患者可以是多发性硬化患者(例如缓解-复发性多发性硬化患者)。在一些实施方案中，淋巴细胞消减剂可以是多克隆抗体治疗剂(例如抗胸腺细胞球蛋白多克隆抗体)。
[0021]本发明还提供了一种在需要组织移植的受试者中诱导免疫耐受性的方法。在此方法中，对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中诱导针对移植的组织的免疫耐受性。在一些实施方案中，在单个周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。在一些实施方案中，移植的组织是肾组织或心脏组织。在一些实施方案中，所述受试者还接受用于免疫调控的药剂(例如免疫抑制剂)，诸如多克隆抗胸腺细胞球蛋白抗体。
[0022] 本发明还提供了一种在需要治疗剂或组织移植的受试者中抑制T细胞应答的方法。在此方法中，在用所述治疗剂或组织移植治疗所述受试者之前、同时、或之后对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中抑制T细胞应答。
[0023]在本发明方法的一些实施方案中，治疗剂是蛋白质治疗剂。
[0024]在本发明方法的一些实施方案中，治疗剂是抗体治疗剂。例如，抗体治疗剂可以是单克隆抗体治疗剂和/或淋巴细胞消减剂(例如阿仑单抗)，或多克隆抗体治疗剂(例如多克隆家兔抗胸腺细胞球蛋白抗体)。在抗体治疗剂是阿仑单抗的别的实施方案中，受试者可以是多发性硬化患者。在抗体治疗剂是多克隆家兔抗胸腺细胞球蛋白抗体的别的实施方案中，受试者可以是需要器官移植，具有再生障碍性贫血，和/或具有或有风险具有移植物抗宿主病的人患者。在本发明方法的其它实施方案中，治疗剂是酶。例如，酶可以是人α-半乳糖苷酶A或人酸性α -葡糖苷酶。
[0025]在本发明方法的一些实施方案中，受试者是人。[0026]在本发明方法的一些实施方案中，甲氨蝶呤的有效量可以是0.lmg/kg至5mg/kg。在一些实施方案中，单个周期的甲氨蝶呤可以由甲氨蝶呤施用I天或甲氨蝶呤施用连续2、
3、4、5、6、7、8、9、10、或11天组成。在一些实施方案中，可以在治疗性处理开始之前48小时和之后48小时之间施用单个周期的甲氨蝶呤。
[0027]附图简述
[0028]在下文描述的每幅图中 ，星号或星形标示具有统计学显著差异的测量(*，p〈0.05 ;**，P < 0.001; ***，P < 0.0001)。
[0029]图1A-B显示了针对单个和多个疗程mATG (—种家兔抗鼠胸腺细胞球蛋白多克隆抗体)的抗家兔IgG响应。测量平均抗家兔IgG滴度，并使用仅用家兔IgG(rblgG)处理的小鼠作为对照。图1A显示了在8周时期里针对单个疗程mATG的响应。图1B显示了在20周时期里针对多个疗程mATG的响应。箭标示施用mATG或rblgG的时间点。
[0030]图2显示了用阿仑单抗的5次每月处理后的平均阿仑单抗特异性IgG滴度。箭标示施用阿仑单抗的时间点。
[0031]图3显示了单个疗程mATG后甲氨蝶呤(MTX)对抗mATG IgG应答的抑制。用仅mATG、仅rblgG、或mATG和甲氨蝶呤处理小鼠。
[0032]图4A-C显示了贯穿用mATG的5次每月处理的过程，甲氨蝶呤对抗家兔IgG应答的影响。箭标示施用mATG或甲氨蝶呤的时间点。图4A显示了三个周期的甲氨蝶呤显著降低平均抗家兔IgG滴度。图4B显示了单个疗程的甲氨蝶呤显著降低平均抗家兔IgG滴度。图4C比较用仅mATG、mATG和单个周期的甲氨蝶呤、或mATG和三个周期的甲氨蝶呤处理的小鼠的平均抗家兔IgG滴度。单个周期的甲氨蝶呤比三个周期的甲氨蝶呤更显著降低抗家兔IgG滴度。
[0033]图5显示了与用mATG但不用甲氨蝶呤处理的小鼠相比，平均抗家兔IgG滴度在经甲氨蝶呤处理的小鼠(单个和多个甲氨蝶呤周期)中在mATG再攻击后降低。箭标示施用mATG或甲氨蝶呤的时间点。
[0034]图6显示了用mATG和单个周期的甲氨蝶呤处理的小鼠中的平均抗家兔IgG滴度比仅用mATG处理的小鼠中的平均抗家兔IgG滴度小100倍。箭标示施用mATG或甲氨蝶呤的时间点。
[0035]图7A-C显示了甲氨蝶呤能降低hu⑶52Tg小鼠中的平均抗阿仑单抗IgG滴度。图7A:抗阿仑单抗滴度在用单个周期的lmg/kg或5mg/kg甲氨蝶呤处理的小鼠中比在用0.5mg/kg或无甲氨蝶呤处理的小鼠中低。用仅阿仑单抗,或阿仑单抗和单个周期的0.5mg/kg、lmg/kg、或5mg/kg甲氨蝶呤处理小鼠。图7B:测试抗阿仑单抗滴度的研究设计。在第5剂阿仑单抗后24小时时测定滴度数据，如由星形标示的。图7C:在第5剂阿仑单抗后24小时，与仅接受阿仑单抗的小鼠相比，甲氨蝶呤在接受阿仑单抗和甲氨蝶呤的小鼠中降低抗阿仑单抗抗体滴度。
[0036]图8A-D显示了用5剂每日0.5mg/kg阿仑单抗或磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的小鼠中循环T细胞的绝对细胞数目/ μ I全血。图8Α显示了总T细胞(CD3+)在处理后2、3和4周降低。图8Β显示了总B细胞(CD19+)在处理后3周降低。图8C显示了 T辅助细胞(⑶4+)在处理后2、3和4周时降低，且图8D显示了细胞毒性T细胞(⑶8+)在处理后2、3和4周时降低。[0037]图9A-B显示了阿仑单抗特异性IgG应答。图9A显示了以0.5mg/kg用阿仑单抗处理的三个周期，及以0.5mg/kg、lmg/kg、或2mg/kg用甲氨蝶呤处理的一个周期后的应答。阿仑单抗处理的第一个周期由剂量给药的连续5天组成，并且第二个和第三个周期各由剂量给药的连续3天组成。图9B显示了在第14周时每组的每只动物的抗阿仑单抗IgG滴度。
[0038]图10显示了单个周期的5mg/kg甲氨蝶呤恢复用5剂每月mATG处理的小鼠中的循环mATG水平。
[0039]图11显示了用mATG的5次每月处理和单个周期的甲氨蝶呤处理的小鼠在第5剂mATG后具有血液中增强的mATG介导的⑶4+和⑶8+T细胞消减。从两个实验合并这些数据。
[0040]图12A-B显示了用单个周期的甲氨蝶呤处理的小鼠在第5次每月mATG处理后展现出增加的T调节(⑶25+FoXp3+)细胞百分比。用仅mATG的5次每月处理，或mATG的5次每月处理和单个周期的甲氨蝶呤，或mATG的5次每月处理和三个周期的甲氨蝶呤处理小鼠。图12A显示了脾中的T调节细胞水平。图12B显示了血液中的T调节细胞水平。 [0041]图13A显示了大于10,000的抗家兔IgG滴度能干扰mATG的药动学。图13B显示了大于100，000的抗家兔滴度能干扰⑶4和⑶8细胞消减。％处理前对照指⑶4和⑶8滴度相对于其在mATG处理前的相应水平的百分比。
[0042]图14显示了用5mg/kg甲氨蝶呤处理的小鼠在第5剂每月阿仑单抗后展现出增强的阿仑单抗对循环⑶3+T细胞和⑶19+B细胞的消减。对于研究的头三天，用仅阿仑单抗，或阿仑单抗和单个周期的甲氨蝶呤处理小鼠。星号标示具有统计学显著差异的测量(*，ρ〈0.05; ***，P < 0.0001)。
[0043]图15Α显示了单个周期的甲氨蝶呤能在16周研究中贯穿处理，且甚至在最后一次rhGAA处理后4周降低重组人酸性α -葡糖苷酶(rhGAA)特异性IgG滴度。箭标示施用rhGAA和甲氨蝶呤的时间点。用仅rhGAA，或rhGAA和单个周期的甲氨蝶呤，或rhGAA和三个周期的甲氨蝶呤处理小鼠。图15B显示了在6周研究中，单个周期的甲氨蝶呤降低rhGAA特异性IgG滴度。图15C显示了单个周期的甲氨蝶呤在18周研究中降低rhGAA特异性IgG滴度。
[0044]图16A显示了与仅mATG相比，甲氨蝶呤在与mATG —起施用时降低鼠异基因心脏移植物模型中的抗家兔IgG滴度。图16B显示了甲氨蝶呤提高鼠异基因心脏移植物模型中的mATG的循环水平。用盐水、仅mATG、或mATG和单个周期的甲氨蝶呤处理小鼠。在研究的第O天和第4天以20mg/kg施用mATG,而在研究的第0_6天施用2mg/kg甲氨蝶呤。
[0045]图17显示了 Kaplan-Meier图，其指示mATG和甲氨蝶呤的组合处理延长移植入接受小鼠中的异基因心脏的存活。将小鼠保持未处理，或者在研究的第O天和第4天仅用20mg/kg mATG,或在研究的第0_6天仅用2mg/kg甲氨蝶呤,或在第0_6天用mATG和2mg/kg甲氨蝶呤两者，或在第0-6天或第0-11天用mATG和0.5mg/kg甲氨蝶呤两者处理。
[0046]图18显示了用单独的甲氨蝶呤或与mATG组合的甲氨蝶呤处理的具有移植的异基因心脏的小鼠经历抗同种移植物抗体应答的降低。图18A显示了第21天结合异基因成纤维细胞的接受者IgG。图18B显示了在指定处理的情况中给予同基因移植物(Syn Tx)或异基因移植物(Alio Tx)的小鼠中第21天的同种抗体水平。显示了个别接受小鼠血清IgG对异基因成纤维细胞的结合，并且以均值荧光强度(MFI)与未染色的成纤维细胞的比率表示。图18C显示了给予无处理、mATG、甲氨蝶呤、或mATG和甲氨蝶呤的小鼠中第21天的同种抗体水平。同种抗体水平在用甲氨蝶呤或mATG和甲氨蝶呤处理的小鼠中显著较低(分别为 p=0.0008 和 ρ〈0.0001)。
[0047]图19显示了 BlO调节B细胞在甲氨蝶呤处理后显著增加。用单独的rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤的单个3天周期或盐水处理小鼠。在研究的第7天和第8天计数细胞数目。
[0048]图20显示了与仅用rhGAA处理相比，活化的B细胞亚群在用rhGAA和甲氨蝶呤的单个3天周期处理后第6天显著增加。在研究的第6天计数⑶86+移行2B细胞、⑶86+移行3B细胞、⑶86+滤泡B细胞、和⑶86+边缘区B细胞的绝对细胞数目。星号标示具有统计学显著差异的测量(*，Ρ〈0.05; **，P < 0.001)。
[0049]图21显示了对于活化的脾B细胞亚群,诸如活化的边缘区B细胞、活化的滤泡B细胞、和活化的移行3Β细胞，与仅用rhGAA处理相比，细胞数目即使在用rhGAA和甲氨蝶呤处理后保持增加。箭代表用rhGAA和甲氨蝶呤处理。在第I天和第8天施用rhGAA。在第I天、第2天、和第3天，以及第8天、第9天、和第10天施用甲氨蝶呤。显著性差异由星形(*，p〈0.05)表示。没有对第8天和第9天(以垂直的点线标示)显示数据。
