用于体内核酸递送的聚(丙烯酸酯)聚合物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及膜活性的聚(丙烯酸酯)聚合物，和用于体内递送RNA干扰(RNAi)多核苷酸至细胞的组合物。将RNAi多核苷酸与所述聚(丙烯酸酯)聚合物偶联，并且所述聚合物经可逆修饰以能够进行体内靶向递送。所述聚(丙烯酸酯)的膜活性将所述RNAi多核苷酸从所述细胞外移动至所述细胞内。可逆修饰提供生理应答性。
【专利说明】用于体内核酸递送的聚(丙烯酸酯)聚合物
【背景技术】
[0001]将多核苷酸和其它基本不能穿透细胞膜的化合物递送到活细胞受到细胞复杂膜系统的高度限制。反义、RNAi和基因治疗中使用的药物是相对高亲水性的聚合物，且通常带较高负电荷。这些物理特征均阻止其直接扩散穿过细胞膜。出于该原因，多核苷酸递送的主要障碍是将多核苷酸递送穿过细胞膜到达细胞质或细胞核。
[0002]一种已经用于体内递送小核酸的方法是使所述核酸与小靶向分子或脂质或固醇结合。虽然已在这些偶联物中观察到一些递送和活性，但是就实际应用而言，这些方法需要的核酸剂量非常大。
[0003]已开发多种转染试剂，其能实现在体外将多核苷酸相当有效地递送至细胞。然而，采用这些相同转染试剂在体内递送多核苷酸很复杂，并且由于体内毒性、血清相互作用和弱靶向而变得无效。体外作用良好的转染试剂，阳离子聚合物和脂质，通常形成大的静电颗粒并使细胞膜失稳。体外转染试剂的正电荷有助于通过电荷之间(静电)的相互作用与核酸结合，因此形成核酸/转染试剂复合物。正电荷也有利于载剂与细胞非特异性结合以及膜融合、去稳定化或破坏。膜的去稳定化有利于递送基本不能渗透细胞膜的多核苷酸穿过细胞膜。虽然这些特性有利于核酸体外转移，但它们会造成体内毒性和靶向失效。阳离子电荷导致与血清组分相互作用，这造成多核苷酸转染试剂相互作用的不稳定和较低的生物利用度和靶向。在体外能够有效的转染试剂的膜活性在体内常导致毒性。
[0004]就体内递送而言， 所述载剂(核酸和相关联的递送剂)应较小，直径小于lOOnm，且优选低于50nm。甚至更小的复合物(小于20nm或小于IOnm)会更加有用。大于IOOnm的递送载剂在体内很难到达血管细胞之外的细胞。由静电相互作用形成的复合物在暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或瓦解。此外，体内递送载剂上的阳离子电荷导致不良血清相互作用并因此导致生物利用度差。有趣的是，高的负电荷还可通过干扰靶向所需的相互作用来抑制体内递送。因此，体内分布和靶向需要接近中性的载剂。若不细致调控，膜的破坏或失稳活性在体内利用时有毒。采用核酸递送平衡载剂毒性在体外比在体内更容易实现。
[0005]Rozema等在美国专利公开20040162260示范了一种通过将伯胺可逆转化成羧基基团对(2-丙酸-3-甲基马来酸酐的β羧基和Y羧基)来可逆调节膜活性多胺的膜干扰活性的方法。Rozema等(Bioconjugate Chem.2003，14，51-57)报道了 β羧基不变现完全明显的负电荷且其自身不能抑制膜活性。经报道，就有效膜活性抑制而言，添加Y羧基基团是必需的。然而，因为所述载剂带有较高负电荷，且核酸和经修饰的聚合物都具有高负电荷密度，所以就体内递送而言，该系统无效。
[0006]通过用中性亲水靶向基团(半乳糖)和位阻稳定基团(PEG)替代2-丙酸-3-甲基马来酸酐的Y羧基，Rozema等能够保留全部水溶性和膜活性的可逆抑制，同时加入有效的的体内肝实质细胞靶向(美国专利公开20080152661)。
[0007]我们在此描述新型膜活性聚合物，以及用所述聚合物制备的组合物，其用于在体内将核酸递送至细胞。这些新型聚合物具有优于前述那些的改进的治疗潜力。
【发明内容】
[0008]在一个优选实施方式中，本发明的特征在于两亲性阳离子聚(乙烯基酯)无规共聚物，所述两亲性阳离子聚(丙烯酸酯)无规共聚物特别适合用于在体内递送多核苷酸至细胞。本发明的两亲性阳离子聚(丙烯酸酯)无规共聚物包含多种含胺丙烯酸酯单体和多种第一疏水性丙烯酸酯单体。所述含胺单体包含伯胺侧基。所述疏水性单体包含具有2~20个碳原子的疏水性侧基，所述疏水性侧基选自下组:经基、烷基、烯基、炔基、烷氧基烷基、芳香基和芳基。所述聚合物还可包含多种第二含胺丙烯酸酯单体或多种第二疏水性丙烯酸酯单体。第二含胺丙烯酸酯单体包含胺侧基，所述胺侧基选自下组:伯胺、仲胺、叔胺、季胺、经保护的胺、氮杂环、醛亚胺、酰肼、腙和咪唑。本发明的聚(丙烯酸酯)无规共聚物除了是两亲性的以外，还具有膜活性。优选的聚(丙烯酸酯)无规共聚物包含含伯胺单体和丙烯酸烷基酯单体。
