专利名称：双核锌配合物与制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双核锌配合物与制备方法及其应用，具体是双核锌配合物在化学核酸酶领域和抗癌药物领域中的应用。
背景技术：
近年来，癌症发病率一直处于上升状态，对癌症的治疗显得尤其紧迫，因此开发新型有效的抗癌药物是当今世界十分迫切的重要课题。上世纪60年代末，顺钼抗肿瘤作用的发现及临床应用，开辟了金属配合物抗肿瘤药物研究的新领域，随着人们对金属配合物的药理作用认识的进一步深入，新的高效、低毒、具有抗肿瘤活性的金属配合物不断被合成出来。致癌就是正常细胞向癌细胞的突变，从化学角度来说就是细胞核DNA的癌化；因此，DNA的定位断裂与重组技术是分子生物学和抗癌药物研究的核心技术。在生物演化过程中产生了许多天然核酸酶，其活性中心需要金属离子的参与。但天然核酸酶的品种、数量、价格和特异性识别的碱基数远不能满足急速增长的需要。为了克服天然限制性内切酶的缺点，人们模拟天然核酸酶的结构，设计合成系列化学核酸酶，将之用于与核酸的相互作用、核酸定点定位切割，这方面的研究已经成为化学生物学的热点和最为活跃的前沿研究领域之一。·
研究化学核酸酶具有很重要的理论价值和应用价值:(I)化学核酸酶可以作为许多天然核酸酶的模型，有助于我们深入了解天然核酸酶的催化机理；(2)它作为化疗药物有望用于治疗癌症以及遗传疾病，作为DNA结构探针可用于研究DNA的结构以及蛋白质与DNA的相互作用等；(3)化学核酸酶与DNA结合大分子的偶联体具有定点切割的特性，可以作为重要的分子生物工具，弥补天然核酸酶的缺陷，这也是研究人工核酸酶的终极目标。化学核酸酶切割DNA的主要方式可分为氧化性断裂和水解性断裂，水解性断裂是生物体内降解核酸所采取的模式，而氧化性断裂常需要在体系中加入额外的辅助试剂或用一定频率的光照射，生成羟基自由基或单线态氧等活性物种，以氧化还原反应机理断裂核酸。无论机理如何，这些化学合成的选择性切割DNA/RNA的化学核酸酶可以通过改变配体或金属的种类、结构、大小等来调节它们对DNA或RNA的相互识别，因而可能具有高度的底物专一性，从而避免了天然核酸酶的缺点。因此，探讨化学结构与化学核酸酶活性的关系，寻求和合成高效的、具有专一性的小分子化学核酸酶仍是生物无机化学研究中十分活跃的研究领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种双核锌配合物与制备方法及其应用。本发明主配体L为多吡啶类多齿配体，含有丰富的配位点，可与两个锌离子螯合配位。使用常规的溶液合成法，可得到目标化合物。即多吡啶双核锌化合物对DNA有良好的键合和切割效果，并且对Hela细胞具有较好的抗癌活性。本发明制备方法简单，可靠。
本发明提供的双核锌配合物的化学式为[Zn2L(OAc)2(CH3OH)4] (ClO4)2，其中L为4，4’ - 二〔N，N- 二(吡啶-2-甲基)〕二氨基二苯甲烷，OAc为醋酸根。本发明提供的双核锌配合物晶体属于单斜晶系，空间群为C2/c，晶胞参数为:a=32.809(7)A, b=8.8990(18) A, c= 19.459(4) Α, β = 117.93(3)。，Z = 4，单胞体积