[0050]图22显示了与仅用rhGAA处理相比，活化的脾T细胞群体，诸如活化的T辅助细胞、活化的T细胞毒性细胞、和活化的T调节细胞在用rhGAA和甲氨蝶呤处理后在很大程度上保持不变。箭代表用rhGAA和甲氨蝶呤处理。在第I天和第8天施用rhGAA。在第I天、第2天、和第3天，以及第8天、第9天、和第10天施用甲氨蝶呤。显著性差异由星形(*，p〈0.05)表示。没有对第8天和第9天(以垂直的点线标示)显示数据。
[0051]图23显示了用于检查与mATG组合的甲氨蝶呤处理的长6个月的研究设计。实心箭代表5mg/kg mATG注射 ,虚线箭代表5mg/kg甲氨蝶呤注射,而点线箭代表末期处死。
[0052]图24A-B显示了与单独的mATG或三个周期的甲氨蝶呤相比，与mATG结合的单个周期的甲氨蝶呤富集脾B细胞。图24A:活化的滤泡B细胞；图24B:活化的移行3B细胞。
[0053]图25A-B显示了甲氨蝶呤对阿仑单抗在血液中的药效学的影响。在有或没有与阿仑单抗的第一次施用结合的3剂每日5mg/kg/天甲氨蝶呤的情况中，用0.5mg/kg阿仑单抗处理小鼠5个月。图25A:甲氨蝶呤增强阿仑单抗(AZM)对总T细胞(⑶3+)、T辅助细胞(⑶4+)、和T调节细胞(⑶4+CD25+FOXp3+)的消减。黑色柱形代表仅用阿仑单抗处理的小鼠中的测量，而白色柱形代表用阿仑单抗和甲氨蝶呤处理的小鼠中的测量。图25B:甲氨蝶呤增强阿仑单抗对B细胞的消减。星形标示具有统计学显著差异的测量(*，p〈0.05)。
[0054]图26显示了甲氨蝶呤对阿仑单抗在脾中的药效学的影响。在有或没有与阿仑单抗的第一次施用结合的3剂每日5mg/kg/天甲氨蝶呤的情况中，用0.5mg/kg阿仑单抗处理小鼠5个月。T细胞在用阿仑单抗的第5次处理后消减。⑶8CEN:⑶8+中央记忆T细胞；⑶8EFF MEM:⑶8+效应记忆T细胞KD4CEN MEM:⑶4+中央记忆T细胞<D4EFF MEM:⑶4+效应记忆T细胞。星形标示具有统计学显著差异的测量(*，p〈0.05)。
[0055]图27A-B显示了甲氨蝶呤对脾中B细胞数目的影响。在有或没有与阿仑单抗的第一次施用结合的3剂每日5mg/kg/天甲氨蝶呤的情况中，用0.5mg/kg阿仑单抗处理小鼠5个月。星形标示具有统计学显著差异的测量(*，p〈0.05)。
[0056]图28A-B显示了在单剂阿仑单抗后3天的脾淋巴细胞消减。图28A:T细胞和B细胞是显著消减的。小方格图案代表用PBS处理的对照小鼠，而大方格图案代表用阿仑单抗处理的小鼠。图28Β:Β细胞(⑶19+)在处理后24小时时是92%消减的，并且在处理后3天仍然是36%消减的。三幅图代表不同组的动物，将每只动物在不同时间点时取血。星形标示具有统计学显著差异的测量(*，Ρ〈0.05;**，P≤0.001 ;***，P≤0.0001)。
[0057]图29Α-Β显示了甲氨蝶呤对细胞因子水平的影响。图29Α显示了 6个月研究的研究设计以评估脾和淋巴结中的细胞因子水平。星形标示在用阿仑单抗的第5次处理后24小时收集数据。箭标示施用阿仑单抗或甲氨蝶呤或者实施末期处死的时间点，如标示的。图29Β显示了仅用阿仑单抗或用阿仑单抗和甲氨蝶呤处理的小鼠中属于TNF家族(BAFF)的B细胞活化因子的水平。
[0058]图30Α-Β显示了在用阿仑单抗和甲氨蝶呤处理后的细胞因子水平。图30Α显示了4个月研究的研究设计。星形标示在甲氨蝶呤的第二个周期后I周收集数据。箭标示施用阿仑单抗或甲氨蝶呤或者实施末期处死的时间点，如标示的。图30Β显示了仅用阿仑单抗(AZM)或用0.5mg/kg、l.0mg/kg、或2.0mg/kg甲氨蝶呤处理的小鼠中各种细胞因子的水平。
[0059]图31显示了甲氨蝶呤对ILlO-/-(敲除)和C57BL/6小鼠中抗rhGAA滴度的影响。在rhGAA的头三次每周处理后O、24和48小时时,在用或不用5mg/kg/天甲氨蝶呤的情况中，在ILlO-/-敲除小鼠和C57BL/6野生型小鼠中每周施用20mg/kg rhGAA达9周。
[0060]图32显示了一些但不是所有脾B细胞群体在用阿仑单抗处理后的I和/或2周时消减。小阴影线柱形代表用磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理的huCD52转基因对照小鼠；大阴影线柱形描绘了用0.5mg/kg阿仑单抗处理连续5天的hu⑶52转基因小鼠。星号标示具有统计学显著差异的测量(*，Ρ〈0.05;**, P ^ 0.001;***, P ^ 0.0001)。
[0061]图33显示了用于在用阿仑单抗处理的背景中检查甲氨蝶呤对B细胞群体的影响的研究设计。使用甲状腺和淋巴结(LN)进行病理学评估。箭标示施用阿仑单抗或甲氨蝶呤或者实施末期处死的时间点，如标示的。
[0062]图34显示了三剂每日单独的5mg/kg/天甲氨蝶呤、单独的0.5mg/kg阿仑单抗、和组合的0.5mg/kg阿仑单抗和5mg/kg/天甲氨蝶呤对消减B细胞群体的影响。星号标示具有统计学显著差异的测量(*，ρ〈0.05;**，ρ < 0.001;***, P ^ 0.0001 ;ns,不显著)。
[0063]图35显示了在用单独的0.5mg/kg阿仑单抗或三剂每日单独的5mg/kg/天甲氨蝶呤或组合的0.5mg/kg阿仑单抗和5mg/kg/天甲氨蝶呤的5个处理周期后甲氨蝶呤对B细胞消减的影响。星号标示具有统计学显著差异的测量(*，p〈0.05)。
[0064]图36显示了细胞因子MCP-1、IL-13、IL-6、和IL-12的水平在用阿仑单抗处理的第一天施用的5mg/kg甲氨蝶呤的3天单个周期处理的小鼠中降低。在用甲氨蝶呤处理后4个月，在第5剂阿仑单抗后24小时收集数据。
[0065]图37A-B显示了 nu/nu裸鼠中第2周、第6周、和第12周的rhGAA滴度。图37A显示了第2周和第6周的rhGAA滴度。从左至右,用盐水处理的对照小鼠、用rhGAA处理的小鼠、和用rhGAA和甲氨蝶呤处理的小鼠中的第2周测量，接着是用盐水处理的对照小鼠、用rhGAA处理的小鼠、和用rhGAA和甲氨蝶呤处理的小鼠中的第6周测量。图37B显示了(从左至右)仅用rhGAA(Myo)处理的nu/nu小鼠、用甲氨蝶呤和rhGAA处理的nu/nu小鼠、仅用rhGAA处理的BL6小鼠、和用甲氨蝶呤和rhGAA处理的BL6中的第12周测量。
[0066]图38A-B显示了 IL-1O表达BlO B细胞的数目和百分比在用甲氨蝶呤实现针对rhGAA耐受的小鼠中增加。通过流式细胞术对自用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的动物分离的BlOB细胞评估IL-1O蛋白质表达。[0067]图39A-B显示了 IL-10在活化的(⑶86+)和非活化的(⑶860B10 B细胞两者中表达。图39A描绘了用⑶86染色的BlOB细胞的FACS图，而图39B描绘了响应用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的⑶86+IL10+B10 B细胞和⑶861L10+B10 B细胞的数目。
[0068]图40A-B显示了与rhGAA —起的甲氨蝶呤处理诱导BlO B细胞提高其TGF-β表达。图40Α的第二幅和第三幅小图是FACS图,其显示了来自用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的动物的用TGF-β和⑶86染色的BlO B细胞。图40A的第一幅小图描绘了用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的动物中TGF-β+BlO B细胞的数目。图40Β描绘了⑶86+TGF-β+BlOB细胞和⑶86-TGF- β +BlO B细胞计数。[0069]图41Α描绘了 BlO B细胞表现为在用rhGAA处理的动物中表达FoxP3 (图41A)。图41B描绘了 FoxP3+B细胞数目在甲氨蝶呤和rhGAA两者处理的情况中增加。图41C描绘了活化的(CD86+)和非活化的(CD86_)B10 B细胞表达FoxP3。
[0070]图42A-C显示了滤泡、移行2、和移行3B细胞(顶部至底部)表达IL-10，并且与仅用rhGAA处理的小鼠相比，IL-10表达B细胞子集的细胞数目在甲氨蝶呤的情况中增加。
[0071]图43A-C显示了滤泡、移行2、和移行3B细胞(顶部至底部)表达TGF-β，并且与仅用rhGAA处理的小鼠相比，TGF-β表达B细胞子集的细胞数目在甲氨蝶呤的情况中增加。
[0072]图44A-C显示了显示了滤泡、移行2、和移行3Β细胞(顶部至底部)表达FoxP3，并且与仅用rhGAA处理的小鼠相比，FoxP3表达B细胞子集的细胞数目在甲氨蝶呤的情况中增加。
[0073]图45显示了在存在或缺乏5mg/kg抗TGF-β抗体(1D11, Genzyme)或同种型对照(13C4)的情况中用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的动物中在第6周的抗rhGAA滴度。在不同的四组动物中两周一次评估抗体滴度。
[0074]图46A-C显示了 IDll处理干扰甲氨蝶呤诱导的表达TGF-β、IL-10、或FoxP3的BlO B细胞扩充。从用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理，并在单次rhGAA处理或单次rhGAA和甲氨蝶呤处理后7天还共施用IDll或13C4的动物分离脾。然后，将每组中的细胞合并，并培养2天，然后使用流式细胞术计数。
[0075]图47A-C显示了 IDll处理干扰甲氨蝶呤诱导的表达TGF-β或IL-10的滤泡B细胞扩充，尽管FoxP3+滤泡B细胞不表现为经历IDll效应。从用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的动物分离脾，所述动物在单次rhGAA处理或单次rhGAA和甲氨蝶呤处理后7天还共施用IDll或13C4。然后，将每组中的细胞合并，并培养2天，然后使用流式细胞术计数。