[0009]本发明的聚(丙烯酸酯)无规共聚物可由两种、三种或四种不同单体合成。单体可选自下列:受保护的丙烯酸胺酯(amine acrylate)、咪唑丙烯酸酯、丙烯酸烷基酯、丙烯酸烯基酯、丙烯酸炔基酯、芳族丙烯酸酯和芳基丙烯酸酯。经保护的丙烯酸胺酯单体包括但不限于:叔丁氧基羰基(Boc)保护的含胺丙烯酸酯。经保护的伯胺单体用丙烯酸烷基酯单体共聚合。然后，在聚合反应之后去除所述胺保护基团以形成水溶性、两亲性的无规共聚物。脂族疏水性基团可以是线性、分支或环状的，并且可包含一个或多个杂原子取代。
[0010]在一个优选实施方式中，聚(丙烯酸酯)无规共聚物通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)聚合来合成。在一个实施方式中，所述RAFT聚合反应采用丙二酸N，N-二苯基二硫代氨基甲酸酯(MDP-DTC)进行。采用RAFT聚合，并可任选地分馏，可使聚合物的多分散性小于1.5,或更优选地小于1.4或1.3。
[0011]就体内递送多核苷酸至细胞而言，所述两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物经可逆修饰。可逆修饰包括使如本文定义的多种掩蔽剂通过多个可逆生理学不稳定共价键结合聚合物伯胺。可逆生理学不稳定共价键可选自下组:pH不稳定键与酶可切割键。如本文所用，可逆修饰指在连接所述掩蔽剂和所述聚合物的生理学不稳定共价键被切割后，聚合物伯胺恢复。在一个优选实施方式中，通过掩蔽剂的可逆结合来修饰多于50%、多于60%、多于70%、多于80%或多于90%的聚合物伯胺。掩蔽剂可选自下组:位阻稳定剂和靶向基团。所述掩蔽剂改善体内生物分散性或所述聚合物的靶向或聚合物-多核苷酸偶联物。掩蔽剂可抑制所述聚合物与血清成分或非靶细胞的非特异性相互作用。掩蔽剂可降低所述聚合物或聚合物-多核苷酸偶联物的聚集。包含靶向基团的掩蔽剂通过将所述偶联系统靶向至细胞表面受体来增强细胞特异性靶向或细胞内化。可在所述聚合物与多核苷酸偶联之前或之后使所述掩蔽剂与所述聚合物偶联。
[0012]在另一个优选实施方式中，多核苷酸通过第二生理学不稳定共价键与本发明的聚合物连接。一种或多种多核苷酸可通过所述第二生理学不稳定共价键连接所述聚合物。第一不稳定键(连接掩蔽剂和聚合物的不稳定键)和第二不稳定键(连接多核苷酸和聚合物的不稳定键)可在相同或相似的条件下被切割，或者其可在不同的条件下被切割，即，其可以是正交不稳定键。所述多核苷酸可选自下组:DNA、RNA、阻断性多核苷酸、寡核苷酸、RNA干扰多核苷酸、siRNA、微小RNA、mRNA和shRNA。第二生理学不稳定共价键可选自下组:pH不稳定键、酶可切割键、二硫键和核酸酯键。
[0013]在一个优选的实施方式中，描述一种组合物，所述组合物包括:两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其与a) —个或多个靶向基团和或位阻稳定剂通过可逆生理学不稳定共价键共价连接JPb) —个或多个多核苷酸通过正交第二生理学不稳定共价键共价连接。给予哺乳动物药学上可接受的运载体或稀释剂内的所述多核苷酸-聚合物偶联物。
[0014]在一个优选实施方式中，描述了用于将膜可穿透性分子递送至细胞并在所述细胞内释放所述分子的聚合物偶联系统。所述聚合物偶联系统包含与本发明的经可逆修饰的聚(丙烯酸酯)可逆连接的膜可穿透性分子。优选的膜可穿透分子包括多核苷酸。优选的多核苷酸包括RNA干扰多核苷酸。优选的RNA干扰多核苷酸包括siRNA或miRNA。给予哺乳动物药学上可接受的运载体或稀释剂内的所述聚合物或多核苷酸-聚合物偶联物。
[0015]在另一个优选实施方式中，本发明的特点是用于体内递送RNA干扰多核苷酸至肝脏细胞的组合物，所述组合物包括:两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其与一种或多种靶向基团和/或位阻稳定剂通过可逆生理学不稳定共价键共价连接，并且与和多核苷酸靶向基团偶联的RNA干扰多核苷酸(多核苷酸偶联物)共价连接。优选的多核苷酸靶向基团是含有至少20个碳原子的疏水基团。另一个优选的多核苷酸靶向基团是三价半乳糖胺。分别合成所述聚(丙烯酸酯)和所述多核苷酸-偶联物，并且可在分开的容器或单个容器中提供。在该组合物中，所述多核苷酸不与所述聚合物偶联。给予哺乳动物药学上可接受的运载体或稀释剂内的经修饰的聚合物和多核苷酸-偶联物。在一个实施方式中，所述递送聚合物和RNAi多核苷酸偶联物在给予所述哺乳动物前可在溶液中合并。在另一实施方式中，所述递送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶联物可在单独的溶液中共给予所述哺乳动物。在另一实施方式中，所述递送聚合物和所述RNAi多核苷酸偶联物可依次给予所述哺乳动物。对于依次给予，所述递送聚合物可在给予所述RNAi多核苷酸偶联物之前给予。或者，对于依次给予，所述RNAi多核苷酸偶联物可在给予所述递送聚合物之前给予。
