穿心莲内酯及其衍生物在制备防治手足口病药物中的用途
【专利摘要】本发明涉及将一种现有的抗菌消炎药穿心莲内酯及其衍生物用作防治手足口病的新药，为穿心莲内酯类药物提供了新的用途。具体而言，本发明涉及穿心莲内酯类药物在制备治疗和/或预防手足口病病毒感染的药物中的用途。所述穿心莲内酯类药物，例如穿心莲内酯、新穿心莲内酯、穿心莲内酯磺化物、三乙酰穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯等，经药效学研究，表明穿心莲内酯及其衍生物是防治手足口病的高效药物，可以制成各种常用的剂型用于临床防治，具有疗效好、毒性低、价廉的特点。本发明为临床手足口病病人的防治提供了一种新的药物，为发现新的理论和药物作用新的靶点提供重要依据。
【专利说明】穿心莲内酯及其衍生物在制备防治手足口病药物中的用途
【技术领域】
[0001]本发明涉及穿心莲内酯类药物在制备治疗和/或预防手足口病病毒感染的药物中的用途，属于中医药领域。
【背景技术】
[0002]手足口病是由小RNA病毒科，肠道病毒属病毒引起的，现已成为危害婴幼儿健康和公共卫生安全的重要传染病。手足口病主要由肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)和柯萨奇病毒A16型(Coxsackievirus A16, CA 16)所引起。手足口病通常为一过性的感染，从感染到出现临床症状为3-6天，常在手、足、口部位出现丘疹、疱疹后不治自愈；但也有一部份病例，主要是小于3岁的婴幼儿，会出现严重的并发症，如病毒性脑膜炎，脑炎，类似小儿麻痹的瘫痪，以及心肌炎，心包炎，心肌病且病情进展迅速，引起的肺水肿、肺出血经常导致婴幼儿在I天内快速死亡，痊愈后往往也存有严重的后遗症。
[0003]流行病学资料显示，EV71和/或CA16弓丨起的手足口病已在世界范围内多次爆发流行，尤其是近10年来，手足口病流行在亚太地区猖獗，不仅发病人数多，而且死亡病例多。自2008年5月2日起，卫生部将手足口病纳入丙类法定传染病管理。此后，手足口病疫情在中国大陆蔓延，目前也仍得不到有效控制，据中国CDC的法定传染病疫情通报可知，每年中国大陆手足口病发病超过百万例，死亡近千例。
[0004]手足口病防治已迫在眉睫，可至今尚无有效的疫苗或药物来防治手足口病，从而控制疫情的蔓延。目前，EV71型手足口病灭活疫苗进入临床研究阶段，距离临床应用仍有一段距离，其成功与否仍是未知数；其它手足口病疫苗仍处于实验室研究阶段，短期内难以研究成功，预示着手足口病的防控在相当长的一段时间内不得不完全依赖药物对症治疗，就是疫苗有效也不能对所有的人全部保护，并且现在研制的疫苗不能用于特殊人群的接种。
[0005]目前，对于手足口病患者的临床治疗，无特效药，一般根据临床分期，采用对症辅助治疗的方案。用于治疗手足口病的药物，常使用利巴韦林和干扰素，在乳鼠动物模型中具有一定的疗效，且具有协同效果，但并没有大规模的临床验证；用于治疗重症手足口病患者的药物，根据《手足口病防控指南》，可以使用注射用丙种球蛋白和糖皮质激素冲击疗法，可是丙球来源受限，激素具有副作用，并且也没有循症医学的证据。尽管乳铁蛋白在实验室阶段，无论是在体内试验，还是在体外试验，均能防治EV71型手足口病病毒的感染，但在小规模的临床实验中并没有显示出有任何的防护效果；目前，仅有米力农(一种磷酸二酯酶抑制剂)在小规模的临床实验中报道对于EV71引起的肺水肿型重症病人有一定的治疗效果，但并没有进行大规模的临床试验。其它防治手足口病的药物均处于实验室研究阶段，距离临床应用尚有很大距离，例如石蒜碱通过抑制手足口病病毒的繁殖，病毒中和抗体通过阻断手足口病病毒感染，从而具有防治手足口病的能力，但石蒜碱存在毒性、中和抗存在抗体依赖感染增强现象，这类手足口病候选药物能否成为临床用药均是未知数。由此可见，在医学领域迫切需要发现和发展可以用来防治手足口病感染、同时具有副作用少、疗效高的新药物。
[0006]穿心莲为爵床科植物穿心莲的干燥地上部分，味苦，性寒。具有清热解毒、凉血消肿之功效。穿心莲内酯是穿心莲中提取的二萜内酯类化合物，是中药穿心莲的主要有效成分之一，临床上主要治疗上呼吸道感染、细菌性痢疾等。经现代药理学研究，发现穿心莲内酯不仅具有抗菌消炎作用，还具有抗肿瘤、保肝利胆、抗病毒作用。目前，穿心莲已经用于临床治疗肿瘤，有一定疗效。业已证明，穿心莲内酯在治疗各种感染性疾病造成的炎症性疾病中，均能取得较好的效果。关于穿心莲内酯抗病毒研究已有很多报道，穿心莲内酯对流感病毒、腺病毒有抑制作用，对疱疫病毒有一定的延缓作用；也具有抗黄病毒、痕病毒、丙肝病毒、SARS冠状病毒、HIV病毒等作用。穿心莲内酯还具有免疫调节的功能，抑制炎症时毛细血管通透性的增加，从而减少炎症渗出物的量；提高白细胞、中性粒细胞及巨噬细胞对细菌病毒的吞噬能力，提高血清中溶菌酶的含量，增加细胞免疫能力，从而具有广谱抗病原微生物作用。