V=5020(2)A3。本发明提供的双核锌化合物的结构为:目标化合物的非对称基本单元由一个[Zn2L(OAc)2(CH3OH)4]2+阳离子和外界的两个高氯酸跟阴离子组成。每个配体与两个锌离子参与配位，两个锌离子之间的距离约为9.463 A;锌离子均采取六配位的八面体配位构型；每一个锌离子与配体L的两个吡啶氮原子和一个叔胺氮原子配位，另外还与一个醋酸根和两个乙醇分子配位。本发明提供的双核锌化合物的制备方法如下=Zn(OAc)2.2Η20和配体L.XHClO4按比例混合，溶于体积比为1:1的乙腈和乙醇的混合溶剂中，加入三乙胺调节体系pH = 7;常温搅拌反应5-10小时，反应液过滤；滤液静置5-7天后析出针状晶体即为产物。所述的Zn (OAc)2.2Η20和配体L.xHC104的摩尔比为2:1。所述三乙胺的量与L.XHClO4的量的摩尔比为1:1。电子吸收光谱实验和荧光淬灭实验证实所述化合物与CT-DNA之间有中等键合的插入作用。琼脂糖电泳实验证明，在添加H2O2的情况下，所述化合物对pBR322 DNA有明显的切割效果。MTT实验表明 所述化合物对HeLa细胞具有较好的抗癌活性，可作为潜在的抗癌药物。本发明提供的双核锌化合物对DNA有良好的键合和切割效果，并且对Hela细胞具有较好的抗癌活性。本发明制备方法简单，可靠。
图1:双核锌化合物的阳离子单元结构图。图2:加入不同量的CT-DNA后，锌化合物的电子吸收光谱变化示意图。图3:化合物与EB竞争的荧光淬灭实验。图4:添加H2O2后，锌化合物对pBR322 DNA的浓度依赖切割实验。图5:添加H2O2后，锌化合物对pBR322 DNA的切割机理实验。
具体实施例方式本发明参照实施例详细说明如下:主配体L.XHC104的合成:将5.83g(35.5mmol)的2_氯甲基卩比唳盐酸盐溶于7mL蒸懼水中并不断搅拌，缓慢加入1.48g(7.46mmol)4,4/ -二氨基二苯甲烷的15mL乙醇溶液，待二者混合均匀后，将
2.37g(59.3mmol)Na0H的7mL水溶液缓慢滴入体系中，常温避光反应两周，停止搅拌，溶液分层，下层为黑红色油状物。将上述反应液用3x20mL 二氯甲烷萃取，收集有机层溶液，用无水MgS04干燥I小时，旋蒸除去溶剂，得到红色油状物，将其溶于SOmL的无水乙醇中，再缓慢滴加浓高氯酸，产生黄褐色L.XHC104沉淀，过滤，95%甲醇重结晶，产率:32.5%。L =4,4’ -二〔N, N- 二(批唳-2-甲基)〕二氛基二苯甲烧。双核锌配合物的合成:称取Zn(OAc)2.2H20(2mmol)和配体 L.xHC104 (Immol)置于 IOOmL 圆底烧瓶中，加入50mL乙腈和乙醇的1:1混合溶剂，再加入Immol三乙胺调节体系pH = 7值；室温下搅拌反应6小时，反应液过滤；滤液静置7天后析出针状晶体即为产物，小心收集晶体。通过X射线单晶衍射仪分析(图1)和元素分析，证明该晶体为[Zn2L(OAc)2(CH3OH)4] (ClO4) 2。反应产率约45%，测定相应元素的百分比含量为(％):C，47.79 ;H，3.25 ;N，7.68，结果与理论值基本一致。双核锌化合物的电子吸收光谱变化试验:在室温下，向样品池和参比池中各加2.0mL缓冲溶液(缓冲溶液用三蒸水配制，含50mM NaCl和5mM Tris，用盐酸调至pH = 7.2)，然后向样品池加入一定量体积的配合物溶液并向参比池中补加相应等体积的缓冲溶液。用微量进样器往样品池和参比池中加入一定量相同体积的CT-DNA储备液，使CT-DNA与配合物的浓度比值不断增加，观察配合物吸收峰的变化并将数据保存以便拟合处理。如图2所示，双核锌化合物在220nm处有强紫外吸收，随着CT-DNA的逐渐等量加入，配合物的最大吸收峰强度逐渐降低，且峰位置有明显红移，即表现出“减色红移”特征，计算该化合物在最大吸收峰处的减色率为53.5%，表明配合物与CT-DNA发生了插入作用。