专利名称：色氨酸纳米微球在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及色氨酸纳米微球在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途，还涉及一种用于制备所述的色氨酸纳米微球的方法。本发明属于肿瘤药物领域。
背景技术：
恶性肿瘤严重威胁着人类的健康和生命，目前市场上虽有很多抗癌药物，但副作用大、价格昂贵，给患者及其家属带来沉重的精神负担和难以解脱的悲痛。同时也给患者家属及社会造成很大的经济负担。目前，全世界每年因肿瘤死亡的人数达500万以上，许多国家其死亡率占各种死亡原因的首位。目前已有的药物治疗、化疗、放疗等手段，虽有一定效果，但副作用也很大，因此寻找更有效、无副作用且相对经济的治疗药物，一直是医学家们的不懈追求。肿瘤生长时可明显改变宿主的糖和氨基酸代谢。氨基酸具有许多重要的生理功能，但又是肿瘤组织赖以生存的条件之一，这给氨基酸治疗肿瘤带来了很大矛盾。目前世界上用于作为药物的氨基酸及氨基酸衍生物的品种达100多种。氨基酸衍生物已广泛用作抗肿瘤药物，其作用方式有:(1)以氨基酸作为载体的抗肿瘤药物，如苯丙氨酸芥子气，L-缬氨酸、L-谷氨酸、L-赖氨酸与苯二胺氮芥共结合物；(2)利用氨基酸衍生物作为肿瘤细胞所需氨基酸的结构类似物达到抗肿瘤的目的，如S-氨甲酰-L-半胱氨酸；(3)氨基酸衍生物作为酶抑制剂的抗肿瘤药物，如N-磷酸乙酰-L-天门冬氨酸是一个天门冬氨酸转氨甲酚基酶的过渡状况抑制剂，利用这个抑制剂可中断嘧啶核苷酸的合成途径达到抗肿瘤目的；(4)氨基酸衍生物作为中间产物的肿瘤抑制剂；(5)使癌细胞逆转的氨基酸衍生物。色氨酸是人和动物必需的限制性氨基酸之一，它与生理发育有关，广泛应用于医药、食品和饲料添加。但色氨酸在肿瘤发生发展中的作用以及是否可以作为药物对肿瘤疾病进行治疗尚不清楚。仅有的一些研究多来自流行病学调查，有学者研究表明在口腔鳞状上皮细胞癌患者体内血浆中色氨酸及其代谢产物显著增高，提示色氨酸可能是肿瘤发生发展的重要物质基础，目前以色氨酸及其衍生物作为抗肿瘤的药物还未被开发利用。一切生物的生长，都需要氨基酸作为合成蛋白质的原料。然而，当某种氨基酸进入细胞浆时，不仅不促进肿瘤细胞的生长反而抑制其增殖，将可能成为一种理想的抗肿瘤药物。近年来，国内外饲料工业发展迅速，在医药工业上用途的不断扩大，色氨酸成为一种国际市场上发展前景良好，国内市场需求较大的产品，且原料来源丰富，生产技术成熟，相对于多数现有的抗肿瘤药物，其成本较低， 将其作为抗肿瘤药物投入市场必将具有广阔开发前景。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种色氨酸纳米微球在制备治疗肿瘤疾病药物中的新用途。本发明所要解决的技术问题之二是提供一种色氨酸纳米微球的制备方法及由该方法制备得到色氨酸纳米微球。本发明解决上述技术问题所采取的技术方案是，利用乳化法纳米微球技术将色氨酸包埋使其进入肿瘤细胞，进而在细胞内释放大量外源色氨酸到肿瘤细胞浆，从而达到抗肿瘤的目的。研究表明，色氨酸纳米微球对人淋巴癌细胞系、乳腺癌细胞系、肺癌细胞系、直肠癌细胞系、子宫颈癌细胞系、脑瘤肿瘤细胞系和人白血病细胞系具有较强的杀伤作用，通过局部给药方式，该药物可对直肠癌细胞株裸鼠转移瘤的生长有明显的抑制作用。因此，本发明提出了色氨酸纳米微球在治疗肿瘤疾病中的用途。本发明中，优选的，一种制备所述色氨酸纳米微球的方法，其特征在于包含以下步骤:(I)将色氨酸溶液在超声条件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，得到乳白色的均一乳液；(2)将牛血清白蛋白的水溶液在超声条件下加入到步骤(I)得到的乳液中，超声，形成均一的乳液；(3)在步骤(2)得到的乳液中放入转子，搅拌，将乳液离心，离心速度2500-3500rpm,时间8_12min，取上清，将上清再次离心，离心速度2500-3500rpm,时间8-12min，取2次离心的沉淀物；(4)将沉淀物加入蒸馏水中分散后，再进行离心，然后再分散，重复3次，最后的沉淀物分散在蒸馏水中，冷冻干燥，即得。在本发明中，优选的，步骤(I)中所述的色氨酸溶液的浓度为0.lg/ml-0.5g/ml,更优选为0.2g/mL.