[0007]由于现今穿心莲内酯的应用还处于开发阶段，未能使穿心莲内酯得到广泛的应用。利用穿心莲内酯磺化物喜炎平来治疗手足口病，在临床上有零星报道，但有效性证据仍不充分，目前尚未见在模型动物上研究的报道。本发明为穿心莲内酯类药物“老药新用”提供了新用途和作用机理，为穿心莲内酯类药物临床应用开拓了新前景。
【发明内容】
[0008]本发明的技术目的在于探究穿心莲内酯类药物在制备治疗和/或预防手足口病的药物中的新用途。
[0009]因此，本发明的第一方面提供一种穿心莲内酯类药物在制备治疗和/或预防手足口病病毒感染的药物中的新用途。其中所述穿心莲内酯药物为穿心莲内酯、新穿心莲内酯、穿心莲内酯磺化物、三乙酰穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯等，优选地，所述穿心莲内酯类药物为穿心莲内酯磺化物(喜炎平)。其中所述手足口病病毒为EV71、CA16、埃可病毒，优选地，手足口病病毒为EV71、CA16，更优选地，手足口病病毒为EV71。
[0010]本发明的第二个方面提供一种防治手足口病的穿心莲内酯类药物组合物，所述药物组合物包含安全、有效剂量范围内的穿心莲内酯类药物和药学上可接受的载体。其中，穿心莲内酯类药物的安全、有效剂量根据治疗对象的年龄、体重、病情、病程、给药途径等具体情况来确定，6岁以下的儿童一般为5-20mg/kg.day,分一次或者多次给药。特别地，穿心莲内酯类药物组合物也可以和临床上其它药物，例如利巴韦林、米力农等联合使用。
[0011]优选地，所述药物的剂型为注射剂、口服剂、吸入剂、喷雾剂、滴鼻剂。特别指出，药学上可接受的载体取决于穿心莲内酯类药物的剂型，包括糖、淀粉、植物油、稳定剂等。
[0012]换言之，本发明利用EV71或/和CA16型手足口病病毒攻击7日龄乳鼠建立了致死性动物模型，并证明炎性细胞免疫过强、获得性免疫衰竭和以促炎因子、趋化因子等引起的细胞因子“风暴”是手足口病免疫损伤致病的主要机制，针对免疫系统的适时干预在治疗手足口病病毒感染所导致的损伤中，有可能发挥重要作用。本发明利用穿心莲内酯类药物干预野生型乳鼠后再用手足口病病毒攻击所述乳鼠，或者手足口病病毒攻击乳鼠后再用穿心莲内酯类药物治疗之，结果说明，穿心莲内酯类药物无论是在预防或/和治疗手足口病病毒感染中均发挥了重要的保护作用，而药物载体对照组均未发挥防治作用。因此，本发明证明了免疫损伤在手足口病病理过程中发挥重要作用，而穿心莲内酯类药物可以阻止或减缓手足口病病毒感染所造成的严重后果。
[0013]本发明的特点是提出穿心莲内酯类药物具有防治手足口病的作用，为发现新理论和药物作用新靶点提供重要依据。
[0014]下面参考实施例对本发明作进一步说明。给出这些实施例只是为了举例说明，它们不以任何方式限制本发明的范围。
【专利附图】
【附图说明】
[0015]图1:7日龄ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平或生理盐水至第5天。记录其14天内存活情况，绘制死亡率曲线。每组8只小鼠。
[0016]图2:7日龄ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平或生理盐水至第5天。记录其14天内体重,绘制体重变化曲线。每组8只小鼠。
[0017]图3:7日龄ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平或生理盐水至第5天。记录其14天内临床疾病得分情况，绘制疾病得分变化曲线。每组8只小鼠。打分标准:0:健康；1:精神萎靡，活动减少；2:竖毛，弓背，共济失调；3:消瘦，体重呈负增长；4:四肢麻痹；5:濒死；6:死亡。
[0018]图4:7日龄ICR乳鼠感染1.25X 107TCID5Q的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株，
从感染后第4天起，每天腹腔给予喜炎平或生理盐水。记录其14天内存活情况，绘制死亡率曲线。每组8只小鼠。
[0019]图5:7日龄ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，从感染后第4天起，每天腹腔给予喜炎平或生理盐水。记录其14天内体重，绘制体重变化曲线。每组8只小鼠。
