以磷脂酰丝氨酸为靶点的⁹⁹Tc^m-Cys-AnnexinV标记化合物及其标记技术和应用的制作方法

专利名称：以磷脂酰丝氨酸为靶点的⁹⁹Tc^m-Cys-AnnexinV标记化合物及其标记技术和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于放射性核素标记技术领域,具体涉及一种99Tcm-Cys-AnnexinV标记化合物及其标记技术和作为显像剂在急性心肌损伤、肿瘤疗效评价以及急性血栓探测方面的应用。
背景技术：
细胞凋亡(apoptosis)是一种高度保守的细胞程序性死亡(P⑶)，在诸多生理和病理过程中起着重要的作用。过 度凋亡会使组织功能丧失，如急性心肌梗死、慢性心力衰竭、移植排斥反应、中风、神经系统变性疾病等。相反，系统性红斑狼疮及类风湿关节炎以凋亡不充分为特征，使免疫细胞大量存活而不恰当地杀死和破坏正常组织，使组织脏器功能受损。凋亡抑制导致细胞过度增殖和肿瘤形成，许多化疗药物多是通过诱导凋亡来实现治疗目的的。但目前常规的细胞凋亡检测方法还不能满足基础研究和临床实践的需要，已有的实验室检测手段只能从细胞形态学和生化改变方面进行体外的定性和定量分析，如电镜观察、流式细胞分析、DNA降解条带分析和相关蛋白表达水平检测等。在活体条件下观察细胞凋亡范围、时相和发展速度等，一直是研究的一大难题。特别是在心血管系统疾病的研究中，活体标本采集尤为困难，因此活体显像显得更为必要。近年来，国内外已开展有关细胞凋亡放射性核素显像的研究，研究的关键是合成能与凋亡细胞特异结合的显像剂，且物理化学特性适于放射性核素标记，并具有血液清除快，靶器官显像清晰等特点。放射性核素标记磷脂结合蛋白V (Annexin V)是目前最受关注的细胞凋亡显像剂之一。Annexin V是一种人体内源性蛋白，属于Ca2+依赖性磷脂结合蛋白家族，最早是从胎盘中分离出来，具有一些抗凝固及抗炎的作用，曾被作为一种抗凝剂研究。染色体定位分析显示，Annexin V是由位于人的第4条染色体4q26_q28上的Annexin V基因编码,含有319个氨基酸，包括个70-80氨基酸重复单元，分子量约为35kD。研究证实，Annexin V能与凋亡细胞表面的磷脂酰丝氨酸(PS)特异性结合，正常细胞的PS位于细胞膜内层，凋亡时表达在细胞膜外层，是细胞凋亡的特征性标志，Annexin V与PS的亲和力高达10_9mol/L。Annexin V类显像剂的合成关键是放射性核素的标记，既要获得较高的放射化学纯度，同时又不能损伤Annexin V的结合活性。目前研究最成功的是99Tcm标记的Annexin
V(99Tcm-Annexin V)。99Tcm具有优良的物理性质，且获取容易，价格低廉。目前采用99Tcni标记Annexin V有多种方式1.双功能鳌合剂法。使用双功能鳌合剂法选择连接剂非常重要，既要保证与99Tcm有很高的配位能力，又要保证不改变其原有生物活性。常用的有二硫二氮(N2S2)、乙二胺半胱氨酸(EC)、BTAP等，其中以肼基烟酰胺(Hynic)最为多见。目前，多数临床前研究采用Hynic为螯合剂进行99Tcm标记Annexin V,得到的99Tcm-Hynic-Annexin V比活度较高,放射性化学纯度大于90%，并且已经在凋亡动物模型中获得良好的评估，被认为是监控肿瘤治疗疗效潜在的有效的放射性药物。但双功能鳌合剂法过程比较复杂，对技术条件要求严格，制备成本闻。2.直接还原标记法
直接还原标记法相对于双功能鳌合剂法更为简便、理想，以往的研究认为以SnCl2为还原齐U、中性PH条件下，可得到标记率高(>95%)、稳定性好(>10h)的99Tcm-AnnexinV标记产物，且易于药盒化，但由于99Tcm与AnnexinV中的巯基相结合,会使AnnexinV的活性会受到影响，产生一些变性蛋白，使肝脏的放射性摄取增加。3.对Annexin V进行结构修饰