在本发明中，优选的，步骤(I)中所述的含有PLGA的二氯甲烷溶液的浓度为
0.05g/ml，含有PLGA的二氯甲烷溶液与色氨酸溶液的体积比为10:1。在本发明中，优选的，步骤(2)中所述的牛血清白蛋白水溶液的浓度为0.0Olg/ml-0.01g/ml，更优选为0.005g/ml，牛血清白蛋白的水溶液与步骤(I)得到的乳液的体积比 5-6:1。在本发明中，优选的，步骤(3)中在乳液中放入转子，在电磁搅拌条件下搅拌4小时，将乳液离心，离心速度3000rpm，时间lOmin，取上清(上面的溶液)，将上清再离心，离心速度 3000rpm,时间 IOmin。进一步的，本发明还提供所述的方法制备得到的色氨酸纳米微球。其中，所述的色氨酸纳米微球的载药量为[(27.18±0.51) X10_3]%以上。更进一步的，本发明还提出了一种用于治疗肿瘤疾病的药物，其特征在于所述的药物中的有效成分为色氨酸纳米微球。正常情况下，在人类细胞包括肿瘤细胞中色氨酸都不能直接从细胞外进入细胞浆中。因此一种有效的将色氨酸传递至细胞内的技术也是本发明的又一大特色。本发明利用乳化法纳米微球技术使色氨酸进入肿瘤细胞，采用局部给药方式使本发明物进入肿瘤细胞，进而在细胞内释放大量外源色氨酸到 肿瘤细胞浆，干扰肿瘤细胞的DNA合成，从而达到抗肿瘤的目的。本发明人经过研究试验发现，色氨酸进入细胞后对多种肿瘤具有抑制作用。
本发明中所述的色氨酸是指与商品名相同结构的化合物，色氨酸可通过商业渠道购买，也可以通过合成技术的方法来制备。本发明使用纳米微球技术对色氨酸进行包埋作为治疗肿瘤疾病的药物。给药量为色氨酸25mg/kg,每周3次。
图1为裸鼠移植瘤生长曲线。
具体实施例方式下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1色氨酸纳米微球的制备1、材料:①聚乳酸-轻基乙酸 共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA),分子量100000，来源:山东医疗器械研究所②L-色氨酸分析纯购买自上海晶纯实业有限公司批号:42217③二氯甲烷分析纯购买自天津市科密欧化学试剂有限公司批号:201103282、方法将0.2g色氨酸溶于Iml水中得到色氨酸溶液(浓度为0.2g/ml),将0.5gPLGA溶于IOml 二氯甲烷中(PLGA浓度为0.05g/ml )，得到含有PLGA的二氯甲烷溶液，将色氨酸溶液在超声条件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，超声分散3min，得到乳白色的均一乳液溶液，然后将溶有0.25g牛血清白蛋白的50ml水溶液在超声条件下加入到乳液中，超声3min,形成均一的乳液。在乳液中放入转子,在电磁搅拌条件下搅拌4小时。搅拌结束后，将乳液离心，离心速度3000rpm，离心lOmin，取上面的溶液上清(上面的溶液)，将上清(上面的溶液)再离心，离心速度3000rpm，离心lOmin，取2次离心沉淀物，加入蒸馏水分散再离心，然后再分散，重复3次，最后的沉淀物分散在蒸馏水中，冷冻干燥。所得产品即是本发明。本发明的载药量为[(27.18±0.51)X10_3]%。实施例2色氨酸纳米微球的制备1、材料:同实施例12、方法将0.5g色氨酸溶于Iml水中得到色氨酸溶液(浓度为0.5g/ml),将0.5gPLGA溶于IOml 二氯甲烷中(PLGA浓度为0.05g/ml )，得到含有PLGA的二氯甲烷溶液，将色氨酸溶液在超声条件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，超声分散5min，得到乳白色的均一乳液，然后将溶有0.5g牛血清白蛋白的55ml水溶液在超声条件下加入到乳液中，超声5min，形成均一的乳液。在乳液中放入转子，在电磁搅拌条件下搅拌5小时。搅拌结束后，将乳液离心，离心速度3500rpm，离心8min，取上清(上面的溶液)，将上清再离心，离心速度3500rpm，离心8min，取2次离心沉淀物，加入蒸馏水分散再离心，然后再分散，重复3次，最后的沉淀物分散在蒸馏水中，冷冻干燥。所得产品即是本发明。实施例3色氨酸纳米微球的制备