[0020]图6:7日龄ICR乳鼠感染1.25X 107TCID5Q的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，从感染后第4天起，每天腹腔给予喜炎平或生理盐水。记录其14天内临床疾病得分情况，绘制疾病得分变化曲线。每组8只小鼠。打分标准:0:健康；1:精神萎靡，活动减少；2:竖毛，弓背，共济失调；3:消瘦，体重呈负增长；4:四肢麻痹；5:濒死；6:死亡。
[0021]图7:7日龄ICR乳鼠感染1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07毒株后，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平或生理盐水至第5天。于感染后第6天，拍摄乳鼠照片(A)，并取乳鼠肌肉组织(B)和脑组织(C)进行组织病理检测。每组5只小鼠。
[0022]图8:7日龄ICR乳鼠感染1.5\1081^105(|的0416型手足口病病毒耵08/07毒株后，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平或生理盐水至第5天。记录其14天内存活情况，绘制死亡率曲线。每组8只小鼠。
[0023] 图9:7日龄ICR乳鼠感染1.5 X 18TCID5tl的CA16型手足口病病毒BJ08/07毒株，从感染后第4天起，每天腹腔给予喜炎平或生理盐水。记录其14天内存活情况，绘制死亡率曲线。每组8只小鼠。
【具体实施方式】
[0024]下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。
[0025]下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
[0026]实施例1:喜炎平可以预防EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠死亡
[0027]实验材料:
[0028]I)主要实验仪器:二级生物安全柜(军事医学科学院实验动物中心)、小鼠饲养笼(军事医学科学院实验动物中心)、无菌胰岛素注射器(购自美国BD公司)等。
[0029]2)主要实验试剂:喜炎平(购自江西青峰药业有限公司)、注射用生理盐水(购自石家庄四药有限公司)、消毒剂(84消毒液和75%酒精)等。
[0030]3)病毒:EV71型手足口病病毒BJ09/07株(GenBank JQ319054.1)，分离自临床手足口病患儿样本。
[0031]4)实验动物:SPF级7日龄ICR乳母鼠，购于军事医学科学院实验动物中心。
[0032]实验方法:
[0033]I)分组:喜炎平预防组、生理盐水对照组；
[0034]2)用无菌胰岛素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理盐水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平或生理盐水至第5天；
[0035]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠头部向下，腹部向外姿势，用无菌胰岛素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07株病毒液，感染病毒滴度为每只1.25X 17TCID50,每组8只乳鼠；
[0036]4)将乳鼠放置于鼠笼内，给予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0037]5)感染后每天15时观察，4天内发生死亡的小鼠为非特异死亡，在进行统计时不予计算在内；
[0038]6)连续观察14天，每天记录每组小鼠存活只数、体重以及临床疾病得分情况；
[0039]7)用Graphpad Prism5软件统计小鼠死亡率、体重变化、临床疾病得分情况。
[0040]实验结果:
[0041]7日龄ICR乳鼠经腹腔注射喜炎平或生理盐水至感染第5天后，感染病毒滴度为
1.25 X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07株后的乳鼠死亡率、体重变化以及临床得分结果如图1、图2、图3所示。
[0042]感染相同滴度的BJ09/07株EV71型手足口病病毒后，注射生理盐水的乳鼠死亡率明显高于注射喜炎平的乳鼠(图1)，而体重变化结果(图2)、临床得分结果(图3)与死亡率结果一致。*P < 0.05
[0043]此结果说明，喜炎平可以有效预防EV71型手足口病病毒感染所导致的严重病情，具有预防作用。
[0044]实施例2:喜炎平可以治疗EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠死亡