[0076]图48A-C显示了在移行2B细胞中，虽然IDll处理干扰甲氨蝶呤诱导的TGF-β表达移行2B细胞扩充，但是没有对IL-1O+移行2B细胞看到效应。从用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理,并在单次rhGAA处理或单次rhGAA和甲氨蝶呤处理后7天还共施用IDll或13C4的动物分离脾。然后，将每组中的细胞合并，并培养2天，然后使用流式细胞术计数。
[0077]图49A-C显示了在移行3B细胞中，存在有可检测的TGF-β ,IL-10和FoxP3，但是IDll处理对细胞没有明显影响。从用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理，并在单次rhGAA处理或单次rhGAA和甲氨蝶呤处理后7天还共施用IDll或13C4的动物分离脾，并使用流式细胞术对细胞计数。
[0078]图50A-C显示了 IDll处理不影响滤泡B细胞、移行2B细胞和移行3B细胞(顶部至底部)中的IL-10、TGF-β、和FoxP3的基础水平。[0079]图51A是一幅示意图，其显示了将来自对rhGAA(Myozyme?或“ΜΥ0”)耐受的小鼠的总脾B细胞转移至rhGAA未接触(na‘ive)的接受小鼠。在转移后，用20mg/kg rhGAA每周处理接受者(以及用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的非转移的对照动物)。
[0080]图51B显示了滴度分析,其证明了自用rhGAA和单个周期的甲氨蝶呤处理的动物分离的总脾B细胞可以在未接触(naive )宿主中转移针对rhGAA的免疫耐受性。
[0081]图52描绘了来自用家兔186(1^186)、单独的11^了6、1^186和甲氨蝶呤、或11^了6和甲氨蝶呤处理的正常小鼠的血液或脾的细胞计数。甲氨蝶呤在正常动物中没有消减CD4+、CD8+、T 调节(CD4+CD25+FoxP3+)T 细胞、或总 CD19+B 细胞。
[0082]图53描绘了来自在移植后14天用rblgG、单独的mATG、rblgG和甲氨蝶呤、或mATG和甲氨蝶呤处理的移植小鼠的血液或脾的细胞计数。甲氨蝶呤在移植动物中没有消减CD4+、CD8+、T 调节(CD4+CD25+FoxP3+)T 细胞、和总 CD19+B 细胞。
[0083]图54显示了甲氨蝶呤处理诱导多个细胞子集中IL-10的统计学显著增加，如通过在用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的动物中这些蛋白质的均值荧光强度(MFI)的变换观察到的。
[0084]图55显示了甲氨蝶呤处理诱导多个细胞子集中TGF-β的统计学显著增加，如通过在用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的动物中这些蛋白质的均值荧光强度(MFI)的变换观察到的。
[0085]图56显示了甲氨蝶呤处理诱导多个细胞子集中FoxP3的统计学显著增加，如通过在用rhGAA或rhGAA和甲氨蝶呤处理的动物中这些蛋白质的均值荧光强度(MFI)的变换观察到的。
[0086]发明详述
[0087]本发明基于我们的令人惊讶的发现，即单个周期或短疗程的甲氨蝶呤施用降低接受蛋白质治疗剂(诸如替换酶或治疗性抗体)的患者中不想要的免疫应答(诸如ADA应答，和其它不想要的T和/或B细胞介导的免疫应答)，和组织移植中的抗移植物抗体应答。此发现导致用于提高蛋白质疗法和器官移植的安全性和效力两者的新方法。
[0088]更具体地 ，我们的研究已经显示了单个周期的甲氨蝶呤降低针对抗体治疗剂的ADA。如下文详述的，用一种鼠型式的多克隆抗体治疗剂即Thymoglobulin?完成一组实
验。Thymoglobulin?是一种家兔抗人胸腺细胞球蛋白多克隆抗体，用于实体器官移植背景中的免疫抑制、再生障碍性贫血及预防移植物抗宿主病。已经开发出家兔抗鼠胸腺细胞球蛋白多克隆抗体(mATG)。它维持与Thymog丨obulilT?相似的特征(Ruzek,等，Transplantation, 88⑵:170-9 (2009))。我们已经证明了单个疗程的甲氨蝶呤可以将抗mATGIgG滴度降低>95%。实际上，令人惊讶地，我们已经发现了单个周期的甲氨蝶呤在降低ADA上比三个周期的甲氨蝶呤更好地起作用。另外，此ADA降低维持循环mATG的水平，并且在重复mATG剂量给药后增强mATG介导的细胞消减和T调节细胞百分比。用单克隆抗体治疗剂阿仑单抗完成我们的另一组研究。我们已经发现了单个疗程的甲氨蝶呤可以类似地控制抗阿仑单抗应答，并且增强阿仑单抗介导的淋巴细胞消减。
[0089]我们已经发现了甲氨蝶呤的此单个周期方案还降低蛋白质治疗剂是酶的情况中的ADA。在我们的两项研究中，我们证明了单个周期的甲氨蝶呤可以有效控制抗Myozyme? (重组人阿葡糖苷酶α或“rhGAA”)应答，其中最初认为需要多个周期来降低ADA。
[0090]我们已经发现了甲氨蝶呤也可用于器官移植。在我们的研究中，我们发现了单个周期的甲氨蝶呤可以控制心脏异基因移植物移植中的抗异基因移植物抗体应答。在与mATG组合时，心脏异基因移植物的存活显著更长。
[0091]我们的研究显示了蛋白质疗法的第一周内给予单个周期的甲氨蝶呤可以提供多个月的剂量给药里ADA长时间的大于95%的降低。此抗体滴度降低是长时间的，尽管贯穿大部分研究缺乏甲氨蝶呤。此外，我们已经发现了单个周期的甲氨蝶呤可以控制抗异基因移植物应答(例如在鼠异基因心脏移植物模型中)，显示了同时控制针对多种抗原的抗体应答。
[0092]经典地，已知甲氨蝶呤是二氢叶酸还原酶拮抗剂，认为其通过抑制嘌呤代谢并且干扰重新 DNA 合成来杀死增殖细胞(Kremer, Arthritis Rheum, 50 (5): 1370-82 (2004))。可以容易假设，经由此充分描述的机制，甲氨蝶呤仅可以杀死反应性细胞，但是这在我们已经发现的单个周期方案的情况中似乎不太可能。甲氨蝶呤具有较短的半衰期，并且在细胞或循环中不太可能长得足以在处理后3至4个月仍活跃杀死细胞(Walling, Invest New Drugs, 24(1):37-77(2006) ; Slavikova 等，Neoplasma, 25(2):211-6 (1978))。此外，我们没有发现甲氨蝶呤处理后淋巴细胞消减的证据。更确切地，令人惊讶地，我们已经发现了甲氨蝶呤的单个周期方案通 过诱导免疫控制的活性机制，不是通过无差别消减淋巴细胞来降低不想要的抗体应答。
[0093]我们的研究显示了单个周期的甲氨蝶呤增加BlO调节B细胞及活化的边缘区B细胞、活化的滤泡B细胞和活化的移行3B细胞。我们的研究还显示了单个周期的甲氨蝶呤增加IL-10表达、TGF- β表达、和FoxP3表达B10、滤泡、移行2和移行B细胞的数目，且此扩充是由TGF-β介导的。这些研究还显示了甲氨蝶呤提高IL-10、TGF-β、和FoxP3的表达水平。鉴于目前对甲氨蝶呤的作用机制的了解，脾B细胞群体的扩充是令人惊讶的，并且提示了在此剂量给药示例中，甲氨蝶呤以独特的、先前未知的方式起作用。已经显示了在经英夫利昔单抗治疗的类风湿性关节炎患者中较低连续剂量的甲氨蝶呤降低抗英夫利昔单抗抗体应答；但因为暴露是连续的，此方案较有可能牵涉持续的免疫抑制，而不是耐受性诱导。已经显示了单独的甲氨蝶呤处理在以低剂量每周给予时在类风湿性关节炎中降低疾病活性。最近的出版物提示了连续施用低剂量甲氨蝶呤(每隔一天)后，出现自身抗原特异性T调节细胞，其可以帮助解释甲氨蝶呤处理在类风湿性关节炎中的效力(Xinqiang等，Biomed Pharmacother, 64 (7): 463-471(2010))。比较而言，本文中对甲氨蝶呤描述的剂量给药示例是真正独特的，因为它牵涉较短疗程的甲氨蝶呤处理，其可以提供对不想要的免疫学应答的长期控制。
[0094]总之，我们已经鉴定出独特的甲氨蝶呤剂量给药方案，其可以对几种不同类型的ADA应答和组织移植中的抗异基因移植物抗体应答，及T细胞和B细胞应答产生长期控制。我们已经发现了可以将由甲氨蝶呤形成的免疫耐受性从一只动物转移至另一只，例如通过将来自耐受化动物的B细胞移植至非耐受化动物进行。我们的数据提示了甲氨蝶呤经由独特的作用机制起作用，该作用机制牵涉扩充活化的B细胞子集，该活化的B细胞子集可以代表在抑制免疫应答中有活性的调节B细胞。此外，甲氨蝶呤也可以经由T调节细胞扩充机制起作用。
[0095]生物疗法中不想要的免疫应答
[0096]本发明的方法可以控制多种生物学疗法(例如使用生物制剂，诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质和代谢物的疗法)中不想要的免疫学应答(例如ADA应答，和其它不想要的T和/或B细胞介导的免疫应答)。蛋白质疗法指治疗剂是蛋白质性物质(包括肽和蛋白质)的疗法。例如，蛋白质治疗剂可以是酶、细胞因子、生长因子、免疫调节剂、溶血栓药、抗体(包括多克隆和单克隆抗体)、抗体片段或经修饰的抗体(例如Fab、F(ab’)2、Fv、Fd、scFv、和dAb)。例如，已经针对具有某些遗传疾病的患者开发出许多酶替换疗法，包括用于法布里(Fabry)病的Fabrazyme? (重组人Cl -半乳糖苷酶)、用于戈谢(Gaucher)病的 Cerezyme κ (伊米苷酶(imiglucerase))、用于粘多糖忙积症I (MPS I)的Aldurazyme?(拉罗尼酶(Iaronidase))、和用于蓬佩病的MyozymefB)和Lumizyme? (阿葡糖苷酶α )。抗体治疗剂的例子包括Campath? (阿仑单抗)、Thymoglobulin?、Avastin? (贝伐单抗(bevacizumab) )、Lucentis? (兰尼单抗(ranibizumab) )、Remicade(R)(英夫利昔单抗)、Humira? (阿达木单抗(adalimumab) )、Rituxan? (利妥昔单抗)、Tysabri?(那他珠单抗(natalizumab) )、Simulect? (巴利昔单抗(basiliximab) )、Zenapax?(达克珠单抗(daclizumab) )、OKT3? (莫罗单抗-CD3 (muromonab-CD3) )、Erbitux? (西妥昔单抗(Cetuximab) )、Mylota_rg? (吉姆单抗(gemtuzumab) )、Herceptin? (曲妥单抗(trastuzumab))、和Benlysta? ( m利木单抗(belimumab))。其它蛋白质治疗剂的例子包括Enbrel? (依那西普(etanercep)),和其它融合蛋白。