[0016]在另一个实施方式中，所述两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物适合用于体外递送多核苷酸至哺乳动物细胞。就体外细胞递送而言，所述两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物可如上所述经可逆修饰，或不经可逆修饰使用。其还可与脂质或其它聚合物结合。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]图1.显示膜活性两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物的结构的图示，其中:
[0018]N是具有-NH2形式的伯胺，
[0019]N’是具有-NR5H' -NR5R6或-NR5R6R7形式(其中R5、R6和R7独立地选自-CH3和-CH2-CH3)的仲胺、叔胺或季胺，或者N'可以是氮杂环、醛亚胺、酰肼、腙或咪唑，
[0020]Y和Y’是接头基团，
[0021]R和R’是独立地具有2~20个碳原子的疏水基团或烷氧基烷基基团，
[0022]Rl、R2、R3和R4独立地选自氢(-H)和甲基(-CH3)，
[0023]m和P是大于零(O)的整数，
[0024]n和q是大于或等于零(O)的整数，且
[0025](m+n) / (p+q)的比例是 0.67 ~9 (40 ~90% 的胺)。
[0026]图2.显示本发明的两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物的RAFT聚合的一般反应方案的图示，其中Y、Rl、R2、R、m和η如图1中定义。
[0027]图3.显示聚合物的胺去保护的一般反应方案的图示，其中Y、Rl、R2、R、m和η如图1中定义。图4.显示不同示例性合适的RAFT试剂结构的图示。
[0028]图5.显示胺保护的聚合物LAU41648-140-B-frl的RAFT聚合的一般反应方案的图示。图6.显示胺保护的聚合物LAU42101-23-D-frl的RAFT聚合的一般反应方案的图示。
[0029]图7.显示胺保护的聚合物NAR42020-117A-frl的RAFT聚合的一般反应方案的图
/Jn ο
[0030]图8.显示胺保护的聚合物NAR41439-141B-frl的RAFT聚合的一般反应方案的图
/Jn ο
[0031]图9.显示胺保护的聚合物NAR41439-71B-frl的RAFT聚合的一般反应方案的图
/Jn ο
[0032]图10.显示不同示例性二肽掩蔽剂结构的图示。图11.表格显示在递送500ng/mL AhalsiRNA和3.0或1.5 μ g/ml乙氨基丙烯酸酯+甲基丙烯酸丁酯(EAA-BuMA)共聚物之后，不同细胞类型中的Ahal基因体外敲减百分比。图12.表格显示在递送500ng/mLAhalsiRNA和3.0或1.5 μ g/ml乙氧基乙氨基丙烯酸酯+丙烯酸仲丁酯(EEAA-SecBuA)共聚物之后，不同细胞类型中的Ahal基因体外敲减百分比。
[0033]图13.表格显`示在递送500ng/mL AhalsiRNA和3.0或1.5 μ g/ml乙氧基乙氨基丙烯酸酯+丙烯酸丁酯(EEAA-BuA)共聚物之后，不同细胞类型中的Ahal基因体外敲减百分比。
[0034]图14.表格列出本发明的两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物及其组合物。
[0035]图15.表格示出给予偶联了 siRNA的本发明掩蔽聚(丙烯酸酯)聚合物之后靶基因体外表达的敲减百分比。
[0036]图16.表格示出共给予本发明的掩蔽的聚(丙烯酸酯)聚合物和胆固醇-siRNA之后的靶基因体内表达的敲减百分比。
【具体实施方式】
[0037]本发明涉及用于递送生物活性物质(例如核酸、肽和蛋白质)的两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物及其偶联系统。将核酸和其它基本不能穿透细胞膜的化合物递送到活细胞受到细胞复杂膜系统的限制。就体内递送而言，所述两亲性聚(丙烯酸酯)无规共聚物经掩蔽剂通过生理学不稳定连接共价结合来可逆修饰。
[0038]在一个实施方式中，本发明涉及式(I)的膜活性聚(丙烯酸酯)无规共聚物:
[0039]
【权利要求】