[0045]实验材料:
[0046]I)主要实验仪器:二级生物安全柜、小鼠饲养笼、无菌注射器等。
[0047]2)主要实验试剂:喜炎平、注射用生理盐水对照、消毒剂等。
[0048]3)病毒:EV71型手足口病病毒株BJ09/07。
[0049]4)实验动物:SPF级7日龄ICR乳母鼠，购于军事医学科学院实验动物中心。
[0050]实验方法:
[0051]I)分组:喜炎平治疗组、生理盐水对照组；
[0052]2)安全固定乳鼠，保持乳鼠头部向下，腹部向外姿势，用无菌胰岛素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07病毒液，感染病毒滴度为每只1.25 X 17TCID50,每组8只乳鼠；
[0053]3)用无菌胰岛素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理盐水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升,从感染后第4天起,每天腹腔给予喜炎平或生理盐水；
[0054]4)将乳鼠放置于鼠笼内，给予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0055]5)感染后每天15时观察，4天内发生死亡的小鼠为非特异死亡，在进行统计时不予计算在内；
[0056]6)连续观察14天，每天记录每组小鼠存活只数、体重以及临床疾病得分情况；
[0057]7)用Graphpad Prism5软件统计小鼠死亡率、体重变化、临床疾病得分情况。
[0058]实验结果:
[0059]7日龄ICR乳鼠从感染后第4天经腹腔注射喜炎平或生理盐水治疗，感染病毒滴度为1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07株后的乳鼠死亡率、体重变化以及临床得分结果如图4、图5、图6所示。
[0060]感染相同滴度的BJ09/07株EV71型手足口病病毒后，注射生理盐水对照的乳鼠死亡率明显高于注射喜炎平的乳鼠(图4)，而体重变化结果(图5)、临床疾病得分结果(图6)与死亡率结果一致。*P < 0.05
[0061]此结果说明，喜炎平可以有效治疗EV71型手足口病病毒感染所导致的严重疾病，具有治疗作用。
[0062]实施例3:喜炎平可以缓解EV71型手足口病病毒BJ09/07株感染所致乳鼠脑组织、肌肉组织病理损伤
[0063]实验材料:
[0064]I)主要实验仪器:二级生物安全柜、小鼠饲养笼、无菌注射器、小动物手术器械、组织切片机、组织包埋机、显微镜等。
[0065]2)主要实验试剂:喜炎平、注射用生理盐水对照、多聚甲醛固定液、无菌PBS、消毒剂等。
[0066]3)病毒:EV71型手足口病病毒株BJ09/07。
[0067]4)实验动物:SPF级7日龄ICR乳母鼠，购于军事医学科学院实验动物中心。
[0068]实验方法:
[0069]I)分组:喜炎平预防组、生理盐水对照组；
[0070]2)用无菌胰岛素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理盐水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平或生理盐水至第5天；
[0071]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠头部向下，腹部向外姿势，用无菌胰岛素注射器腹腔注射EV71型手足口病BJ09/07病毒液，感染病毒滴度为每只1.25 X 17TCID50,每组5只乳鼠；
[0072]4)将乳鼠放置于鼠笼内，给予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0073]5)感染后每天15时观察，4天内发生死亡的小鼠为非特异死亡；
[0074]6)感染病毒后第6天，拍摄乳鼠照片后用腹腔注射过量麻醉剂的方法致死乳鼠；
[0075]7)将乳鼠固定于小动物手术台，移除皮肤及头盖骨，暴露脑，将鼠脑取出，再移除后肢皮肤，暴露后肢肌肉，将后肢肌肉取出，用无菌PBS洗去表面血液，置于4%多聚甲醛固定液中室温固定48小时；
[0076]8)固定后的样品由军事医学科学院疾病预防控制所病理实验室进行包埋、切片、HE染色等处理；
[0077]9)病理切片置于显微镜下观察，记录。
[0078]实验结果:
[0079]从图7A中可见，生理盐水对照组小鼠发生了严重的瘫痪现象，而喜炎平组表现正常，这也从图7B和C(*200倍，HE染色)病理照片所显示的一致:感染病毒滴度为