[0097]在许多情况中，在患者中可以产生不想要的针对蛋白质治疗剂的免疫应答，这对患者结果引起可变的影响。此类应答由于生物制剂治疗剂经常含有对于人患者而言外来的序列和构象而发生。例如，ADA干扰治疗剂效力和/或增加安全性风险。ADA可以引起超敏感性反应、过敏反应、血清病、免疫复合物病(immune complex disease)、急性肾衰竭。临床医生可以使用完善确立的方法(包括ELISA和免疫组织化学)在接受蛋白质疗法的患者中监测昼。
[0098]在一些情况中，如本文中使用的，“蛋白质疗法”指病毒疗法，其中使用病毒载体来投递核酸治疗剂。此类疗法中使用的例示性病毒包括但不限于腺病毒、腺伴随病毒、和逆转录病毒。可以形成针对病毒的壳体蛋白的抗体，这降低此类疗法的效力并且增加安全性风险。本发明的方法也可用于控制病毒疗法中不想要的免疫学应答(例如ADA应答，和其它不想要的T和/或B细胞介导的免疫应答)。
[0099]本发明的方法也可以控制非蛋白质生物学疗法中不想要的免疫学应答。例示性的非蛋白质生物疗法包括但不限于核酸疗法(例如反义疗法、siRNA疗法、和miRNA疗法)。
[0100]移植中的抗移植物应答
[0101]也可以使用本发明的方法在接受组织移植(诸如肾移植、肝移植、心脏移植、和干细胞移植)的患者中诱导免疫耐受性。宿主抗移植物和移植物抗宿主排斥经常在组织移植(尤其是异基因移植物和异种移植物移植)中发生。可以单独或与另一种免疫调控剂(例如免疫抑制剂iiV川Thymoglobulin?) —起使用单个周期的甲氨蝶呤以管理抗移植物抗体应答。另外，Thymoglobulin?和甲氨蝶呤的组合可以在移植中起延长移植物存活的作用。最后，在慢性自身免疫性疾病诸如类风湿性关节炎和多发性硬化的背景中调查Thymoglobulin?的情况中，甲氨蝶呤可以容许更安全的Thymoglobulin?再次治疗，这
保护患者免于形成相当多的抗家兔抗体(诸如IgG和/或IgM)和/或输注相关反应。
[0102]用甲氨蝶呤管理不想要的免疫学应答
[0103]我们已经发现了单个短周期的甲氨蝶呤可以显著降低接受生物制剂治疗剂(例如蛋白质治疗剂)的受试者中不想要的免疫学应答诸如ADA和接受组织移植的患者中的抗异基因移植物应答。降低不想要的ADA不仅可以改善患者安全性，而且还可以经由改善蛋白质治疗剂的药效学和/或药动学改善蛋白质治疗剂的效力。 [0104]甲氨蝶呤(一种小分子化合物)已经用于治疗患有重度活动性类风湿性关节炎、重度银屑病、和某些类型的癌症，包括在子宫中受精卵周围形成的组织中开始的癌症、乳腺癌、肺癌、某些头和颈癌、某些类型的淋巴瘤、和白血病(在白细胞中开始的癌症)的患者。甲氨蝶呤通过减缓癌细胞生长来治疗癌症。甲氨蝶呤通过减缓皮肤细胞生长以停止鳞屑形成来治疗银屑病。甲氨蝶呤可以通过降低免疫系统的活性来治疗类风湿性关节炎。
[0105]已经在控制针对α -半乳糖苷酶A和α -葡糖苷酶引发的ADA应答的背景中研究甲氨蝶呤。然而，那些研究是用多个周期的甲氨蝶呤处理(Garman等，Clin Exp Immunol,137(3):496-502(2004) ; Jos 印h 等，Cl in Exp Immunol, 152(1):138-46(2008) ; Mendelsohn等，N Engl J Med，360 (2):194-5 (2009))，而不是单个周期的甲氨蝶呤完成的。
[0106]令人惊讶地，我们的研究显示了单个周期的甲氨蝶呤足以显著降低ADA和抗异基因移植物抗体。实际上，在牵涉抗体治疗剂(例如mATG)的研究中，我们显示了单个周期的甲氨蝶呤处理比多个周期的甲氨蝶呤处理在降低ADA上更有效。使用甲氨蝶呤的先前研究没有给出如下的指示，即单个周期的甲氨蝶呤会足以诱导降低ADA，更不用说，它比多个周期处理更有效。已知甲氨蝶呤是细胞毒性的。因此，若假设通过甲氨蝶呤降低ADA的机制依赖于此特性，则预测降低治疗周期数目实际上会降低甲氨蝶呤的有益效果。此外，那些先前发表的研究没有证明甲氨蝶呤处理对药动学、药效学、效力、或安全性的益处，如本文中已经用单个疗程的甲氨蝶呤令人惊讶地证明的。它们也确实没有披露甲氨蝶呤可以降低抗体疗法中的ADA。 [0107]如本文中使用的，单个周期方案指连续或非连续几天的治疗方案或治疗单元，并且优选地，在主要蛋白质治疗剂的剂量给药或移植后不超过5 (例如不超过3)天时开始。若将主要蛋白质治疗剂在多个时期中剂量给药，则优选地，单个周期的甲氨蝶呤处理不延伸过蛋白质治疗剂剂量给药的第一个时期。举例而言，在每周、每月或每年蛋白质疗法中，单个周期的甲氨蝶呤由在第O天，即第一次对患者给予主要蛋白质治疗剂，或患者接受组织移植的日期开始连续三天的甲氨蝶呤摄取(例如口服)组成。然后，患者在第I天(24小时后)和第2天(48小时后)接受一剂甲氨蝶呤。例如，单个周期的甲氨蝶呤也可以由在第O天开始的2、3、4、5、6、7、或8个连续每日剂量的甲氨蝶呤组成。甲氨蝶呤也可以在认为适当的其它时间时施用，例如在例如淋巴细胞消减疗法中管理继发性自身免疫时。优选地，单个周期的甲氨蝶呤不持续长于8天。在一些实施方案中，单个周期的甲氨蝶呤在主要治疗性处理(即，用生物制剂治疗剂处理)开始之前48小时和之后48小时之间开始。例如，单个周期的甲氨蝶呤可以在主要治疗性处理开始之前48小时，之前36小时，之前24小时，之前12小时，同时，之后12小时，之后24小时，之后36小时，或之后48小时开始。
[0108]令人惊讶地，我们的研究还显示了低剂量的甲氨蝶呤足以管理蛋白质疗法和移植中不想要的免疫学应答(例如ADA应答，和其它不想要的T和/或B细胞介导的免疫应答)。因而，在本发明的实施方案中，可以在超过一个周期中，但是以较低的总剂量施用甲氨蝶呤。例如，可以在患者中在两个或更多个(例如3、4、5、6，等等)周期中，但是以不超过5mg/kg的总组合剂量施用甲氨蝶呤。
[0109]甲氨蝶呤的剂量会是甲氨蝶呤在单个周期中给予时在降低不想要的免疫学应答(诸如抗体或细胞应答)中的有效量。甲氨蝶呤在人患者中的有效量可以在0.05mg/kg至5mg/kg的范围中。在一些实施方案中，有效量是0.lmg/kg至1.5mg/kg。在一些实施方案中，有效量是0.12mg/kg至1.28mg/kg。在某些实施方案中，有效量是0.12mg/kg。在某些实施方案中，有效量是1.28mg/kg。推荐剂量的甲氨蝶呤可以引起最小限度的安全性风险，因为剂量给药方案仅牵涉短暂疗程的甲氨蝶呤，其的剂量水平比低新生物剂量更类似于用于类风湿性关节炎的剂量。在我们的研究中，在小鼠中在每个周期中测试的甲氨蝶呤的总量是14或15mg/kg。小鼠中的14mg/kg甲氨蝶呤大致等于重量为60kg的平均成年人中的68mg或5.92mg/m2。类风湿性关节炎患者可以在不遭受相当多毒性的情况中每周接受多至25mg甲氨蝶呤。认为甲氨蝶呤的低新生物剂量是30mg/m2,其显著高于5.92mg/m2。如此，与此甲氨蝶呤方案的短暂性质组合，上文推荐的剂量在成年人中可能是耐受良好的。考虑患者的身体状况、年龄、重量、性别、他/她在服用的其它药物及其已知的副作用和任何其它相关因素，甲氨蝶呤的确切剂量和方案当然应当由临床医生建立。可以通过公知的方法监测甲氨蝶呤在管理 患者中不想要的抗体应答方面的效果，所述公知的方法包括患者的临床检查、症状、测定ADA或抗异基因移植物抗体滴度的血液测试、免疫组织化学测定法(例如C4沉积测定法和其它固相抗体检测方法诸如酶联免疫吸附测定法(ELISA)和基于珠的荧光测量测定法)。也可以通过测量生物标志物诸如MCP-l、IL-13、IL-6、和IL-12 (我们已经显示了它们的水平因甲氨蝶呤处理而降低)，和移行2B细胞、移行3B细胞、滤泡B细胞、边缘区B细胞、BlOB细胞、和BlB细胞(我们已经显示了它们的数目因甲氨蝶呤处理而增加)的水平监测效果。另外，在需要时，可以使用TGF-β、FoxP3、IL-5、IL-10、IL-15、和GM-CSF作为生物标志物来监测甲氨蝶呤对不想要的免疫应答的影响。也可以使用生物标志物的水平来监测甲氨蝶呤对T细胞对治疗剂(例如蛋白质治疗剂)的响应性的影响。也可以监测T细胞活化的生物标志物诸如IL-2、干扰素-Y、和TNF-α作为甲氨蝶呤对T细胞应答的影响的读出。
[0110]由于其控制不想要的免疫应答的能力，本发明的单个周期甲氨蝶呤方案可以扩展许多蛋白质治疗剂的用途，所述蛋白质治疗剂在给定患者中的重复使用过去由于安全性和效力忧虑而受到限制。例如，甲氨蝶呤与Thymoglobulin?的伴随使用可以将
Thymoglobulin?的效用扩展到期望再次剂量给药的其它疾病背景，诸如τ细胞介导的
自身免疫性疾病，包括但不限于糖尿病、狼疮、硬皮病、类风湿性关节炎、银屑病和多发性硬化。另外，甲氨蝶呤可以扩充阿仑单抗的效力和安全性，例如在自身免疫性疾病诸如多发性硬化中(其中通常在重复每年周期中)或在慢性B细胞淋巴细胞性白血病中(其中在12周周期中施用阿仑单抗)，剂量给药以3mg/天开始(直至输注反应等于或小于2级)，然后放大至IOmg/天(直至输注反应等于或小于2级),且最终向上移动至30mg/天(隔天,每周3次)。这些类型的剂量给药方案可以加强抑制性ADA应答。如此，可以使用甲氨蝶呤来控制ADA和任何其它不想要的免疫应答。
[0111]用甲氨蝶呤改善淋巴细胞消减疗法
[0112]本发明的一项例示性应用是在治疗多发性硬化(MS)(诸如复发-缓解性MS)中使用甲氨蝶呤来改善淋巴细胞消减疗法(诸如阿仑单抗疗法)。“淋巴细胞消减”是一类通过减少循环淋巴细胞(例如T细胞和/或B细胞)，导致淋巴细胞减少的免疫抑制。在治疗上，可以通过蛋白质治疗剂诸如Thymoglobulin?、人源化抗CD52单克隆抗体CAMPATH-1H?