国外 Tait JF 等学者(Tait JF, Brown DS, Gibson DF, Blankenberg FG, StraussHW. Development and characterization of annexin V mutants with endogenouschelation sites for 99mTc. Bioconjug Chem 2000; 11:918 - 25)通过修饰Annexin V的结构，在Annexin V的N端延长了 7个氨基酸(含一个或两个半胱氨酸残基)形成变异分子Annexin V116、117和118,三种蛋白可在大肠杆菌细胞质中表达并可纯化成同质体,与红细胞膜上的PS都有较高的亲和力。用在Annexin V上加肽序列的方法，使之形成了与99Tcm结合的内生螯合位点。以SnCl2为还原剂，葡庚糖酸盐(GH)为转换剂，三种蛋白可特异性结合99Tcm至少1850 3700MBq (50 IOOmCi)，且标记后性质稳定，保持了与膜PS的亲和力。

发明内容
为克服已有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种标记方法更为简便实用，且能尽可能保持标记蛋白活性和生物功能的标记化合物，用于进行放射性核素显像，检测各种疾病中细胞凋亡发生的程度和范围。

为达到上述目的，本发明的技术方案具体如下
一种以磷脂酰丝氨酸为祀点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV,膜联蛋白AnnexinV的羧基端连有半胱氨酸Cys，半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素"Tc'上述放射性药物为无色透明液体针剂。本发明还提供了一种上述放射性药物99Tcn1-Cys-AnnexinV的标记方法，采用直接标记法对Cys-Annexin V进行99Tcm标记,步骤包括
(1)取适量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亚锡化；
(2)向步骤(I)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_,混勻后放置，即形成99Tcm-Cys-Annexin V。上述的放射性药物99Tcn1-Cys-AnnexinV的标记方法，可以具体为
(1)取适量的SnCl2·2Η20，以浓度为O. 05mol/L的HCl溶解，取已配制好的上述含SnCl2的ΙΟΟμ ，总计亚锡量约25 3(^g依次加入Cys-Annexin V 5 5(^g后充分摇匀；
(2)向步骤(I)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_0. 8mL, 10mg/mL维生素C IOOPL,混勻后放置，即形成 99Tcm-Cys-Annexin V。本发明还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于检测心肌缺血损伤后心肌细胞凋亡即探测急性心肌损伤方面的用途。本发明还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于化疗后检测肿瘤细胞凋亡即肿瘤化疗后疗效评价方面的用途。本发明还提供了一种99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于探测活化血小板水平即检测急性血栓方面的用途。本发明所述的99Tcm-Cys-AnnexinV显像剂采用了一种新的Annexin V衍生物Cys-Annexin V作为99Tcm标记的底物,首次采用直接标记法实现了 Cys-Annexin V的99Tcm标记，由于本发明技术方案中99Tcm仅对AnnexinV羧基端的Cys上的巯基进行了标记，避开Annexin V的结合单位和功能区,保护膜联蛋白的生物学功能。本发明技术方案不仅保持了膜联蛋白的活性且提高标记效率，得到的标记化合物99Tcm-Cys-AnnexinV稳定性好，标记过程十分简便易行，且降低了显像剂制备的成本，有利于临床转化；动物实验表明，其生物分布理想，血液清除快，肝肾清除快。在心脏缺血再灌注损伤及肿瘤疗效及急性深静脉血栓相关研究发现99Tcm-Cys-AnnexinV SPECT可有效探测损伤心肌、化疗后肿瘤和血栓等，显像清晰，图像质量好。