1.25X 17TCID50的EV71型手足口病病毒BJ09/07后，腹腔注射生理盐水对照的13日龄的ICR乳鼠肌肉组织(B)、脑组织(C)中出现严重的病理损伤。肌肉组织正常结构被破坏，肌肉组织纹理紊乱，出现肌纤维断裂，炎性渗出、炎症细胞浸润等病理损伤，而脑组织中出现大量炎症细胞浸润，神经细胞减少；
[0080]感染相同滴度的 EV71型手足口病BJ09/07病毒后，注射喜炎平的乳鼠肌肉组织病理损伤明显减轻(B)，无明显的肌肉纤维断裂，仅有轻微的炎症细胞浸润，并且脑组织中炎症细胞浸润明显减轻(C)。
[0081]此结果说明，喜炎平可以有效减轻EV71型手足口病病毒感染所导致的严重免疫病理损伤，从而改善临床症状及预后。
[0082]实施例4:喜炎平可以预防CA16型手足口病病毒BJ08/06株感染所致乳鼠死亡
[0083]实验材料:
[0084]I)主要实验仪器:二级生物安全柜、小鼠饲养笼、无菌注射器等。
[0085]2)主要实验试剂:喜炎平、注射用生理盐水、消毒剂等。
[0086]3)病毒:CA16型手足口病病毒株BJ08/07 (GenBank: JX068833)，分离自临床手足口病患儿样本。
[0087]4)实验动物:SPF级7日龄ICR乳母鼠:购于军事医学科学院实验动物中心。
[0088]实验方法:
[0089]I)分组:喜炎平预防组、生理盐水对照组；
[0090]2)用无菌胰岛素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理盐水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平或生理盐水至第5天；
[0091]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠头部向下，腹部向外姿势，用无菌胰岛素注射器腹腔注射CA16型手足口病BJ08/07病毒液，感染病毒滴度为每只1.5 X 18TCID5tl，每组8只乳鼠；
[0092]4)将乳鼠放置于鼠笼内，给予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0093]5)感染后每天15时观察，4天内发生死亡的小鼠为非特异死亡，在进行统计时不予计算在内；
[0094]6)连续观察14天，每天记录每组小鼠存活只数、体重以及临床疾病得分情况；
[0095]7)用Graphpad Prism5软件统计小鼠死亡率、体重变化、临床疾病得分情况。
[0096]实验结果:
[0097]7日龄ICR乳鼠经腹腔注射喜炎平或生理盐水至感染第5天后，感染病毒滴度为
1.5 X 18TCID50的CA16型手足口病病毒BJ08/07株后的乳鼠死亡率结果如图8所示。
[0098]感染相同滴度的BJ08/07株CA16型手足口病病毒后，注射生理盐水对照的乳鼠死亡率明显高于注射喜炎平的乳鼠(图8)，而体重变化结果、临床疾病得分结果与死亡率结果一致。*P < 0.05
[0099]此结果说明，喜炎平可以有效预防CA16型手足口病病毒感染所导致的严重病情，具有预防作用。
[0100]实施例5:喜炎平可以治疗CA16型手足口病病毒BJ08/07株感染所致乳鼠死亡
[0101]实验材料:
[0102]I)主要实验仪器:二级生物安全柜、小鼠饲养笼、无菌注射器等。
[0103]2)主要实验试剂:喜炎平、注射用生理盐水、消毒剂等。
[0104]3)病毒:CA16型手足口病病毒株BJ08/07
[0105]4)实验动物:SPF级7日龄ICR乳母鼠，购于军事医学科学院实验动物中心。
[0106]实验方法:
[0107]1)分组:喜炎平治疗组、生理盐水对照组；
[0108]2)安全固定乳鼠，保持乳鼠头部向下，腹部向外姿势，用无菌胰岛素注射器腹腔注射CA16型手足口病BJ08/07病毒液，感染病毒滴度为每只1.5 X 18TCID5tl，每组8只乳鼠；
[0109]3)用无菌胰岛素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或注射用生理盐水，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，从感染后第4天起，每天腹腔给予喜炎平或生理盐水；
[0110]4)将乳鼠放置于鼠笼内，给予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0111]5)感染后每天15时观察，4天内发生死亡的小鼠为非特异死亡，在进行统计时不予计算在内；
[0112]6)连续观察14天，每天记录每组小鼠存活只数、体重以及临床疾病得分情况；
[0113]7)用Graphpad Prism5软件统计小鼠死亡率、体重变化、临床疾病得分情况。