(阿仑单抗)、和利妥昔单抗实现淋巴细胞消减。淋巴细胞消减在治疗许多自身免疫性状况中是期望的，包括多发性硬化(Coles 等，Ann.Neurol.46，296-304 (1999) ; Coles 等，2008)、类风湿性关节炎、血管炎、和狼疮。
[0113]淋巴细胞消减疗法可以引起继发性自身免疫。自身免疫当其在第一(“原发性”)疾病(例如“原发性”自身免疫性疾病)的发作后出现时在本文中称为“继发性自身免疫”。继发性自身免疫有时在例如淋巴细胞消减疗法后具有或已经具有淋巴细胞减少的MS患者中出现。在一些个体中，继发性自身免疫在淋巴细胞消减疗法(例如用阿仑单抗治疗)后不久出现。在其他个体中，继发性自身免疫可以直到淋巴细胞消减疗法后几个月或几年才出现；在那些个体中的一些中，到他们形成继发性免疫时，可以已经发生实质性淋巴细胞恢复(总淋巴细胞计数)，使得他们可能不再是淋巴细胞减少的。在用抗体治疗剂或小分子治疗剂治疗的背景中可以发生淋巴细胞消减。
[0114]在淋巴细胞减少性MS患者中出现的继发性自身免疫可以是与MS不同的任何类型的自身免疫性状况，包括但不限于甲状腺自身免疫(例如格雷夫斯(Graves)氏病)、血小板减少性紫癜(thrombocytopenic purpura)、免疫性血小板减少症(immunethrombocytopenia, ITP)、古德帕斯彻(Goodpasture)氏病、自身免疫性嗜中性白血球减少症(autoimmune neutropenia)、自身免疫性溶血性贫血(autoimmune hemolytic anemia)、和自身免疫性淋巴细胞减少(autoimmune lymphopenia)。在一些实施方案中，继发性自身免疫是B细胞介导的，即B细胞应答和自身抗体与疾病形成和病理学直接联系。
[0115]用于诊断和监测这些自身免疫性疾病的技术是本领域技术人员公知的，包括评估症状和医学检查诸如血液分析。本发明涵盖任何已知方法的使用。例如，可以测定患者体液(例如血液)中的自身抗体水平作为检测自身免疫体征的手段。具体地，可以测量抗核抗体、抗平滑肌抗体、和抗线粒体抗体。如果检测抗核抗体，那么可以实施别的测定法以测量抗双链DNA抗体、抗核糖核蛋白抗体、和抗La抗体。可以测量抗甲状腺过氧化物酶(TPO)和抗促甲状腺激素(TSH)受体抗体以检测自身免疫性甲状腺疾病；若检测抗TPO或抗TSH受体抗体，则可以通过测量游离的T3、游离的T4和TSH水平测量甲状腺功能是否受到影响。可以测量抗血小板抗体以检测自身免疫性血小板减少，并且血液血小板水平的测量可以用来测定抗血小板抗体的存在是否引起血小板数目减少。还可见W02010/041149。
[0116]可以使用本发明的单个周期甲氨蝶呤方案通过降低ADA以及使继发性自身免疫最小化来改善淋巴细胞消减疗法的安全性和效力。不希望限于理论，我们认为甲氨蝶呤可以通过同时耐受多种自身抗原来降低继发性自身免疫。
[0117]除非另有定义，本文中使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料也可以用于实施或测试本发明，下文描述了例示性的方法和材料。通过提及将本文中提及的所有出版物和其它参考文献完整收录。在冲突的情况中，应当以本说明书(包括定义)为准。虽然本文中引用许多文件，但是此引用不构成承认，任何这些文件形成本领域的公知常识的一部分。贯穿本说明书和权利要求书，词语“包含”或变型应当理解为暗示包括陈述的整数或整数组，但不排除任何其它整数或整数组。材料、方法和例子仅是例示性的，而并不意图为限制性。
实施例
[0118]本发明的更多详情会在以下非限制性实施例中描述。应当理解，虽然指示本发明的优选实施方案，这些实施例仅作为例示给出，而不应解释为限制所附实施方案。从本公开内容和这些实施例看，本领域技术人员可以确定本发明的某些特征，且在不偏离其精神和范围的前提下，可以对本发明做出各种变化和修饰以使其适合于各种用途和条件。这些工作例中使用的材料和方法如下描述。
[0119]小鼠
[0120]6和12周龄之间的正常雌性C57BL/6小鼠用于家兔抗鼠胸腺细胞球蛋白多克隆抗体(mATG)的体内研究，并且获自 Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME)或 TaconicLaboratories (Hudson, NY)。阿仑单抗相关研究米用6-12周龄的人Q)52 (huQ)52)转基因(Tg)小鼠，其获自Charles RiverLaboratories/Genzyme Corp0依照实验室动物护理和使用指南(Guide for Care and Use of Laboratory Animals)且在美国实验室动物护理认可协会I认可下将小鼠收容并维持，并且这些研究中使用的所有动物方案得到机构动物护理和使用委员会批准。
[0121]用于非临床药理学研究的huO)52Tg小鼠由Xenogen(Cranbury, NJ, USA)生成。为了生成所述小鼠，将含有来自人染色体I的约145个千碱基的基因组DNA的杆粒构建体随机整合入⑶-1胚胎干细胞的小鼠基因组中。依靠此杆粒含有的人基因组DNA跨距，在人⑶52外，构建体包含总共5个未知功能的部分或完整基因。杆粒中含有的5个部分或完整基因区段如下:人CD52基因、新基因(DKFZP434L0117)的3’端、SH3BGRL3基因(SH3域结合富含脯氨酸的蛋白样3)、伙伴(socius)基因(SOC)、AIM1L (黑素瘤缺乏I样)基因、和锌指蛋白683基因。生成3种建立者系，并且系107在Genzyme建立。
[0122]抗体施用
[0123]如Ruzek 等， Transplantation, 88 (2): 170-9 (2009)中描述的那样制备多克隆抗体mATG和rblgG，并根据实验在多个方案中通过腹膜内注射施用。以0.5mg/kg的单次注射或者在0.5mg/kg/天的3或5天周期中静脉内施用单克隆抗体阿仑单抗。
[0124]Myozyme? 处理
[0125]作为配制的药物产品，使用重组人阿葡糖苷酶a (rhGAA，由Genzyme Corp.以Myozyme?出售)。除非不同地叙述，通过尾静脉推注用20mg/kg rhGAA每周处理小鼠。在rhGAA 施用前用 5 至 30mg/kg 苯海拉明(Baxter Healthcare Corporation, Deerfield, IL)腹膜内预防性处理所有小鼠。用无菌0.9%盐水或rhGAA配制缓冲液静脉内处理对照动物。
[0126]甲氨蝶呤处理
[0127]通过腹膜内注射以0.5、1.0、2.0或5mg/kg施用甲氨蝶呤(Calbiochem产品目录编号#454125) 1-3个周期，其中根据实验，每个周期等于注射连续3、6或7天。在牵涉每月mATG处理的研究中，在初始mATG处理或头三次mATG处理后0、24、和48小时时以5mg/kg腹膜内施用甲氨蝶呤。在第O天和第4天服用mATG的移植物研究中，每日以2mg/kg从第O天至第6天,每日以0.5mg/kg从第O天至第6天,或每日以0.5mg/kg从第O天至第11天给予甲氨蝶呤。
[0128]mATG 处理
[0129]以每四周的5mg/kg腹膜内注射或者以在用移植物当天(第O天)给予的第一剂的移植物背景中时以相隔4天给予的两剂20mg/kg施用多克隆抗体mATG。
[0130]来自各种组织的细胞制备物
[0131]对于脾细胞和淋巴结细胞制备物，通过磨砂玻璃载玻片间均质化入含有2%FCS的PBS中，从收获的小鼠脾或腹股沟和肠系膜淋巴结生成单细胞悬浮液。对于脾细胞制备物，通过与红细胞裂解溶液(BD Biosciences, San Diego, CA) 一起温育1-2分钟裂解红细胞。通过眶后取血分离血液，并通过用红细胞裂解溶液(BD Biosciences)将红细胞裂解20-30分钟实施细胞制备。对于所有组织制备物，使用ViCell自动化计数器(BeckmanCoulter, Fullerton, CA)计数活细胞。在分离后，在下文描述的测定法中使用前，用PBS/2%FCS清洗所有细胞制备物。
[0132]流式细胞术
[0133]为了评估不同组织内的细胞群体，将组织的单细胞悬浮液与缀合有荧光染料的抗体一起温育，所述抗体包括抗小鼠⑶4、⑶8、⑶25、⑶44、⑶62L (所有抗体来自 BD Biosciences 或 eBioscience, San Diego, CA)。依照抗 Foxp3 制造商的方案(eBiosciences, San Diego, CA)实施胞内Foxp3表达分析。在与抗体一起温育后,将细胞清洗，并通过流式细胞术(FACSCanto, BD Biosciences和FCS Express软件，De Novo软件,Los Angeles, CA)分析。
[0134]如下定义评估的细胞群体:
[0135]总CD4T 细胞:CD4+CD8、
[0136]总CD8T 细胞:CD8+CD4、
[0137]CD4 未免疫细胞:CD4+CD25TD62L+CD44、
[0138]CD4 记忆细胞:CD4+CD25TD62LXD44+，
[0139]未免疫CD8T 细胞:CD8+CD44XD62L+，
[0140]CD8 记忆细胞:CD8+CD44+CD62I7，
[0141]调节T 细胞:CD4+CD25+Foxp3+，
[0142]总B 细胞:CD19+，
[0143]B2/ 滤泡 B 细胞:CD19+CD21intCD23 高，
[0144]BlB 细胞:CD19+CD43+CDllb+，
[0145]移行 IB 细胞:CD19+CD93+CD231gM*，[0146]移行2B 细胞:CD19+CD93+CD23+IgM*，
[0147]移行3B 细胞:CD19+CD93+CD23+IgM低，
[0148]边缘区B细胞:CD19+CD21高CD23低，和
[0149]BlOB 细胞:CD19+CD5+CDld+。
[0150]体外阻断研究测定多至100 μ g/ml mATG没有阻止这些群体的检测。
[0151]抗mATG IgG ELISA
[0152]通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)分析小鼠血清中抗mATG IgG的水平。简言之，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)中I μ g/ml家兔IgG包被96孔板(Corning Inc., Corning, NY, USA)过夜。在用 Super Block 封闭缓冲液(ThermoScientific, Rockford, IL, USA)封闭后，将血清的连续稀释液一式两份添加至经家兔IgG包被的板，并于37°C温育I小时。将板清洗，并添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠 IgG 二抗(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA),并容许于37°C温育I小时。在最终清洗后，添加3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺底物(BioFx，OwingsMills, MD, USA)，并容许于室温显现15分钟。通过添加IN HCl停止反应，并在ELISA读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)上于 450/650nm 阅读吸光度数值。终点滴度定义为使用Softmax软件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)得到的平均值为高于0.100吸光度的最低稀释度。
[0153]mATG 特异性 IgG ELISA
[0154]通过ELISA测定小鼠血清。简言之，用I μ g/ml山羊抗家兔IgG-Fc片段抗体(Bethyl Laboratories, TX, USA)将 96 孔板(Corning Inc., Corning, NY, USA)包被过夜。用0.5%BSA (高纯度)封闭后，在必要时稀释标准对照和血清样品，并将其一式两份添加至经包被板的孔，并于36-38°C在温和摇动的情况中温育I小时。将板清洗，并在适当时添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗家兔IgG-Fc片段抗体Oethyl Laboratories, TX, USA),并于36-38°C在温和摇动的情况中温育I小时。在最终清洗后，添加3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺底物(BioFx, Owings Mills, MD, USA)，并容许于23_25°C显现15分钟。通过添加IN HCL停止反应，并在 ELISA 读板仪(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)上于 450/650nm 阅读吸光度数值。对标准曲线内推最终浓度。预先确定的是，通过此方法测量mATG特异性IgG仅受到大于218，000的抗mATG IgG滴度中度影响。
