专利名称：一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种免疫佐剂，具体地，涉及一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用。
背景技术：
弓形虫广泛寄生于多种哺乳动物的有核细胞内，是一种重要的人兽共患性寄生虫病病原，具有发病率高、危害严重的流行病学特点。婴幼儿、孕妇或免疫低下者感染，可引发流产、畸胎或急性获得性弓形虫病等。艾滋病又名获得性免疫缺陷综合征(AIDS)，研究发现10% 30%艾滋病患者并发弓形虫脑炎，是艾滋病患者死亡的主要原因之一。鉴于药物治疗弓形虫病能力有限且毒副作用大的特点，研制疫苗尤其是DNA疫苗已逐渐成为一种较为有效的举措。从1990年WolfT等发现小鼠肌注外源性重组质粒，质粒被摄取并表达出编码蛋白时起，重组质粒的数量和种类已举不胜举，其中近些年，弓形虫重组质粒包括R0P13，ROP16, R0P18，MIC6，MIC8等先后被评价。结果发现，除少数个别基因(如R0P18等)免疫效果较好外，其他重组疫苗均有不理想的特征。为了增强免疫效果，提高免疫保护率，免疫佐剂的研制将成为一个重要的研究课题。按照是否具有免疫原性，免疫佐剂可分为两大类，即具备免疫原性的佐剂如卡介苗，细胞因子等，和不具备免疫原性的佐剂如铝盐佐剂等，或两者的混合形式。其中，白细胞介素(IL)是一种常见的免疫佐剂。IL15是Grabstein于1994年从猿肾上皮细胞系CV-1/EBNA的培养上清液中发现的，它是一种重要的免疫调节因子，属于IL2家族，主要由单核细胞、吞噬细胞和树突状细胞等白细胞产生，能维持依赖IL-2的CTLL细胞系的增殖，同时对⑶8+ T细胞、NK细胞、巨噬细胞等免疫细胞的发育及内环境稳态至关重要。IL15分子包含Cys-35-Cys-85和Cys-42-Cys-88两个二硫键，三级结构含有4个螺旋和3个连接环。IL15受体(IL15R)由3个亚基组成，β、Y亚基与IL2R相同，α亚基为IL15独有。在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中，IL15引起由IgM交叉耦合 诱导的细胞增殖并抑制细胞凋亡，还可增加Shc和ERK1/2的磷酸化作用，而IL21促进细胞凋亡且不能引起CLL细胞的增殖。IL21是Parrish-Novak首次发现的,属于I型细胞因子,亦是IL-2家族成员。人IL21基因与IL2、IL15定位于同一条染色体上，位于4q26_q27，距IL-2基因大约180 kb,相距IL15则较远，与IL2、IL4、IL15有较高的同源性，鼠IL21与人的IL21有57%的同源性。IL21包含4个螺旋，与IL15有两对相同的Cys位点残基:一对是在IL21和IL15中特有的，另一对在IL2、IL4和GM-CSF中也有表达。IL21具有很强的免疫刺激作用，特别是能够增强并维持CD8+ T细胞应答，已经被证明是很好的免疫增强因子。IL21的信号传导是由IL21受体与IL2受体家族共同的Y c受体组成的异二聚体受体介导的。IL21是启动先天性和适应性免疫应答的辅助细胞因子，并导致免疫应答进一步放大。IL21对机体的细胞免疫和体液免疫具有广泛的调节作用，它可调节T细胞、B细胞、NK细胞和DC细胞的分化和增殖，其中最显著的特征是能持续增强效应T细胞及活化NK细胞的功能，在促进机体由先天性免疫向获得性免疫的转变中起着关键作用。IL21对B细胞的调节主要表现为促进B细胞向浆细胞分化，调节免疫球蛋白的产生。IL21具有增强免疫激活、促进CTL应答和维持记忆性T细胞应答的能力，使其成为癌症免疫治疗最具潜力的候选药物之一。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，提供了一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂及其应用。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案:
一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，它是以PVAXl质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒pVAX-1L21-1L15，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示。本发明的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在提升MIC8基因免疫效果中的应用。本发明的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在增强弓形虫免疫预防疫苗效果中的应用。本发明的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在制备弓形虫免疫预防疫苗中的应用。以下为本发明的实验内容:
参照弓形虫MIC8基因序列，设计了扩增弓形虫MIC8基因的引物序列。包括:
Fmic8:5/ -CGCGGATCCATGAAGGCCAATCGAATATGGTG-3'；
Rmic8:5/ -CCGCTCGAGTTAGGACCAGATACCGCCCGAA-3'；
参照小家鼠(ifes musculus) IL15基因序列，设计了 IL15基因引物序列。包括:
F15b:5/ -AACTGCAGATGAACTGGATAGATGTAAGATATG-3,；
R15b:5/ -TGCTCTAGATCAGGACGTGTTGATGAAC-3/ ；
参照小家鼠(ifes musculus、IL21基因序列，设计了 IL21基因引物序列。包括:
F21:5/ -CGGGGTACCATGCATAAATCAAGCCCCCAAG-3'；
R21:5/ -AACTGCAGCTAGGAGAGATGCTGATGAATC-3,；
弓形虫RH株pVAX-MIC8疫苗的制备；
KM鼠pVAX-1L21-1L15免疫佐剂的构建；
KM鼠免疫与分组。(一)弓形虫RH株PVAX-MIC8疫苗的制备包括如下顺序的步骤:
1.虫体基因组DNA的提取:弓形虫RH株腹腔接种KM鼠96 h后，经颈椎脱臼致死，无菌收集小鼠腹水1.0mL, IOOOOrpm离心3 5min，弃上清，备用。弓形虫RH株DNA提取的具体方法和步骤参照 Promega 公司试剂盒 Wizard SV Genomic DNA Purification System 使用说明进行。扩增:以所提取的弓形虫RH株基因组DNA为模板，进行MIC8基因的PCR扩增。MIC8基因PCR反应条件为:94°C预变性5min，94°C变性 lmin，62°C复性Imin ;72°C延伸2min ；35个循环。纯化产物的连接:MIC8 基因PCR纯化产物的连接反应参照TaKaRa公司pMD18_TVector使用说明进行。16°C反应2 4h或4°C连接过夜，连接产物标记为pMD18_MIC8。的序列测定:将经菌液PCR和酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。质粒的小量提取:按天根生化科技(北京)有限公司TIANprep Mini Plasmid Kit使用说明进行。载体(图6所示)及MIC8目的片段的回收:用BamHI和XhoI分别双酶切pVAXl质粒及pMD18-MIC8重组质粒，按照天根生化科技(北京)有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明回收载体及目的片段。载体及MIC8目的片段的连接:将经切胶回收纯化得到的MIC8基因片段定向亚克隆至pVAXl载体中。16°C反应4 6h或4°C连接过夜，产物标记为pVAX_MIC8。连接产物的转化与鉴定:将连接产物10 μ L转化大肠杆菌DH5a中，挑取若干单菌落作菌液PCR鉴定。pVAX-MIC8构建路线参照
图1。(二)KM 鼠 pVAX-1L21-1L15 重组质粒的构建
1.KM鼠脾脏总RNA的提取:弓形虫RH株腹腔接种KM鼠72 h后，将其经颈椎脱臼致死，并将其置75%乙醇溶液中浸泡2 3min，无菌取出脾脏。将脾脏装入一个RNase-Free离心管，后续实验按天根生化科技(北京)有限公司试剂盒RNAprep Pure Tissue Kit使用说明进行；
2.RT-PCR扩增目的片段:以KM鼠脾脏总RNA为模板，进行IL21和IL15基因序列的RT-PCR扩增，实验步骤参考大连宝生物工程公司PrimeScript One Step RT-PCR KitVer.2试剂盒的使用说明进行 。纯化产物的连接:RT-PCR纯化产物的连接反应参照TaKaRa公司pMD18_T Vector简易操作说明进行；16°C反应2 4h或4°C连接过夜，产物依次标记为pMD18-1L21和PMD18-1L15 ;pMD18_T 载体如图 5 所示。和pMD18-1L15重组质粒的小量提取:按天根生化科技(北京)有限公司TIANprepMini Plasmid Kit使用说明进行。和IL15的序列测定:将经菌液PCR和双酶切鉴定均为阳性的菌株，送到上海生工生物工程有限公司测序。及目的片段IL15的回收与连接:用PstI和XbaI双酶切pVAXl质粒和pMD18_IL15重组质粒，按照天根生化科技(北京)有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的使用说明分别回收载体及目的片段。然后将经切胶回收纯化得到的IL21、IL15基因片段定向亚克隆到相应pVAXl载体中。16°C反应4 6h或4°C连接过夜，产物标记为pVAX_IL15。和pMD18-1L21重组质粒的小量提取:按天根生化科技(北京)有限公司TIANpr印Mini Plasmid Kit使用说明进行。及目的片段IL21的回收与连接:用KpnI和PstI双酶切pVAX_IL15和pMD18_IL21重组质粒。按照天根生化科技(北京)有限公司普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒的指导说明回收线性载体PVAX-1L15及目的片段IL21，将经切胶回收纯化得到的IL21基因片段定向亚克隆到pVAX-1L15载体中。16°C反应4 6h或4°C连接过夜，产物标记为pVAX_IL21_IL15。PVAX-1L21-1L15构建路线参照图2。(三)大量制备质粒