1.一种聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其具有如下结构:
2.如权利要求1所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，Rl是氢。
3.如权利要求2所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，Y是-(CH2)a-,其中a是2、3或4。
4.如权利要求2所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，Y是 _CH2_CH2_0_ (CH2) 2_。
5.如权利要求2所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，R选自下组:
-(CH2)k-CH3,其中 k 是 1、2 或 3，
-CH(CH3) -CH2-CH3,和
-(CH2) !-O-CH2-CH3，其中 I 是 2、3 或 4。
6.如权利要求5所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其中R是-CH2-CH2-0-CH2-CH3。
7.如权利要求2所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，η是零。
8.如权利要求7所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，q是零。
9.如权利要求2所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，R3是氢。
10.如权利要求9所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，(m+n)/(p+q)是I~.1.86。
11.如权利要求2所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，R3是甲基。
12.如权利要求9所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，(m+n)/(p+q)是.1.86 ~3。
13.如权利要求1所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于:
Y是-(CH2-CH2-O) -CH2-CH2-,
R 是-CH2-CH2-CH3, Rl是氢， R3是甲基，η和q都是零，且m/p是2.2~3。
14.如权利要求1所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于:
Y是-(CH2-CH2-O) -CH2-CH2-,
R 是-CH2-CH2-CH3, Rl和R3都是氢， η和q都 是零， 且m/p是I~1.86。
15.如权利要求1所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于:
Y是-(CH2-CH2-O) -CH2-CH2-,
R 是-CH2-CH2-CH2-CH3, Rl和R3都是氢， η和q都是零， 且m/p是I~1.86。
16.如权利要求1所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，所述聚合物与RNA干扰多核苷酸偶联。
17.如权利要求1所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物，其特征在于，大于50%的N通过与双取代的马来酸酐掩蔽剂、二肽-酰胺基苄基-碳酸酯掩蔽剂或双取代的马来酸酐掩蔽剂和二肽-酰胺基苄基-碳酸酯掩蔽剂的组合反应来可逆修饰。
18.一种用于抑制体内基因表达的组合物，所述组合物包含药学上可接受的运载体内的如权利要求17所述的聚(丙烯酸酯)无规共聚物和RNA干扰多核苷酸。
19.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述RNA干扰多核苷酸与所述聚(丙烯酸酯)无规共聚物共价连接。
20.如权利要求18所述的组合物，其特征在于，所述RNA干扰多核苷酸与含有至少20个碳原子的疏水基团偶联。
【文档编号】A61K31/785GK103764153SQ201280041457
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年8月23日 优先权日:2012年4月18日
【发明者】D·H·维基菲尔德, N·罗西, D·B·罗泽玛, L·埃尔米达, A·L·佩雷拉-尼古拉斯 申请人:箭头研究公司