1、材料:同实施例12、方法将0.1g色氨酸溶于Iml水中得到色氨酸溶液(浓度为0.lg/ml),将0.25g PLGA溶于IOml 二氯甲烷中(PLGA浓度为0.025g/ml )，得到含有PLGA的二氯甲烷溶液，将色氨酸溶液在超声条件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，超声分散2min，得到乳白色的均一乳液，然后将溶有0.05g牛血清白蛋白的50ml水溶液在超声条件下加入到乳液中，超声3min，形成均一的乳液。在乳液中放入转子，在电磁搅拌条件下搅拌3小时。搅拌结束后，将乳液离心，离心速度3000rpm，离心lOmin，取上清(上面的溶液)，将上清再离心，离心速度3000rpm，离心lOmin，取2次离心沉淀物，加入蒸馏水分散再离心，然后再分散，重复3次，最后的沉淀物分散在蒸馏水中，冷冻干燥。所得产品即是本发明。试验例1本发明色氨酸纳米微球对癌细胞的作用1、实验材料人淋巴癌细胞系(M-9)、乳腺癌细胞系(MCF-7)、肺癌细胞系(H125)、直肠癌细胞系(SW480)、子宫颈癌细胞系(A431)、脑瘤肿瘤细胞系(U373)和人白血病细胞系(HL-60)由哈尔滨医科大学肿瘤研究所提供；色氨酸纳米微球:按照实施例1的方法制备得到2、试验方法以5-Fu为阳性对照药，将本发明药物(色氨酸纳米微球，按照实施例1的方法制备得到)加入到细胞培养皿中对人淋巴癌细胞系(M-9)、乳腺癌细胞系(MCF-7)、肺癌细胞系(H125)、直肠癌细胞系(SW480)、子宫颈癌细胞系(A431)、脑瘤肿瘤细胞系(U373)和人白血病细胞系(HL-60)，进行MTT试验检测细胞活力，MTT可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成结晶状的深紫色产物formazan。在二甲基亚砜的情况下，可以被完全溶解。然后通过酶标仪可以测定595nm波长附近的吸光度。细胞活力越大，则吸光度越高；细胞活性越小，则吸光度越低。根据上述原理，求出该药物的IC5tl结果如表I所示:表I本发明的色氨酸纳米微球对各种肿瘤细胞IC5tl (mg/ml)
组别 M 9 MCF-7 H125 SW480 A431 U373 HL-6Q本发明 15.3 24.6 17.2 14.9 33.7 18.6 I 1.95-Fu 58.7 87.4 72.5 25.3 88.9 78.4 95.3尸值 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05 <0.05从表I中可以看出，本发明对多种肿瘤细胞株均有杀伤作用，同时我们采用普通色氨酸和空白纳米微球分别作为阴性对照，发现色氨酸和普通纳米微球对肿瘤细胞没有杀伤作用，用5-Fu作为阳性对照，进行配对T检验，证明该药物杀伤效果强于传统抗肿瘤药物5-Fu。试验例2本发明色氨酸纳米微球对裸鼠移植瘤生长的抑制作用1、实验动物BALB/C(nu/nu)裸小鼠购自北京维通利华实验动物有限公司，SPF级，鼠龄3 4周，体重16 18g，雄性，饲养于超净生物层流架内，环境定期紫外线消毒，保持恒温(25±2°C )、恒湿(45% 50%)，笼具、饮水均经高压蒸汽灭菌，实验操作均在无菌罩内进行。2、实验方法将直肠癌细胞(SW480)按常规方法复苏扩增，消化后无血清培养液离心洗涤2次，计数并调整细胞数，台盼蓝染色活细胞计数>99%。用带6号针头注射器抽取癌细胞悬液接种于裸鼠右前腋部皮下，每个部位接种0.2mL (含活细胞数I X IO6个)，接种后每天观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿，按规定时间测量肿瘤体积，经过3 7d潜伏期，可见接种部位皮下出现灰白色结节，并逐渐长大，呈圆形或椭圆形突出于体表，以肿瘤直径0.5cm为成瘤。精心饲养，每天观察1-2次，隔天称裸鼠体重，测量肿瘤大小(用游标卡尺测量肿瘤的2个互相垂直的直径，包括皮肤厚度在内)，代入下式计算:V=1/2XAB2，V为肿瘤体积，A、B分别为肿瘤的长短径；测量瘤体的2个直径时要使游标卡尺每次都是相互垂直的。治疗后各组裸鼠瘤重量和抑瘤率测定:最后一次用药后24h以颈椎脱位方式处死裸鼠，剥出的肿瘤去除血污、脂肪等非瘤组织，测量瘤重，计算各组平均瘤重及抑瘤率(IR)。