专利名称：一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子的制备方法及其N-末端氨基酸序列，本发明还涉及灰星鲨软骨血管生成抑制因子在制备抑制血管生成、防治肿瘤药物中的应用。
背景技术：
血管生成在人体发育和组织修复等正常生理过程中发挥重要作用，同时也是肿瘤、糖尿病性视网膜病、风湿性关节炎和慢性炎症等血管增生性疾病的重要病理特征之一。1970年，Folkman认为肿瘤的生长依赖于新生血管的生成,而通过抑制肿瘤的血管生成可达到治疗肿瘤的目的。目前，已有的研究证明当肿瘤的体积达到疒3 mm2以上时就必须依赖新生血管为其继续增殖提供必需的氧气和营养物质，而此时抑制肿瘤的血管生成,就会切断肿瘤的营养供给,导致肿瘤的退化、萎缩。因此，以抗血管生成为主的肿瘤生物治疗研究成为近十多年来抗肿瘤药物的研究热点。与常规抗肿瘤药物相比，肿瘤血管生成抑制剂具有许多优势:处于增生状态的血管有相对较高的靶分子表达，故肿瘤血管生成抑制剂治疗肿瘤具有良好的特异性。实体瘤生长和转移均须依赖血管生成，因而抗血管治疗具有广谱性。血管内皮细胞暴露于血流中，药物可直接发挥作用，故剂量小、疗效高、副作用相对较轻。内皮细胞基因表达相对稳定，不易产生耐药性。因此，抗血管生成的肿瘤治疗策略在未来的肿瘤治疗中将发挥重要的作用。申请人:研究发现，以灰星鲨软骨为原料，制备血管生成抑制因子的研究处于空白阶段，而灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1在制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物中的应用更是未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1的N-末端氨基酸序列，具有这种N-末端氨基酸序列的灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1显示强抑制血管生成活性。本发明的目的尚在于提供一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1的方法。本发明的目的还在于提供一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1的药理性质，以利用于制备药物。本发明为解决上述第一个技术问题所采取的技术方案为:一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1，其特征在于该血管生成抑制因子的N末端15个氨基酸残基的排列顺序为 DPGTCDYKGADEFAK SEQ ID NO:1，亦即 Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys SEQ ID NO: 1，分子量为 11.9 kDa，最适 pH 为 7.0-8.5，稳定 pH 为5.0_9.0 ο
本发明为解决上述第二个技术问题所采取的技术方案为:一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
O灰星鲨软骨蛋白粗提液的提取:将灰星鲨软骨破碎匀浆，按固液比I g:5^10 mL加入到浓度为1.0 mol/L盐酸胍溶液中，于4 °C以下振荡抽提2Γ36 h后，抽提溶液于4 V以下、5 000 r/min离心l(Tl5 min,去除残洛,收集上清液；上清液继续在4。(^下10 000r/min离心15 20 min,取上清液；将上清液装入截留分子量为8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液于4°C以下透析18 24 h，每隔6 h更换Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液I次，透析袋内溶液即为灰星鲨软骨蛋白粗提液。2)灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的制备:灰星鲨软骨蛋白粗提液置于4 °C以下预冷0.5 1 h，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置0.5 1 h后，于4 V以下10 000 r/min离心15 25 min,取离心上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%，静置0.5 I h后，4 °C以下、9 000 r/min离心15 25 min，取沉淀置于截留分子量为8kDa的透析袋内用双蒸水于4 1:以下透析18 24 h，每隔6 h更换双蒸水I次，透析液冷冻干燥，得灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分；
3)灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的离子交换层析纯化:将上述得到的灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分溶于Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液中，配成浓度为10 15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔滤膜过滤除去不溶物质，滤液加入到DEAE-52纤维素层析柱中，用水、
0.09 0.11 mol/L, 0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，洗脱速度为3 5mL/min,每5 mL洗脱液收集I试管,并根据每试管洗脱液280 nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，每一色谱峰为一组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分；