图l:"mTc-MIBI心肌灌注显像(SPECT/CT)示左室心尖部呈异常放射性稀疏区。图2 = 99Tcm-Cys-AnnexinV凋亡显像(SPECT/CT)示左室心尖部呈放射性高浓聚区。图3 =99mTc-MIBI心肌灌注显像示心尖部异常放射性稀疏缺损区。图4 `-Cys-AnnexinV高摄取的心肌组织的病理检查图，结果显示大量心肌细胞发生凋亡。图5 =99Tcn1-Cys-AnnexinV乳腺癌裸鼠模型化疗前后micro SPECT/CT 显像。(A, B:化疗前显像肿瘤部位未见放射性摄取；C，D:化疗后肿瘤部位有显著放射性摄取。)
图6 =99Tcm-Cys-AnnexinV高摄取的乳腺癌肿瘤组织的病理检查图，结果显示大量肿瘤细胞发生凋亡。图7 :99mTc-Cys—Annexin V深静脉血栓犬靶向显像下腔静脉及右侧股静脉血栓放射呈异常放射性浓聚。图8 :离体血栓及病理示血栓为混合血栓有大量血小板碎片和纤维素组成。
具体实施例方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。实施例1. Cys-AnnexinV 的 99Tcm 标记技术
Cys-AnnexinV由南京大学医药生物技术国家重点实验室提供，应用基因工程技术利用大肠杆菌中克隆、表达并纯化，在Annexin V的羧基端添带有巯基的半胱氨酸,用金属亲和层析纯化，重组制备Cys-AnnexinV。可参考申请号为201110072451. 2，名称为“人膜联蛋白V变体及其表达、制备和应用”的中国专利申请公开的方法制备得到。采用直接标记法对Cys-AnnexinV进行99Tcm标记。取适量的SnCl2 ·2Η20，以浓度为O. 05mol/L的HCl溶解，pH7. 4磷酸缓冲液稀释成lmg/mL。取已配制好的含SnCl2的柠檬酸缓冲液30μ ，加入Cys-AnnexinV 5 l(^g充分摇匀亚锡化后，再加入99TcniCVO. 8mL, IOmg/mL维生素C ΙΟΟμ ,混勻后即可。以纸色谱法进行标记检测，测定Cys-Annexin V的放射化学纯度及体外稳定性。采用两个体系体系I采用新华I号层析纸作为固定相，以丙酮作为展开剂，99Tcm-Cys-Annexin V及99Tc111-胶体的比移值(Rf )为 0，99TcniCV 的 Rf=O. 7-0. 8 ;体系 2 以 2. 5%牛血清白蛋白浸泡过的新华I号层析纸作为固定相，以乙醇氨水水(2 1 5 ν/ν)作为展开剂展开，99Tcn1-胶体的 Rf=0，而 99Tcn1-Cys-AnnexinV 及 99TcniCV 的 Rf=O. 7-0. 8。纸色谱法测定Cys-AnnexinV的放射化学纯度可达(98. 01 ±1. 67) %，胶体含量为(3. 31 ±1. 37) %，室温放置3h后放射化学纯度仍保持在(95. 45±1. 34) %，达到临床应用的稳定性要求。实施例2. 99Tcm-Cy s-AnnexinV标记化合物的生物学分布特点符合作为显像剂的要求，通过小鼠体内器官分布实验进行说明。取昆明种小白鼠40只，随机分为8组，每组5只。尾静脉注射99Tcm-Cys-AnnexinV,剂量为11.1MBq，体积为O. 2mL。分别于给药后5min、30min、lh、2h、4h、6h共6个时间点处死一组动物，取出血液、心、肝、脾、肺、肾、胃、小肠、脑、肌肉、骨等主要器官，称重并测定放射性计数，绘制各脏器的时间放射性曲线；计算每克组织百分注射剂量率(％ID/g，每克组织或脏器放射性计数/注射入小鼠体内总放射性计数X100%)。以时间为横坐标，放射性计数为纵坐标绘制血液清除曲线，用DAS2. O软件拟合，分析在正常小鼠体内的药代动力学参数。实验结果显示肾脏对99Tcm-Cys-AnnexinV的摄取量最高，清除较快，其次是肝脏、脾脏，胃肠摄取较少，而脑基本不摄取(见表I)。99Tcm-Cys-AnnexinV在血液中清除迅速，DAS2. O软件拟合结果显示血液清除曲线符合二室模型特征，分布相半衰期(Τ1/2α)为21. 18±5. 95min，清除相半衰期(Tv20)为69. 32±0. lOmin，平均血浆清除率(CL)为O. 008±0. 002L/min/Kg，表观分布容积(Vd)为5. 07±0. 86L/Kg，由一室向二室的转移速率常数(K12)为O. 031±0. 010/min,由二室到一室的转移速率常数K21为O. 016±0. 002/min。表I 99Tcm-Cys-AnnexinV在昆明种小白鼠体内的生物分布(工土s, n=5)