[0155]抗阿仑单抗IgG ELISA
[0156]在阿仑单抗处理后4-6天对小鼠取血，并通过ELISA测量特异性抗阿仑单抗IgG。简言之，用 PBS (ρΗ7.2)中的 3 μ g/ml 阿仑单抗将 96 孔板(Corning Inc., Corning, NY, USA)包被过夜。在用PBS中的0.1%BSA封闭后，将血清的连续稀释液一式两份添加至经阿仑单抗包被的板，并于37°C温育I小时。将板清洗，并添加缀合有辣根过氧化物酶的山羊抗小鼠 IgG 二抗(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA),并容许于37°C温育I小时。在最终清洗后，添加TMB底物(BioFx, Owings Mills, MD，USA)，并容许于室温显现15分钟。通过添加IN HCl停止反应，并在ELISA读板仪(MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA)上于450/650nm阅读吸光度数值。终点滴度定义为使用Excel软件(Microsoft，Redmond, WA, USA)得到的经对数换算的在吸光度数值0.2处插入的样品稀释度的逆对数。[0157]抗rhGAA IgG ELISA
[0158]在rhGAA处理后4-6天对小鼠取血，并通过ELISA测量特异性IgG。简言之，用乙酸钠缓冲液(pH5.0)中的 5 μ g/ml rhGAA 将 96 孔板(Corning Inc., Corning, NY, USA)包被过夜。在用PBS中的0.1%BSA封闭后，将血清的连续稀释液一式两份添加至经rhGAA包被的板，并于37°C温育I小时。将板清洗，并添加缀合有HRP的山羊抗小鼠IgG 二抗(Southern Biotechnology Associates, Birmingham, AL, USA),并容许于 37 °C 温育 I 小时。在最终清洗后，添加3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺底物(TMB, KPL, Gaithersburg1MD),并容许于室温显现15分钟。通过添加IN HCL停止反应，并在ELISA读板仪(MolecularDevices, Sunnyvale, CA)上于450/650nm阅读吸光度数值。终点滴度定义为使用Softmax软件(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)得到的产生吸光度数值0.2的样品稀释度的倒数。
[0159]离体研究
[0160]通过腹膜内注射1-3个周期对8-12周龄的C57BL/6 (Jackson Laboratories)或E4GAAK0(Charles River)小鼠给予5mg/kg 甲氛蝶呤(Calbiochem产品目录编号#454125),其中I个周期等于连续注射3天。以第一剂甲氨蝶呤开始，通过尾静脉注射给予20mg/kg Myozyme? (Genzyme Corporation) 一次或持续2-6个每周剂量。在启动处理后每周
或每日处死动物。收集脾、肠系膜、和腹股沟淋巴结以对T和B细胞子集进行流式细胞术分析，并收集血清进行ELISA测定法。将脾在玻璃载玻片间加工，并将红细胞(RBC)用购自BD Biosciences的裂解缓冲液(产品目录编号#555899)依照制造商的用法说明书裂解。将淋巴结在玻璃载 玻片间加工，并用含有2%胎牛血清(FCS)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)清洗。将细胞在200 μ L含有4%胎牛血清和25 μ g/mL总小鼠IgG的PBS中重悬，并于4°C封闭30分钟。用不同抗体混合物染色约300万个脾细胞和100万个淋巴结细胞，并在BectonDickinson CANT0II流式细胞仪上用高通量取样器(HTS)分析。在淋巴细胞门内获得至少100，000个细胞事件。抗小鼠抗体混合物由PE-CD21/35产品目录编号#552957、FITC-产品目录编号#553138、PE-CD138产品目录编号#553714、PE-CD127产品目录编号#552543、APC-Cy7-CD19 产品目录编号 #557655、FITC_CD43 产品目录编号 #553270、PE-Cy7_CD4 产品目录编号#552775、FITC-CD3e产品目录编号#553062、APC-CDllb产品目录编号#553312、PE-Cy7-1gM产品目录编号 #552867、APC-Cy7-CD8 产品目录编号 #557654、PE-CD273 (PD-L2)产品目录编号#557796、APC-CD138产品目录编号#558626、PE-Cy7_CDllb产品目录编号#552850、PE-CD93 (早期B谱系)产品目录编号#558039、APC_CD69产品目录编号#560689、Pe-Cy7-CD24产品目录编号#560536、FITC-CDld产品目录编号#553845、APC-CD5产品目录编号 #550035、和 Percp-Cy5-7AAD 产品目录编号 #559925 (均购自 BD Pharmingen)组成。FITC-FoxP3 胞内染色试剂盒购自 eBioscience。Pacific Blue (PB)-CD25 产品目录编号#102022、PB-CD23产品目录编号#101616和PB-CD86产品目录编号#105022购自BioLegend0用由De Novo软件提供的FCS Express第3版软件实施对淋巴细胞子集的分析。用批处理选项产生百分比，并依照获得的细胞计数计算绝对数目。用Beckman计数器V1-细胞XR细胞存活力分析仪依照制造商的用法说明书获得脾和淋巴结细胞计数。
[0161]体外和细胞因子分析
[0162]以用20mg/kg rhGAA处理开始，通过腹膜内注射对8-12周龄的C57BL/6 (JacksonLaboratories)或 E4GAAK0 (Charles River)小鼠给予 5mg/kg 甲氛蝶呤(Calbiochem 产品目录编号#454125)达I个周期(连续3个每日剂量)。对于IDll研究，以rhGAA和甲氨蝶呤处理开始，每周3次(每隔一天)用5mg/kglDll或13C4(Genzyme Corporation)的腹膜内注射处理动物。根据小鼠品系，在rhGAA启动后第6天或第7天处死动物。将脾制备为单细胞悬浮液，并依照制造商的用法说明书加载至RoboSep (STEMCELL technologies)仪上,并进行B细胞负选择。将纯化的B细胞在96孔圆底板(Costar产品目录编号#3799)中以每孔500，000个细胞接种，并于37°C在无刺激的情况中或与IOy g/mL LPS(Sigma产品目录编号札5014) —起温育48小时。依照制造商的用法说明书，所有孔接受莫能菌素(Monensin)(BD Bioscience产品目录编号#554724)。容许细胞于37°C温育至少4小时。将样品转移至V底孔(USA Scientific产品目录编号#651201)，并于4°C以1200rpm旋转5分钟。将细胞在200 μ L含有4%胎牛血清和25 μ g/ml总小鼠IgG的PBS中重悬，并于4°C封闭30分钟。将板再次旋转，并在添加10 μ I上文描述的抗体混合物的情况中在90 μ L PBS/2%FCS中重悬，并于4°C温育20分钟，对于最后10分钟的染色规程，添加5 μ L7AAD。将100 μ L缓冲液添加至样品及随后的旋转用作清洗。可以将样品在缓冲液中重悬以进行蛋白质表面分析和立即获取或者在Fix/Perm (eBioscience产品目录编号#11-5773)中重悬以依照制造商的用法说明书进行IL-10 (BioLegend产品目录编号#505008) ,TGF-β (BioLegend产品目录编号#141404)和FoxP3 (eBioscience产品目录编号#11-5773-82)的胞内染色。别的表面染色包括TGF-β和Tim-1 (BioLegend产品目录编号#119506)抗体。如上文描述的那样获得并分析所有样品。
[0163]动物和心脏异基因移植物模型
[0164]C57BL/6 和 BALB/c 小鼠获自 Charles River (Kingston, NY 或 Raleigh, NC)，并在8和13周龄之间在这些实验中使用。首先用氯胺酮(Fort Dodge Animal Health/Pfizer, Fort Dodge, IA)和甲苯噻嗪(Lloyd, Shenandoah, IA)的腹膜内注射麻醉供体异体C57BL/6小鼠，并实施正中胸骨切开术。经由下腔静脉给供体心脏缓慢原位输注Iml冷肝素化林格(Ringer)氏乳酸盐溶液(Baxter Healthcare, Deerfield, IL),并将上腔静脉前的主动脉和肺静脉结扎并分开。然后，横切升主动脉和肺动脉，从供体取出移植物，并将心脏在冰冷的盐水中贮存，直至嫁接。将接受小鼠(Balb/c)类似麻醉并准备，如上文对供体小鼠描述的，只是打开腹腔。使用手术显微镜观察打开的腹腔，分离腹主动脉(AA)和下腔静脉(IVC)。将供体心脏放入接受者腹部中(颠倒)，并在供体肺动脉和接收者下腔静脉，以及供体主动脉和接受者腹部主动脉之间用端-侧吻合术对移植物血运重建。在确认止血后，用连续 5-0 Vicryl 缝线(Ethicon, Johnson&Johnson, Somerville, NJ)闭合腹肌，并用连续5-OEthilon缝线(Ethicon)闭合皮肤。实施标准的术后疼痛评估和管理。通过对于头30天，每周触诊5-7次，然后每周3-4次，直到研究结束来评估移植物。
[0165]用I 剂 20mg/kg 静脉内 rhGAA (Genzyme Corporation)、连续 3 剂腹膜内 5mg/kg 甲氨蝶呤(APP Pharmaceuticals, LLC)、和每隔一天 3 剂 5mg/kglDll 或 13C4(GenzymeCorporation)处理C57B1/6小鼠。甲氨蝶呤、1D11、和13C4处理以rhGAA注射开始。处理启动后7天收集脾，并加工，如上文对B细胞、培养和流动分析描述的。另外，通过如上文描述的那样处理动物获得rhGAA滴度数据，在12周里每周给药rhGAA，将甲氨蝶呤给药I或3个周期，并每隔一天一周3次将IDll或13C4给药12周。每2周收集血清样品进行ELISA分析。
[0166]组织病理学和免疫组织化学
[0167]将心脏移植物在10%中性缓冲福尔马林中固定，沿着纵轴两分以暴露右和左心室和流出道，并常规加工以进行石蜡包埋。以5微米切出切片，并用苏木精和曙红(H&E)或马森(Masson)氏三色染色。还对连续切片免疫染色，如下文描述的。使用组织学分级方案对每个经H&E染色的切片定性评估异基因移植物排斥病理学的各种特征(例如血管炎、心肌变性和坏死、心肌炎)。
[0168]使用Bond-Max 自动化免疫染色系统(Leica Microsystems Inc., BuffaloGrove, IL)实施免疫组织化学。为了检测⑶3和Foxp3双重免疫阳性细胞，使用Bond聚合物精制检测试剂盒(Polymer Refine Detection kit)和Bond聚合物AP红色试剂盒(Leica, Buffalo Grove, IL)遵循制造商的指南将移植物组织切片用抗⑶3和抗Foxp3抗体进行双重免疫染色。简言之，将脱石蜡的石蜡包埋移植物切片进行热诱导的表位修复(于99 °C为25分钟)，与无血清蛋白质封闭剂(serum free protein block)(Dako, Carpentaria, CA)、家兔单克隆抗 Q)3 抗体(Lab Vision/Neo Marker)、缀合有过氧化物酶的聚合物、过氧化物酶封闭剂(peroxidase block)、和二氨基联苯检测试剂,接着是大鼠抗小鼠Foxp3抗体(eBioscience Inc., San Diego, CA)，然后是家兔抗大鼠抗体(Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) 一起温育。然后，将载玻片与 Bond 聚合物AP和混合的红色检测试剂一起温育，最终用苏木精复染色。在阴性对照载玻片中，分别用Chromepure 全家兔 IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)和大鼠 IgG2a(AbD Serotec, Raleigh, NC)替换抗 CD3 和抗 Foxp3—抗。