IR=(肿瘤对照组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/对照组平均瘤重X 100%。将荷瘤小鼠随机分成3组，每组8只:(I)发明组:每次腹腔注射按照本发明实施例I所述方法制备得到色氨酸纳米微球25mg/kg *bw ； (2) 5_Fu组:每次腹腔注射5_Fu20mg/kg.bw ； (3)对照组:每次腹腔注射生理盐水试剂10mL/kg.bw,均为3次/周,共4周。3、实验结果实验结束时各组裸鼠的体重无明显差别，与实验前比较虽有增长但差异不显著，如图1所示，发明组肿瘤的瘤重及体积明显低于其他组(P〈0.05)，抑瘤率为65.85%，5-Fu组的抑瘤率为57.21 %。实验结果表明该药物可对直肠癌SW480细胞裸鼠移植瘤生长具有明显的抑制作用。以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
权利要求
1.色氨酸纳米微球在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途。
2.一种制备色氨酸纳米微球的方法，其特征在于包含以下步骤: (1)将色氨酸溶液在超声条件下分散到含有PLGA的二氯甲烷溶液中，得到乳白色的均一乳液； (2)将牛血清白蛋白的水溶液在超声条件下加入到步骤(I)得到的乳液中，超声，形成均一的乳液； (3)在步骤(2)得到的乳液中放入转子，搅拌，将乳液离心，离心速度2500-3500rpm，时间8-12min,取上清,将上清再次离心,离心速度2500-3500rpm,时间8_12min,取2次离心的沉淀物； (4)将沉淀物加入蒸馏水中分散后，再进行离心，然后再分散，重复3次，最后的沉淀物分散在蒸馏水中，冷冻干燥，即得。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(I)中，所述的色氨酸溶液中色氨酸的浓度为 0.lg/ml-0.5g/ml,优选为 0.2g/ml。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于步骤(I)中，所述的含有PLGA的二氯甲烷溶液中，PLGA的浓度为0.05g/ml，含有PLGA的二氯甲烷溶液与色氨酸溶液的体积比为10:1。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中，所述的牛血清白蛋白水溶液的浓度为0.001g/ml-0.01g/ml，优选为0.005g/ml，牛血清白蛋白水溶液与步骤(I)得到的乳液的体积比5-6:1。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(3)中，在乳液中放入转子，在电磁搅拌条件下搅拌4小时，将乳液离心，离心速度3000rpm，时间IOmin,取上清，将上清再次离心，离心速度3000rpm,时间lOmin 。
7.按照权利要求2-6任一项所述的方法制备得到的色氨酸纳米微球。
8.如权利要求7所述的色氨酸纳米微球，其特征在于色氨酸纳米微球的载药量为[(27.18±0.51) Χ1(Γ3]% 以上。
9.一种用于治疗肿瘤疾病的药物，其特征在于所述的药物中的有效成分为色氨酸纳米微球。
全文摘要
本发明公开了一种色氨酸纳米微球在制备治疗肿瘤疾病药物中的用途。本发明利用乳化法纳米微球技术将色氨酸包埋使其进入肿瘤细胞，进而在细胞内释放大量外源色氨酸到肿瘤细胞浆，从而达到抗肿瘤的目的。研究表明，色氨酸纳米微球对人淋巴癌细胞系、乳腺癌细胞系、肺癌细胞系、直肠癌细胞系、子宫颈癌细胞系、脑瘤肿瘤细胞系和人白血病细胞系具有较强的杀伤作用，通过局部给药方式，该药物可对直肠癌细胞株裸鼠转移瘤的生长有明显的抑制作用。
文档编号A61K31/405GK103110623SQ20131002975
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月25日 优先权日2013年1月25日
发明者张志仁, 马和平, 杨宝峰, 刘小燕, 初文峰, 赵丹, 王秋石 申请人:哈尔滨医科大学