4)灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分的凝胶色谱纯化:将灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分溶于Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液，配成浓度为15 20 mg/mL溶液，用0.45微米微孔滤膜过滤除去不溶物质，滤液加入到Sephadex G_75层析柱中，用Tris-HCl (pH7.6)缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.8 1.5 mL/min,每3 mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液280 nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，每一色谱峰为一组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1j^反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测为单一峰，SDS-PAGE测定分子量为11.9 kDa。本发明为解决上述第三个技术问题所采取的技术方案为:一种灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1的应用，其特征在于BSFN-1对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成具有显著抑制作用；腹腔注射BSFN-1还可对荷Lewis肺癌小鼠肺癌组织的血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和血小板衍生生长因子(TOGF)三种促血管生成因子的表达有明显的抑制作用，BSFN-1具有安全无毒副作用和活性强等优点，可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。与现有技术相比，本发明的优点在于:提取、纯化工艺较简单，易于操作，制得的血管生成抑制因子活性显著，安全无毒，可用于肿瘤疾病的治疗。
图1是本发明实施例用DEAE-52纤维素离子交换层析柱进行分离纯化时所获得的分离峰图，其中横轴为接收试管数，纵向轴是280nm吸光度；
图2是本发明实施例用Sephadex G_75层析时所获得的分离峰图，其中横轴为接收试管数，纵向轴是280nm吸光度；
图3是本发明实施例用ZORBAX 300SB-C18 HPLC柱进行层析时所获得的分离峰图，其中横轴为洗脱时间t (min)，纵向轴是280nm吸光度(mAU)；
图4是本发明实施例用SDS-PAGE电泳-考马斯亮蓝染色法显示图，纵轴为分子量(kDa)，其中泳道为I标准分子量蛋白质，泳道2为BSFN-1电泳条带；
具体实施例方式以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。实施例:一种灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-1的制备方法，制备流程如下:灰星鲨软骨〃组织破碎〃盐酸胍抽提〃丙酮分级沉淀分〃离子交换层析纯化〃凝胶渗透色谱纯化〃血管生成抑制因子BSFN-1。I)灰星鲨软骨蛋白粗提液的提取:将灰星鲨软骨破碎匀浆，按固液比I g:8 mL加入到浓度为1.0 mol/L盐酸胍溶液中，于4 °C以下振荡抽提24 h后，抽提溶液于4 °C以下、5 000 r/min离心15 min,去除残洛,收集上清液；上清液继续在4。(^下10 000 r/min离心20 min，取上清液；将上清液装入截留分子量为8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH7.6)缓冲液于4°C以下透析24 h，每隔6 h更换Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液I次，透析袋内溶液即为灰星鲨软骨蛋白粗提液。2)灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的制备:灰星鲨软骨蛋白粗提液置于4 °C以下预冷I h，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置I h后，于4 °C以下10000 r/min离心15 min,取离心上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%,静置Ih后,4 °C以下、9 000 r/min离心15 min,取沉淀置于截留分子量为8 kDa的透析袋内用双蒸水于4 1:以下透析24 h，每隔6 h更换双蒸水I次，透析液冷冻干燥，得灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分；
3)灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的离子交换层析纯化:将上述得到的灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分溶于Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液中，配成浓度为10 mg/mL溶液，用0.45微米微孔滤膜过滤除去不溶物质，滤液加入到DEAE-52纤维素层析柱中，用水、0.10 mol/L、0.50 mol/L和1.00 mol/L NaCl溶液进行洗脱，洗脱速度为3 mL/min，每5 mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液280 nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图(图1)，每一色谱峰为一组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分；
4)灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分的凝胶色谱纯化:将灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分溶于Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液，配成浓度为15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔滤膜过滤除去不溶物质，滤液加入到S印hadex G-75层析柱中，用Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液进行洗脱，洗脱速度为1.0 mL/min，每3 mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液280 nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图(图 2)，每一色谱峰为一组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1。