[0169]血清同种抗体水平
[0170]通过将以1:50稀释的来自经心脏移植的或正常的小鼠的血清与经SV40转化的C57BL/6成纤维细胞系(SVB6) —起温育，接着使用FITC家兔抗小鼠IgG(Dako, Carpinteria, CA)及通过流式细胞术分析检测成纤维细胞结合的抗体(同种抗体)来测定血清同种抗体水平。用血清染色的成纤维细胞的几何均值荧光强度除以经同种型对照染色的成纤维细胞以在实验间标准化同种抗体水平。特别地，血清抗体对同种成纤维细胞的结合是同种抗体， 因为相同血清样品不结合经SV40转化的BALB/c成纤维细胞系(SVBalb)(数据未显示)。
[0171]过继转移小鼠模型
[0172]C57BL/6小鼠获自Jackson Laboratories,并且在无特定病原体条件下收容。以20mg/kg对对照小鼠给予rhGAA的单次静脉内注射。在三次连续的每日0.5mg甲氨蝶呤腹膜内注射外，以20mg/kg对耐受化小鼠给予rhGAA的单次静脉内注射。在初始rhGAA注射后第6天从两个供体组收获脾，并加工成合并的单细胞悬浮液。将细胞清洗,并过滤流过0.22 μ M滤器。然后，使用StemCell Technologies RoboSep细胞分离系统对细胞富集B细胞，并重悬以容许200 μ I静脉内注射。耐受化的和非耐受化的接受者组经由静脉内注射接受较高的细胞IOxlO6或较低的细胞5χ106浓度。对对照组给予仅rhGAA，或rhGAA和甲氨蝶呤(单个周期的三次连续每日MTX注射)。所有组接受每周静脉内rhGAA20mg/kg注射，并每两周眶后取血16周，放入BD Vacutainer血清分离管。将血清取出，并在_20°C下贮存，直至用于ELISA。使用ELISA测定抗rhGAA抗体滴度，在SpectraMax M2上读出，并使用Softmax计算以推断滴度数值。将含有对照和滴度信息的原始数据Softmax文件和EXCEL扩展页存储在网络服务器上。使用GraphPad Prism软件产生所有图和统计学。
[0173]实施例1:响应抗体治疗剂生成抗药物抗体
[0174]多克隆抗体mATG结合多种免疫细胞类型，包括抗原呈递细胞。我们的数据显示了单个疗程的mATG (相隔三天给予的两剂25mg/kg，腹膜内施用)可以在小鼠中产生高达100，000的抗mATG IgG滴度(图1A)。在以连续每月注射(5mg/kg，每4周)给予时，抗mATG滴度进一步升高，滴度在5次每月注射后高达5xl06 (图1B)。对于单个疗程和每月注射两者，使用家兔IgG(rblgG)作为对照。 [0175]由于阿仑单抗不与鼠⑶52起交叉反应，必须在hu⑶52Tg小鼠(其中转基因表达样式与人中的⑶52表达相似)中完成用阿仑单抗的临床前研究。与mATG类似，阿仑单抗(0.5mg/kg)的静脉内施用在hu⑶52Tg小鼠中引发显著的ADA应答。这些应答在头四次处理中升高，然后降低，使得在第五剂阿仑单抗后，hu⑶52Tg小鼠不再生成抗阿仑单抗抗体(图2)。此非响应性提示了已经发生天然耐受性(Rosenberg等，Blood, 93 (6):2081-8 (1999))。
[0176]数据显示了 C57BL/6小鼠中针对mATG的ADA滴度和huCD52Tg CDl小鼠中针对阿仑单抗的ADA滴度较高(>100，000)。此高水平的免疫原性可以归因于mATG和阿仑单抗结合抗原呈递细胞的能力，由此增强抗原加工和呈递以诱导针对它们的免疫应答。
[0177]实施例2:甲氨蝶呤在单个周期施用的情况中控制抗mATG IgG应答
[0178]已经在Thymoglobulin?处理后报告了升高的抗体滴度，并且已经在用
Thymoglobul in?治疗的患者中描述了血清病、急性肾衰竭和心血管反应的病例报告(Boothpur 等，见上文；Lundquist 等，Liver Transpl, 13(5):647-50(2007);Busani等,Minerva Anestesiol, 72 (4): 243-8 (2006) ; Tanriover 等，Transplantation, 80 (2): 279-81(2005) ; Buchler 等，Clin Transplant, 17(6): 539-45 (2003))。为了测定甲氨蝶呤是否可以降低抗ATG应答，且如此减轻这些安全性忧虑，评估仅以单个周期给予的三天甲氨蝶呤方案作为控制小鼠中抗mATG IgG应答的手段。这与先前发表的方案的不同之处在于与在ERT的背景中给予的至少三个周期形成对比，仅与mATG —起施用单个周期的甲氨蝶呤。在比较效应曲线下面积时，在两次mATG施用(25mg/kg,相隔3天)的第一次开始，以5mg/kg腹膜内施用连续6天的甲氨蝶呤(Calbiochem产品目录编号#454125)可以在处理后至少8周里将抗mATG IgG应答抑制95% (图3)。
[0179]接着，评估以5mg/kg/注射5次每月注射mATG后甲氨蝶呤对抗mATG滴度的影响。实施mATG处理的每月注射，因为淋巴细胞再增殖在mATG处理后I个月几乎完成(Ruzek，见上文)。然后，在每月处理的20周里每周量化抗药物抗体应答。在此时段期间，尽管mATG消减⑶4+T细胞，抗体滴度达到高达500万(图1B)。令人感兴趣地，以与mATG相同的剂量水平和日程表接受非特异性家兔IgG的动物显示较低的抗家兔IgG应答(图1B)。一种关于增强的mATG免疫原性的可能性可以是mATG对抗原呈递细胞(APC)诸如滤泡树突细胞(其在存在补体的情况中时可以显著增强B细胞应答)的特异性结合。还评估两种甲氨蝶呤处理方案。在用酶替换疗法(ERT)的先前工作中，在头三剂酸性α-葡糖苷酶期间给予的三个周期的甲氨蝶呤在每周ERT剂量给药的至少8个月里提供抗体滴度的持续降低(Joseph等，Clin Exp Immunol, 152(1):138-46 (2008))。在mATG的背景中评估相似疗程的甲氨蝶呤，其中在mATG施用15分钟内及头三次每月mATG处理之每次后24和48个小时给予5mg/kg甲氨蝶呤。比较效应曲线下面积，此方案将抗mATG抗体应答从约400万的滴度成功降低至816，000的滴度，这产生79%降低(图4A)。
[0180]另外，评估仅5次每月mATG处理的第一次左右给予的单个疗程甲氨蝶呤对抗mATGIgG应答的影响，并与三周期方案直接比较。令人惊讶地，此单个周期方案比三周期方案甚至进一步降低抗mATG IgG滴度至约50，000的滴度(图4B)。比较效应曲线下面积,单个周期方案将抗mATG IgG滴度降低98%，而三周期方案将滴度降低69%(图4C)。单个周期对三周期方案的升高的效果提示提高甲氨蝶呤暴露可以实际上拮抗其耐受化效应，其可能通过杀死介导对抗体滴度的控制的细胞进行。
[0181]实施例3:甲氨蝶呤诱导免疫耐受性的活性机制[0182]如上文显示的，非常短暂疗程的甲氨蝶呤可以在多轮抗原攻击里显著控制抗体应答。在此背景中，短暂的周期是单个周期的甲氨蝶呤，其在测试数月的过程里(对抗体滴度和细胞因子两者)产生持久的影响。对抗体应答的此长时间控制提示了甲氨蝶呤可以成功诱导免疫耐受性。至此已经在连续5剂每月mATG的背景中评估了甲氨蝶呤。为了进一步评估是否已经活化免疫耐受性机制，从处理扣留最初接受5次每月mATG注射的动物达8周。在此休息期后，对动物给予最终的mATG注射。若采用免疫耐受性的机制，则抗mATG IgG滴度在第6次mATG处理后不应显著升高。
[0183]我们的数据显示了没有用甲氨蝶呤剂量给药的动物经历抗mATG IgG滴度的升高，如预期的(图5)。相反，在第一次mATG注射时仅接受一个周期的甲氨蝶呤的动物不生成显著较大的抗mATG IgG滴度(图5)。在用三个周期的甲氨蝶呤处理的动物中观察到类似的趋势，尽管效果不是一样显著的(图5)。在比较效应曲线下面积时，单个疗程的甲氨蝶呤将滴度降低99%，而三周期方案将滴度降低85%。这些数据指示甲氨蝶呤可以维持对回忆应答的控制，这提示了小鼠已经形成针对此抗原的耐受性。
[0184]虽然经甲氨蝶呤处理的动物在连续mATG处理的情况中生成升高的可测量滴度，但是总体上，经甲氨蝶呤处理的动物中的滴度水平比仅用mATG处理的动物中观察到的那些滴度水平一致地低100倍(图6)。较低的抗体滴度水平应当显著降低安全性风险和效力影响的潜力。虽然不希望受限于理论，但是这些数据提示已经导出控制的活性机制，其可以显著降低抗mATG IgG应答，并且在甲氨蝶呤处理后长期维持。
[0185]实施例4:单个周期的甲氨蝶呤可以显著控制抗阿仑单抗应答
[0186]在缓解-复发性多发性硬化中，在每年周期中剂量给药阿仑单抗，并且患者可以产生 ADA (Coles 等，N Engl J Med, 359 (17): 1786-801 (2008))。由于免疫原性和药动学测试在多项III期研究中正在进行，不清楚抗阿仑单抗抗体在患者子集中是否会影响暴露、效力、和/或安全性。如此，我们评估单个周期的甲氨蝶呤是否可以控制5个每月单次注射周期的阿仑单抗后的ADA滴度。对huCD52Tg小鼠每月静脉内给予阿仑单抗(0.5g/kg)达连续5个月。在第一剂每月阿仑单抗给药前15分钟及给药后24和48小时以0.5、I或5mg/kg给予甲氨蝶呤。lmg/kg甲氨蝶呤提供一些益处，因为它将抗阿仑单抗应答降低88% (图7A)。5mg/kg甲氨蝶呤将抗阿仑单抗IgG应答成功降低99%(图7A)。甲氨蝶呤表现为对天然耐受性没有影响。
[0187]第二项研究确认上述发现。如上文,用5剂每月0.5mg/kg阿仑单抗处理hu⑶52转基因小鼠。与第一次阿仑单抗施用结合，还用或不用3剂每日5mg/kg/天甲氨蝶呤处理小鼠(图7B)。贯穿整个研究收集血清样品以评估抗阿仑单抗滴度并确认耐受性。在第5剂每月给药后24小时时获得滴度数据。数据证明了甲氨蝶呤降低抗阿仑单抗抗体滴度(图7C)。
[0188]实施例5:甲氨蝶呤在临床相关阿仑单抗剂量给药方案的背景中可以控制抗阿仑单抗抗体应答
[0189]进行一系列实验以评估甲氨蝶呤是否可以成功控制huCD52Tg小鼠中在阿仑单抗的临床相关剂量给药方案的背景中的ADA。在临床中，以12mg/天的5次每日处理的初始周期剂量给药阿仑单抗。患者中初始处理周期后12个月，施用额外周期三剂每日12mg阿仑单抗。在第二个处理周期时，循环⑶19+B细胞的水平已经恢复到基线数值；然而，循环⑶4+T辅助细胞和⑶8+T细胞毒性细胞的水平尚未完全再生(Coles等，N Engl JMed, 359(17):1786-801(2008))。
[0190]最初，在hu⑶52Tg小鼠中调查5次阿仑单抗每日处理后循环T和B细胞子集的消减和再生动力学。在经由静脉内注射以0.5mg/kg (等同于12mg/kg人剂量)用阿仑单抗连续5天处理的hu⑶52Tg小鼠的外周血中，总⑶3+T细胞、⑶4+T辅助细胞、和⑶8+T细胞毒性细胞在处理后4周没有恢复到处理前水平，而⑶19+B细胞数目回到对照水平(图8A-D) 。
[0191]为了模拟再次处理时患者经历的细胞环境，在第一个周期后4和5周之间在hu⑶52Tg小鼠中再施用阿仑单抗。由于阿仑单抗的初始疗程是5天周期，在每次每日阿仑单抗处理前15分钟施用甲氨蝶呤，然后施用2天。此方案中给予的甲氨蝶呤的最大累积循环剂量是14mg/kg(2mg/kg/天)，其非常类似于在以5mg/kg/天的三天疗程给予甲氨蝶呤时15mg/kg的积累剂量。我们评估2、I和0.5mg/kg/天甲氨蝶呤施用在三个阿仑单抗处理周期里对抗阿仑单抗抗体的影响。在lmg/kg，甲氨蝶呤表现为控制测试的8只小鼠之7只中的滴度，并且总体上将滴度降低79%(图9B)。在2mg/kg，在比较效应曲线下面积时，甲氨蝶呤将ADA成功降低98% (图9A)。
[0192]实施例6:甲氨蝶呤可以改善mATG的药动学和药效学
[0193]ADA可以干扰蛋白质治疗剂的药动学和药效学。我们评估了抗mATGIgG ADA应答是否干扰mATG药动学。用单独的mATG或与单个周期的甲氨蝶呤一起的mATG的每月注射处理小鼠5个月。以5mg/kg每日施用甲氨蝶呤达三剂。在第I个月、第3个月、和第5个月后的多个时间点时对血液取样以测定循环mATG的水平(图10)。
[0194]在第I个月时，循环mATG的水平在两个处理组间是相似的，但是在第3个月和第5个月时，仅经甲氨蝶呤处理的组具有可测量的循环mATG水平。在不施用甲氨蝶呤的情况中，第三和第五剂mATG后测量的mATG水平显著低于第一剂后测量的那些水平(图10)。先前的研究已经显示了甲氨蝶呤显著降低抗mATG IgG应答。如此，表现为针对mATG的抗体干扰mATG暴露和药动学。
[0195]由于针对mATG的抗体表现为在重复剂量给药后显著降低循环mATG的水平，可以预期在再次剂量给药时mATG的药效学也受到负面影响。在第五次每月mATG处理(此时滴度为其最高)时评估血液、脾和淋巴结中的淋巴细胞消减。如上文描述的，对用甲氨蝶呤处理的动物给予单个周期的处理。