权利要求
1.一种以磷脂酰丝氨酸为靶点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV,其特征在于膜联蛋白AnnexinV的羧基端连有半胱氨酸Cys,半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素99Tcm。
2.如权利要求1所述的放射性药物，其特征在于所述放射性药物为无色透明液体针剂。
3.—种如权利要求1所述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,其特征在于采用直接标记法对Cys-Annexin V进行99Tcm标记,步骤包括 (1)取适量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亚锡化； (2)向步骤(I)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_充分混匀后放置，即形成 99Tcm-Cys-Annexin V。
4.如权利要求3所述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,其特征在于所述步骤(2)还加入维生素C保持溶液稳定性。
5.如权利要求3或4所述的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV的标记方法,其特征在于所述步骤具体包括 (1)取适量的SnCl2·2Η20，以浓度为O. 05mol/L的HCl溶解，取已配制好的上述含SnCl2的ΙΟΟμ ，总计亚锡量约25 3(^g依次加入Cys-Annexin V 5 5(^g后充分摇匀； (2)向步骤(I)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99Tcm04_0. 8mL, 10mg/mL维生素C IOOPL,混勻后放置，即形成 99Tcm-Cys-Annexin V。
6.99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于检测心肌缺血损伤后心肌细胞凋亡方面的用途。
7.99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于化疗后检测肿瘤细胞凋亡方面的用途。
8.99Tcm-Cys-AnnexinV作为显像剂用于探测急性血栓方面的用途。
全文摘要
本发明提供了一种以磷脂酰丝氨酸为靶点的放射性药物99Tcm-Cys-AnnexinV，膜联蛋白AnnexinV 的羧基端连有半胱氨酸Cys，半胱氨酸的巯基上标记有放射性核素99Tcm。可采用直接标记法对Cys-AnnexinV进行99Tcm标记，步骤包括(1)取适量的SnCl2加入Cys-AnnexinV使蛋白亚锡化；(2)向步骤(1)蛋白亚锡化后的Cys-AnnexinV中加入99TcmO4-，混匀后放置，即形成99Tcm-Cys-AnnexinV。本发明所用标记方法更为简便实用，且能尽可能保持标记蛋白活性和生物功能，用于进行放射性核素显像，检测各种疾病中细胞凋亡发生的程度和范围，尤其是作为显像剂在检测细胞凋亡和血栓中的应用。
文档编号A61K51/12GK103041411SQ20131001290
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月15日 优先权日2013年1月15日
发明者王峰, 华子春, 胡敏进, 方纬, 王自正 申请人:南京市第一医院, 华子春, 江苏靶标生物医药研究所有限公司, 中国医学科学院阜外心血管病医院