[0114]实验结果:
[0115]7日龄ICR乳鼠从感染后第4天经腹腔注射喜炎平或注射用生理盐水治疗，感染病毒滴度为1.5 X 18TCID50的CA16型手足口病病毒BJ08/07株后的乳鼠死亡率结果如图9所示。
[0116]感染相同滴度的BJ08/07株CA16型手足口病病毒后，注射生理盐水对照的乳鼠死亡率明显高于注射喜炎平的乳鼠(图9)，而体重降低结果、临床得分结果与死亡率结果一致。*P < 0.05
[0117]此结果说明，喜炎平可以有效治疗CA16型手足口病病毒感染所导致的严重疾病，具有治疗作用。
[0118]实施例6:喜炎平可以预防或/和治疗EV71型或/和CA16型手足口病病毒不同毒株感染所致乳鼠死亡
[0119]实验材料:
[0120]I)主要实验仪器:二级生物安全柜、小鼠饲养笼、无菌胰岛素注射器等。
[0121]2)主要实验试剂:喜炎平、注射用生理盐水、消毒剂等。
[0122]3)病毒:EV71型手足口病病毒TS株(GenBank JQ708210.1) ,CA16型手足口病病毒TS10/08 (GenBank: JX068829)，均分离自临床手足口病患儿样本。
[0123]4)实验动物:SPF级7日龄ICR乳母鼠，购于军事医学科学院实验动物中心。
[0124]实验方法:
[0125]I)分组:喜炎平预防组、喜炎平治疗组、生理盐水对照组；
[0126]2)用无菌胰岛素注射器乳鼠腹腔注射喜炎平或生理盐水，预防组，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，分别在感染前4小时，感染后每天腹腔给予喜炎平至第5天；治疗组，每只乳鼠腹腔注射喜炎平10mg/kg.day,每次50微升，从感染后第4天起，每天腹腔给予喜炎平；
[0127]3)安全固定乳鼠，保持乳鼠头部向下，腹部向外姿势，用无菌胰岛素注射器腹腔注射EV71型手足口病TS株病毒液，感染病毒滴度为每只17PFU,每组8只乳鼠，或者用无菌胰岛素注射器腹腔注射CA16型手足口病毒TS10/08株病毒液，感染病毒滴度为每只
2.5 X 19TCID50 ；
[0128]4)将乳鼠放置于鼠笼内，给予母鼠水和食物，乳鼠自由采食母乳；
[0129]5)感染后每天15时观察，4天内发生死亡的小鼠为非特异死亡，在进行统计时不予计算在内；
[0130]6)连续观察14天，每天记录每组小鼠存活只数、体重以及临床疾病得分情况；
[0131]7)用Graphpad Prism5软件统计小鼠死亡率、体重变化、临床疾病得分情况。
[0132]实验结果:
[0133]7日龄ICR乳鼠经腹腔注射喜炎平或生理盐水后，感染相同滴度的EV71型/CA16型手足口病病毒后，注射生理盐水的乳鼠死亡率明显高于注射喜炎平的乳鼠，而体重变化结果、临床得分结果与死亡率结果一致。*P<0.05
[0134]此结果说明，喜炎平可以有效预防或/和治疗EV71型/CA16型手足口病病毒感染所导致的严重病情，具有防治作用。
【权利要求】
1.穿心莲内酯类药物在制备治疗和/或预防手足口病病毒感染的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的穿心莲内酯类药物，包括穿心莲内酯及其衍生物，例如穿心莲内酯、新穿心莲内酯、穿心莲内酯磺化物、三乙酰穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯等。
3.如权利要求1所述的穿心莲内酯类药物的应用，其特征在于穿心莲内酯类药物可以制成各种剂型应用，如注射型穿心莲内酯磺化物、口服型穿心莲内酯滴丸、喷雾型穿心莲内酷等。
4.如权利要求1所述的手足口病病毒，包括71型肠道病毒(EV71)、A16型柯萨奇病毒(CA16)、埃可病毒等手足口病病毒。
5.如权利要求1所述的治疗和/或预防手足口病病毒感染的穿心莲内酯类药物，其特征在于，该类药物可以单独使用，也可以与现有的防治手足口病的其他药物联合使用。
6.如权利要求1-5所述的治疗和/或预防手足口病病毒感染的穿心莲内酯类药物可用于不同年龄的手足口病感染人群。
【文档编号】A61K31/7048GK104042621SQ201310093766
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2013年3月14日 优先权日:2013年3月14日
【发明者】赵忠鹏, 王希良, 任忠义, 谢宁, 管晨, 王玉光 申请人:中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所, 江西青峰药业有限公司, 首都医科大学附属北京中医医院