[0196]循环⑶4+和⑶8+T细胞的水平在用mATG而非甲氨蝶呤处理的动物中在第五次mATG处理后不变。然而，在用mATG和一个周期的甲氨蝶呤处理的动物中，循环⑶4+和⑶8+T细胞是显著消减的(图11)。在脾和淋巴结中也类似地观察到此效果。甲氨蝶呤处理增强mATG增加脾和血液中T调节细胞的百分比的能力(图12A-B)。在血液和淋巴结中观察到类似的效果。已经假定mATG和Thymoglobulin?处理后增强的T调节细胞存在促成此治疗剂的效力(Ruzek等，Blood, 111 (3): 1726-34 (2008))。甲氨蝶呤在连续疗程的mATG后帮助维持此效应的能力是显著降低抗体抗家兔IgG滴度的潜在添加益处。
[0197]至此，药动学和效力研究提示了抗mATG抗体干扰mATG的暴露和效力。抗mATG IgG滴度和mATG暴露之间的直接比较揭示了在终点滴度大于10，000时，循环mATG的水平显著降低(图13a)。然而，在抗mATG IgG滴度大于100,000时，mATG介导的细胞消减受到抑制(图13b和13c)。滴度和细胞消减之间的R2关联>0.7。
[0198]实施例7:甲氨蝶呤可以改善阿仑单抗的药效学
[0199]甲氨蝶呤不仅增强mATG的药效学，而且在抗阿仑单抗应答表现为中和一些消减活性时还恢复阿仑单抗介导的对循环T和B细胞的消减。在此实施例中描述的研究中，在有和无甲氨蝶呤的情况中对huCD52Tg小鼠给予5次每月静脉内阿仑单抗注射。对于6个月研究的头三天，每日施用5mg/kg甲氨蝶呤。在第五剂前2天和第五剂阿仑单抗后I天从两个处理组的动物收获血液。通过流式细胞术评估细胞群体,如实施例6中描述的。
[0200]我们的数据显示了第五剂每月阿仑单抗表现为不再消减T细胞，因为循环T细胞的绝对数目在处理之前和之后似乎是相似的(图14 (每个时间点代表不同组的动物))。相反，甲氨蝶呤表现为已经恢复阿仑单抗消减T细胞的能力(P=0.012)。在阿仑单抗剂量给药前2天或后I天比较仅用阿仑单抗处理的动物和用阿仑单抗和甲氨蝶呤两者处理的动物中的循环T细胞的绝对数目时，循环T细胞的数目在经甲氨蝶呤处理的动物中显著更低(P=0.034和0.02;图14)。类似地，甲氨蝶呤处理似乎增强阿仑单抗对B细胞的消减(分别为P=L 2xl0_5，P=0.02)， 并且循环B细胞的数目在经甲氨蝶呤处理的动物中在处理后I天进一步减少(图14)。
[0201]实施例8:单个周期的甲氨蝶呤可以显著控制抗rhGAA抗体应答
[0202]我们还研究了甲氨蝶呤在rhGAA酶替换疗法中的效果。在此研究中，将动物每周注射rhGAA达连续12天,然后休息4周,然后在第16周时用rhGAA再攻击。还对动物给予第I周时单个周期的连续三剂每日5mg/kg甲氨蝶呤，或者在第I周、第2周和第3周之每周给予一个周期(总共三个周期)。在第O周(任何处理前)、第6周、第8周、第12周、第16周、第18周、和第20周时在动物中测量rhGAA特异性IgG滴度。我们的数据显示了单个周期的甲氨蝶呤与三周期方案一样好地控制至少20周里的抗rhGAA应答(图15)。
[0203]还已经在T细胞缺陷型Nu/Nu小鼠中进行研究以评估T细胞在产生抗rhGAA滴度中的作用。在这些实验中，我们已经重复观察到在这些T细胞缺陷型小鼠中很少至不形成针对rhGAA的ADA(图37A-B)。这些数据支持如下的观念，即T细胞促成抗rhGAA滴度。如此，由于甲氨蝶呤可以控制针对rhGAA的ADA，它也可能影响针对rhGAA的T细胞应答。
[0204]实施例9:甲氨蝶呤增强mATG介导的心脏异基因移植物存活
[0205]在评估甲氨蝶呤是否可以增强mATG在正常小鼠中的效力外，我们还调查了在移植背景中是否可以通过甲氨蝶呤提升mATG功能。由于Thymoglobulin?在临床上用作诱
导疗法以延长移植物存活，我们评估甲氨蝶呤的添加是否可以提升鼠异基因心脏移植物模型中mATG的效力。在第O天和第4天施用20mg/kg mATG,而在第0_6天以单个周期处理施用2mg/kg甲氨蝶呤。[0206]另外，我们调查了在相同方案下或在连续12天的延长方案的情况中给予的低4倍剂量的甲氨蝶呤(0.5mg/kg)。各组小鼠接受无处理(盐水对照)、单独的mATG、或mATG和甲氨蝶呤组合方案。与正常小鼠中的研究相似，与mATG共施用的甲氨蝶呤降低针对mATG的抗药物抗体滴度，不管使用的方案如何(图16A和表1)。此外，与抗体滴度降低一致的是此移植物背景中观察到的mATG暴露延长(图16)。鉴于针对移植的组织的有力的、一致的免疫应答的条件下可能的辅助效应，抗药物抗体滴度甚至比在正常小鼠背景中更快升高，并且导致第一次mATG施用的7天内几乎检测不到的mATG水平(图16B)。相反，到移植后7天，抗家兔IgG抗体滴度在用甲氨蝶呤处理的小鼠中显著较低，并且循环mATG水平在那些小鼠中显著较高。这强调在正在进行的炎性应答的条件下，抗药物抗体应答可以被加速，并且可能对药效学和效力具有甚至更大的影响。重要地，即使在这些条件下，甲氨蝶呤对mATG抗药物抗体具有深远的抑制影响，并且增强mATG暴露。然而，由于循环mATG水平在mATG和甲氨蝶呤组合处理的情况中到21天仍然低得检测不到，鉴于>100天移植物存活，别的耐受性机制可能发挥作用。这些结果证明了 mATG和甲氨蝶呤处理之间对同种移植物存活的明显协同作用，并且显示了类似水平的mATG抗药物抗体降低和mATG暴露增强，如在正常小鼠中观察到的。
[0207]表1:甲氨蝶呤方案降低心脏异基因移植物移植小鼠中的抗mATG抗体滴度
[0208]
【权利要求】
1.一种在需要用治疗剂治疗的受试者中诱导免疫耐受性的方法，其包括在单个周期中对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中诱导针对所述治疗剂的免疫耐受性。
2.一种在需要用治疗剂治疗的受试者中抑制针对蛋白质治疗剂的抗体应答的方法，其包括在单个周期中对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中抑制针对所述治疗剂的抗体应答。
3.一种在需要用治疗剂治疗的受试者中减轻针对治疗剂的输注反应的方法，其包括对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中减轻针对蛋白质治疗剂的输注反应。
4.一种在需要用治疗剂治疗的自身免疫受试者中降低继发性自身免疫的方法，其包括对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中降低继发性自身免疫。
5.一种在需要用治疗剂治疗的受试者中提高治疗剂的效力的方法，其包括对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中提高所述蛋白质治疗剂的效力。
6.一种在需要用治疗剂治疗的受试者中增加T细胞群体中T调节细胞百分比的方法，其包括对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此增加所述受试者中的所述百分比。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中所述治疗剂是蛋白质治疗剂。
8.一种在需要用抗体治疗剂治疗的受试者中增加B细胞群体中B调节细胞百分比的方法，其包括对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此增加所述受试者中的所述百分比。
9.权利要求3-8中任一项的方法，其中在单个周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。
10.一种延长治疗剂在受试者中的药动学的方法，其包括在施用所述治疗剂之前或期间或之后以有效延长所述治疗剂的药动学的量对所述受试者施用甲氨蝶呤。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述受试者是人。
12.权利要求1-10中任一项的方法，其中所述治疗剂是抗体治疗剂。
13.权利要求12的方法，其中所述抗体治疗剂是单克隆抗体治疗剂。
14.权利要求12或13中任一项的方法，其中所述抗体治疗剂是淋巴细胞消减剂。
15.权利要求14的方法,其中所述抗体治疗剂是阿仑单抗(alemtuzumab)。
16.权利要求15的方法，其中所述受试者是多发性硬化患者。
17.权利要求12的方法，其中所述抗体治疗剂是多克隆抗体治疗剂。
18.权利要求17的方法，其中所述抗体治疗剂是多克隆家兔抗胸腺细胞球蛋白抗体。
19.权利要求18的方法，其中所述受试者是需要器官移植，具有再生障碍性贫血，和/或具有或有风险具有移植物抗宿主病的人患者。
20.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述治疗剂是酶。
21.权利要求21的方法，其中所述酶是人α-半乳糖苷酶A。
22.权利要求22的方法，其中所述酶是人酸性α-葡糖苷酶。
23.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述有效量是0.lmg/kg至5mg/kg。
24.权利要求1-22中任一项的方法，其中所述单个周期的甲氨蝶呤由甲氨蝶呤施用I天或甲氨蝶呤施用连续2、3、4、5、6、7、8、9、10、或11天组成。
25.权利要求1-22中任一项的方法，其中在治疗性处理开始之前48小时和之后48小时之间施用所述单个周期的甲氨蝶呤。
26.一种在有此需要的人患者中消减淋巴细胞的方法，其包括: 用淋巴细胞消减剂治疗所述患者，并 在用所述淋巴细胞消减剂治疗之前或期间或之后以有效诱导所述患者中针对所述淋巴细胞消减剂的免疫耐受性的量对所述患者施用甲氨蝶呤。
27.权利要求26的方法，其中在单个周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。
28.权利要求26或27中任一项的方法，其中所述淋巴细胞消减剂是单克隆抗体治疗剂。
29.权利要求26或27中任一项的方法，其中所述淋巴细胞消减剂是多克隆抗体治疗剂。
30.权利要求28的方法，其中所述单克隆抗体治疗剂是阿仑单抗。
31.权利要求28的方法,其中所述单克隆抗体治疗剂是利妥昔单抗(rituximab)。
32.权利要求26-31中任一项的方法，其中所述患者是多发性硬化患者。
33.权利要求32的方法，其中所述患者具有缓解-复发性多发性硬化。
34.权利要求29的方法，其中所述多克隆抗体治疗剂是抗胸腺细胞球蛋白多克隆抗体。
35.一种在需要组织移植的受试者中诱导免疫耐受性的方法，其包括对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中诱导针对移植的组织的免疫耐受性。
36.权利要求35的方法，其中在单个周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。
37.权利要求35或36中任一项的方法，其中所述移植的组织是肾组织或心脏组织。
38.权利要求37的方法，其中所述受试者还接受另一种用于免疫调控的药剂。
39.权利要求38的方法，其中所述用于免疫调控的药剂是免疫抑制剂。
40.权利要求38的方法，其中所述用于免疫调控的药剂是多克隆抗胸腺细胞球蛋白抗体。
41.一种在需要治疗剂或组织移植的受试者中抑制T细胞应答的方法，其包括在用所述治疗剂或组织移植治疗所述受试者之前、同时、或之后对所述受试者施用有效量的甲氨蝶呤，由此在所述受试者中抑制T细胞应答。
42.权利要求41的方法，其中在单个周期中施用所述有效量的甲氨蝶呤。
43.权利要求41或42中任一项的方法，其中所述治疗剂是蛋白质治疗剂。
44.权利要求43的方法，其中所述蛋白质治疗剂是抗体治疗剂。
45.权利要求44的方法，其中所述抗体治疗剂是单克隆抗体治疗剂。
46.权利要求44或45中任一项的方法，其中所述抗体治疗剂是淋巴细胞消减剂。
47.权利要求46的方法，其中所述抗体治疗剂是阿仑单抗。
48.权利要求47的方 法，其中所述受试者是多发性硬化患者。
49.权利要求44的方法，其中所述抗体治疗剂是多克隆抗体治疗剂。
50.权利要求49的方法，其中所述多克隆抗体治疗剂是多克隆家兔抗胸腺细胞球蛋白抗体。
51.权利要求43的方法，其中所述移植的组织是肾组织或心脏组织。
52.权利要求51的方法，其中所述受试者还接受另一种用于免疫调控的药剂。
53.权利要求52的方法，其中所述用于免疫调控的药剂是免疫抑制剂。
【文档编号】A61K31/519GK103648501SQ201280035299
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2012年5月3日 优先权日:2011年5月16日
【发明者】A.乔瑟夫, S.理查兹, M.鲁泽克, R.加曼 申请人:建新公司