所得的BSFN-1经反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测为单一峰(图3 )，所得的BSFN-1经12%的SDS-PAGE电泳-考马斯亮蓝染色法显示为一条带，分子量为11.9 kDa(图4)。将制得的BSFN-1作鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用的测定，测定方法参考贺国安、罗进贤、张添元等“改进的鸡胚绒毛尿囊膜技术一无气室孵育法”(记载于《中山大学学报(自然科学版)》，2003年第2册(第42卷):第126-128页)。结果表明，灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-1显著抑制鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成并呈剂量依赖关系(表I)
表I灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-1对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成的抑制作用
权利要求
1.一种灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-1，其特征在于该灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-1的N末端15个氨基酸残基的排列顺序为DPGTCDYKGADEFAK SEQ ID NO: 1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys,分子量为 11.9 kDa，最适pH 为 7.0-8.5，稳定 pH 为 5.0-9.0。
2.—种权利要求1所述的一种灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-1的制备方法，其特征在于包括以下步骤: O灰星鲨软骨蛋白粗提液的提取:将灰星鲨软骨破碎匀浆，按固液比I g:5^10 mL加入到浓度为1.0 mol/L盐酸胍溶液中，于4 °C以下振荡抽提2Γ36 h后，抽提溶液于4 V以下、5 000 r/min离心l(Tl5 min,去除残洛,收集上清液；上清液继续在4。(^下10 000r/min离心15 20 min,取上清液；将上清液装入截留分子量为8 kDa的透析袋中，利用Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液于4°C以下透析18 24 h，每隔6 h更换Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液I次，透析袋内溶液即为灰星鲨软骨蛋白粗提液； 2)灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的制备:灰星鲨软骨蛋白粗提液置于4°C以下预冷0.5 1 h，缓慢加入4 °C以下预冷的丙酮至其浓度为30%，静置0.5 1 h后，于4 °C以下10 000 r/min离心15 25 min,取离心上清液加入4 °C以下预冷的丙酮至丙酮浓度达60%,静置0.5 I h后，4 °C以下、9 000 r/min离心15 25 min，取沉淀置于截留分子量为8 kDa的透析袋内用双蒸水于4 1:以下透析18 24 h，每隔6 h更换双蒸水I次，透析液冷冻干燥，得灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分； 3)灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分的离子交换层析纯化:将上述得到的灰星鲨软骨蛋白粗提液活性组分溶于Tris-H Cl (pH 7.6)缓冲液中，配成浓度为10 15 mg/mL溶液，用0.45微米微孔滤膜过滤除去不溶物质，滤液加入到DEAE-52纤维素层析柱中，用水、0.09 0.11 mol/L,0.45 0.55 mol/L和0.90 1.10 mol/L NaCl溶液进行洗脱，洗脱速度为3 5mL/min,每5 mL洗脱液收集I试管,并根据每试管洗脱液280 nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，每一色谱峰为一组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分； 4)灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分的凝胶色谱纯化:将灰星鲨软骨蛋白离子交换层析活性组分溶于Tris-HCl (pH 7.6)缓冲液，配成浓度为15 20 mg/mL溶液，用0.45微米微孔滤膜过滤除去不溶物质，滤液加入到Sephadex G_75层析柱中,用Tris-HCl (pH7.6)缓冲液进行洗脱，洗脱速度为0.8 1.5 mL/min,每3 mL洗脱液收集I试管，并根据每试管洗脱液280 nm下的吸光度绘制洗脱组分曲线图，每一色谱峰为一组分，其中，对鸡胚绒毛尿囊膜(CAM)血管生成抑制作用最高组分为灰星鲨软骨血管生成抑制因子BSFN-1j^反相高效液相色谱(RP-HPLC)检测为单一峰，SDS-PAGE测定分子量为11.9 kDa。
3.权利要求1所述的一种灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-1可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。
全文摘要
本发明涉及一种灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-I及其制备方法和应用，该血管生成抑制因子的N末端15个氨基酸残基的排列顺序为DPGTGDYKGADEFAKSEQIDNO:1，亦即Asp-Pro-Gly-Thr-Gly-Asp-Tyr-Lys-Gly-Ala-Asp-Glu-Phe-Ala-Lys，分子量为11.9kDa。制备时将灰星鲨软骨匀浆，盐酸胍抽提，丙酮沉淀分级、以及离子交换层析和凝胶层析，得一单峰，即为抑制因子BSFN-I。灰星鲨血管生成抑制因子BSFN-I可用于制备抑制血管生成、防治肿瘤的药物。
文档编号A61K38/17GK103232537SQ20131006168
公开日2013年8月7日 申请日期2013年2月28日 优先权日2013年2月28日
发明者王斌, 罗红宇, 栗丽, 王玉梅 申请人:浙江海洋学院