1.挑取含有目的质粒(pVAXl，pVAX-1L21-1L15和pVAX-MIC8)的阳性菌液于LB (含1000U/mL Kan+，下同)固体选择培养基上划线，37°C培养过夜。挑取板上的一个单菌落置于12mL LB液体选择培养基中，摇床37°C，180 220rpm培养12 16h。将上述培养菌液以I: 100的比例接种到装有400mL LB培养基的IOOOmL锥形瓶中，摇床37°C，180 220rpm培养过夜。2.将细菌培养物置于冰中或4°C冰箱数分钟，4°C，9000rpm离心5min，收集细菌培养物沉淀，弃上清，倒置离心管使上清尽量流出。IOmL预冷的Solution I重悬菌体,旋润振荡，使细菌在Solution I中完全分散。加入ImL新配制的10mg/mL溶菌酶溶液(pH8.0)，震荡混匀，此步可省略。3.加入20mL新配制的Solution II,轻摇并上下颠倒混勻2 4次。再加入15mL预冷的Solution III，立即轻摇混匀，以免产生局部沉淀。冰上或_20°C冰箱放置lOmin。加Solution II和Solution III的时间间隔控制在5min以内，以免过分裂解。4°C或室温，IlOOOrpm离心IOmin,利用4层纱布将上清过滤,转移到两个新50mL离心管中。4.上清与0.6倍体积异丙醇(15mL)混勻，室温放置lOmin。室温下，IlOOOrpm离心IOmin,弃上清,将空管倒置于滤纸上数分钟数分钟，除去残余。加入3mL ddH20充分溶解(很重要)，再加入3mL预冷的5M LiCl溶液，充分混匀(不可吹打)。两只离心管合并为一管，冰中或_20°C冰箱放置lOmin。4°C或室温，IlOOOrpm离心lOmin，将上清分别转移到一新50mL离心管中，加入等体积(12mL)预冷的异丙醇,充分混勻，室温放置lOmin。4°C或室温，IlOOOrpm离心IOmin,小心弃上清,倒置控干管内液体,一般倒置10 15min即可。此时管壁会出现白色沉淀物即质粒。5.力卩Λ 3mL ddH20或TE溶液(ρΗ8.0) 溶解沉淀，并力卩Λ 30
LlL 10mg/mL RNase A，37°C水浴Ih除去RNA。加入2倍体积(8mL)无水乙醇和1/10体积
(300 p.L)3M NaAc溶液，充分混匀，冰中或_201:冰箱放置201^11。41:，11000印111离心IOmin，
小心将上清吸出(勿倒)，并将离心管倒置于滤纸上控干(非常重要)。加入100>UL CldH2O或
TE溶液(pH8.0)，充分洗脱质粒沉淀。利用分光光度计测量所得质粒的浓度并记录，分装封口后于-20°C保存备用。(四)质粒DNA的纯度检测
以ddH20或TE (ρΗ8.0)为空白对照，用分光光度计测定波长260nm和280nm下的核酸溶液光密度(OD)值。双链DNA纯品的OD26tZOD28tl值为1.8，若样品0D26(l/0D28(l值低于1.8，说明样品可能被蛋白质污染，需进一步纯化。(五)重组质粒的免疫效果评价
1.KM鼠免疫与分组:为了降低应激反应，KM鼠买回后需饲养lw，然后将其随机分为6个组，每组19只，具体分组见表10。表10免疫实验分组情况
权利要求
1.一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，其特征在于，它是以PVAXl质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒PVAX-1L21-1L15，其碱基序列如SEQ ID NO:1所
2.权利要求1所述的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在提升MIC8基因免疫效果中的应用。
3.权利要求1所述的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂在增强弓形虫免疫预防疫苗效果中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种用于弓形虫感染预防的免疫佐剂，它是以pVAX1质粒作为载体、融合白细胞介素IL21和IL15的重组质粒pVAX-IL21-IL15，其碱基序列如SEQIDNO:1所示。本发明提供的用于弓形虫感染预防的免疫佐剂具有显著提升MIC8基因免疫效果的作用，进而，能够显著增强弓形虫免疫预防疫苗的免疫效果。
文档编号A61K39/02GK103083660SQ20131002979
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者朱兴全, 李中原, 陈佳, 徐民俊, 周东辉, 黄思扬, 宋慧群 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所