一种有机金属钌缀合蛋白及其制备方法与应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种有机金属钌缀合蛋白及其制备方法与应用，该方法包括：在pH值为7-8且浓度为10-100mM的缓冲溶液中，将有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白进行接触，所述有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白的摩尔比为1-20：1，所述血清蛋白为氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示的血清白蛋白或氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示的转铁蛋白。通过上述技术方案，本发明获得了靶向性强和抗肿瘤活性较高的有机金属钌缀合蛋白，而且还为更进一步理解有机金属钌抗肿瘤药物的转运机制和分子作用机理、以及以血清蛋白为载体制备纳米控释型金属抗肿瘤药物提供了实验和理论依据。
【专利说明】一种有机金属钌缀合蛋白及其制备方法与应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种有机金属钌缀合蛋白及其制备方法与应用，具体地，涉及一种由血清白蛋白或转铁蛋白与有机金属钌抗肿瘤药物构成的有机金属钌缀合蛋白的制备方法以及由该方法制得的有机金属钌缀合蛋白，以及所述有机金属钌缀合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。
【背景技术】
[0002]顺钼及其它钼类抗肿瘤药物的成功应用刺激了无机药物化学的发展，因此人们把目光投向了其它过渡金属化合物的药物活性研究，其中钌基抗肿瘤药物活性的研究最受瞩目，有机金属钌化合物[(n6_arene)Ru(en)Cl]PF6 (arene=苯的同系物；en=乙二胺)已被体内体外实验证实是一种有效的抗肿瘤候选药物。
[0003]但是，目前的有机金属钌化合物在体内的靶向性和抗肿瘤活性仍然较低，还远远不能满足临床应用的要求。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种靶向性强和抗肿瘤活性高的由有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白形成的有机金属钌缀合蛋白及其制备方法与应用。
[0005]为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种有机金属钌缀合蛋白的制备方法，该方法包括:在PH值为7-8且浓度为1-1OOmM的缓冲溶液中，将有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白进行接触，所述有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白的摩尔比为1-20:1，所述血清蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的血清白蛋白或氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的转铁蛋白。
[0006]另一方面，本发明提供了由上述方法制得的有机金属钌缀合蛋白。
[0007]再一方面，本发明还提供了上述方法制得的有机金属钌缀合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。
[0008]通过上述技术方案，本发明获得了靶向性强和抗肿瘤活性较高的有机金属钌缀合蛋白，而且还为更进一步理解有机金属钌抗肿瘤药物的转运机制和分子作用机理、以及以血清蛋白为载体制备纳米控释型金属抗肿瘤药物提供了实验和理论依据。
[0009]特别地，本发明的发明人发现，采用本申请中氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的血清白蛋白或氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的转铁蛋白制得的有机金属钌缀合蛋白的抗肿瘤活性明显高于采用其他血清蛋白(如血红蛋白)制得的有机金属钌缀合蛋白的抗肿瘤活性。此外，本发明的发明人还发现，在相同的条件下，除有机金属钌化合物以外的金属抗肿瘤化合物(如顺钼)与血清蛋白接触后并不能获得靶向性强和抗肿瘤活性高的金属药物缀合蛋白。
[0010]本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
【专利附图】
【附图说明】
[0011]附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的【具体实施方式】一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中:
[0012]图1为在激光共聚焦显微镜下观察到的按照实施例1的方法制得的TMR-有机金属钌缀合蛋白被MCF-7细胞摄取的结果图，上图为TMR-Tf (Tf=转铁蛋白)孵育后细胞中荧光标记的蛋白摄取情况图，下图为经按照实施例1的方法制得的TMR-Tf-6孵育后细胞中荧光标记的有机金属钉缀合蛋白的摄取情况图；
[0013]图2为实施例1制得的有机金属钌缀合蛋白Tf-3和Tf-6以及对比例4制得的顺钼缀合蛋白(Tf-顺钼)的抑制活性曲线图；
[0014]图3为实施例2制得的有机金属钌缀合蛋白HA-3和HA_5以及对比例4制得的顺钼缀合蛋白(HA-顺钼)(HA=血清白蛋白)的抑制活性曲线图。
【具体实施方式】
[0015]以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的【具体实施方式】仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0016]本发明提供的有机金属钌缀合蛋白的制备方法包括:在pH值为7-8 (优选为
7.2-7.5)且浓度为1-1OOmM (优选为20_50mM)的缓冲溶液中，将有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白进行接触，所述有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白的摩尔比为1-20:1 (优选为5-10:1)，所述血清蛋白为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的血清白蛋白或氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的转铁蛋白。
[0017]本发明中，对所述接触的条件没有特别的限定，例如，所述接触的条件可以包括接触的温度为30-40°C (优选为35-37°C)，接触的时间为24-72h (优选为45_50h)。
[0018]本发明中，采用各个参数值中的至少一个偏离上述范围的方案制得的有机金属钌缀合蛋白比本发明方法制得的靶向性和抗肿瘤活性低得多，很难满足临床应用的要求。而控制各参数值中的至少一个在上述优选范围内时能进一步提高有机金属钌缀合蛋白的靶向性和/或抗肿瘤活性。
[0019]在本发明中，在未作相反说明的情况下，术语“转铁蛋白”可以指含铁的转铁蛋白，也可以指不含铁的转铁蛋白，但是，本发明的发明人发现，使用含铁的转铁蛋白能够获得靶向性和/或抗肿瘤活性进一步增强的有机金属钌缀合蛋白。因此，本发明中的转铁蛋白优选为含铁的转铁蛋白。
[0020]本发明中，在未作相反说明的情况下，缓冲溶液的浓度指的是缓冲溶液中各个缓冲组分的总浓度。所述缓冲溶液可以为各种不会使血清蛋白变性的缓冲溶液，优选地，所述缓冲溶液为三乙胺乙酸酯缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液和磷酸盐缓冲溶液中的一种。本发明中的缓冲溶液可以通过商购获得，也可以自行配制，配制的方法为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。
[0021] 本发明中，所述有机金属钌抗肿瘤药物可以为本领域常用的具有抗肿瘤活性的有机金属钌化合物，优选情况下，所述有机金属钌抗肿瘤药物为式(I)所示的物质(可以参见文献 “Morris, R.E.; Aird, R.E.;Murdoch, P.D.; Chen, H.Μ.; Cummings, J.; Hughes, N.D.; Parsons, S.; Parkin, A.;Boyd, G.; Jodrellj D.1.; Sadler, P.J.J.Med.Chem.2001，44，3616”和 “Wang, F.Y.; Habtemariam, A.; van der Geer, E.P.L.; Fernandez, R.; Melchart, M.;Deeth, R.J.; Aird, R.; Guichard, S.; Fabbiani, F.P.A.; Lozano-Casal, P.; Oswald, 1.D.H.;Jodrell,D.1.;Parsons, S.; Sadler, P.J.Proc.Natl.Acad.Sc1.U.S.A.2005，102，18269” 合成得到)。
[0022]式(I)中，A优选为通式(2) - (8)所示结构中的一种，其中，钌与A所示结构中的苯环通过有机金属(C-M)键配位，同时，钌与-NH2中的N通过配位键螯合。使用具有以下结构式的有机金属钌化合物作为有机金属钌抗肿瘤药物可以获得具有更高抗肿瘤活性的有机金属钉缀合蛋白。
[0023]
【权利要求】
1.一种有机金属钌缀合蛋白的制备方法，其特征在于，该方法包括:在PH值为7-8且浓度为1-1OOmM的缓冲溶液中，将有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白进行接触，所述有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白的摩尔比为1-20:1，所述血清蛋白为氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的血清白蛋白或氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的转铁蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述接触的条件包括接触的温度为30-40°C，接触的时间为24-72h。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述有机金属钌抗肿瘤药物与血清蛋白的摩尔比为5-10:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述缓冲溶液的pH值为7.2-7.5，浓度为20_50mM。
5.根据权利要求1或4所述的方法，其中，所述缓冲溶液为三乙胺乙酸酯缓冲溶液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液和磷酸盐缓冲溶液中的一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述有机金属钌抗肿瘤药物为下式(I)所示的物质，
式(I)中，A为通式(2) - (8)所示结构中的一种，
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述转铁蛋白为含铁的转铁蛋白。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括将接触后的产物通过超滤膜，所述超滤膜的截留分子量为lOkDa。
9.由权利要求1-8中任意一项所述的方法制得的有机金属钌缀合蛋白。
10.权利要求9所述的有机金属钌缀合蛋白在制备抗肿瘤药物中的用途。
【文档编号】A61K47/48GK104072607SQ201310109645
【公开日】2014年10月1日 申请日期:2013年3月29日 优先权日:2013年3月29日
【发明者】汪福意, 郭伟, 罗群, 李鲜婵 申请人:中国科学院化学研究所