为了定量比较化合物与DNA结合的强弱，我们通过监控配合物的吸收光谱变化(图2内的嵌入图)，由方程式[DNA]/ ( ε a- ε f) = [DNA] / ( ε b- ε f)+l/Kb( ε b- ε f)可计算出配合物与DNA的结合常数Kb，式中[DNA]表示DNA的浓度，而ε a, eb^P ε f分别表示Atjbsd/[complex]，完全结合后的配合物的摩尔吸光系数和自由配合物的摩尔吸光系数。以[DNA]/( ε a- ε f)对[DNA]作图，斜率与截距的比值即为结合常数Kb，其值为3.ASXlO4M-1,表明该化合物与DNA的键合作用为中等键合强度。EB-DNA的荧光淬灭变化试验:该双核配合物本身不产生荧光，所以不能采用直接荧光光谱法研究配合物与DNA的相互作用。故我们采用配合物淬灭DNA与EB结合物的荧光，通过研究EB-DNA结合物荧光强度的变化来间接测定配合物与DNA的结合程度。 配制CT-DNA和EB的混合溶液，其含量分别为2.4 X IO^6M EB和4.8 X 1(Γ5ΜCT-DNA，储备于4°C冰箱中。配合物配制成10_4M储备液。淬灭滴定实验时，向样品池中加入2.0mL储备的EB-DNA混合液，观察其荧光强度，然后用微量进样器每次往样品池中加入等体积的配合物储备液，使配合物与DNA的浓度比值不断增加，观察发射光谱的变化并将数据保存以便拟合处理。如图3所示，配合物淬灭EB-DNA的荧光光谱，在加入配合物后，EB-DNA的荧光强度降低，并且随着配合物浓度的增加，其荧光强度逐渐降低，表明配合物与CT-DNA的竞争结合取代了 EB。根据经典的荧光淬灭理论Stern-Volmer方程式，IQ/I = 1+K[Q]，以加入配合物前后EB-DNA的荧光强度比值为纵坐标，配合物的浓度为横坐标，做出了Stern-Volmer图(图3内的嵌入图)，对测试数据进行拟合，得到较好的线性关系。根据方程 Keb[EB] = Kapp[complex]， Keb = 1.0X IOV ([EB] = 2.4 μ Μ),计算出配合物的表观键合常数Kapp为5.5X IO5M'小于经典键合常数IO7M'说明配合物与DNA之间为中等键合作用。实施添加H2O2后，锌化合物对pBR322 DNA的浓度依赖切割实验:为了检测双核配合物的化学核酸酶活性，我们采用琼脂糖凝胶电泳法对配合物进行pBR322 DNA切割实验研究，如图4所示，配合物在近生理条件环境下(pH = 7.2，37°C )，对照组I中加入单一 pBR322 DNA，对照组2中加入pBR322 DNA和0.25mM H2O2,再将梯度浓度锌化合物与200ng PBR322 DNA混合，锌化合物浓度梯度数据如下:0.005mM，0.025mM，0.045mM，0.065mM如图4所示，配合物在近生理条件且在诱导剂H2O2存在下能够有效地切割DNA，将超螺旋型质粒PBR322 DNA(Form I)降解至缺刻开环型(Form II)。我们发现，增加配合物的浓度，DNA的断裂程度增加，且在化合物浓度为65 μ M时，产生近95%的Form II，表明该化合物表现出良好的浓度依赖切割DNA活性。实施添加H2O2后，锌化合物对pBR322 DNA的切割机理实验:为了探讨双核配合物对DNA的切割机理，我们采用单线态氧(1O2)抑制剂NaN3，超氧阴离子自由基(Ο/—)抑制剂S0D，羟基自由基(.0Η)淬灭剂DMSO和金属离子螯合剂EDTA对DNA切割活性的影响来判断是否有活性氧物种存在。在琼脂糖凝胶电泳仪中，泳道0-3分别为DNA对照；DNA+0.075mM配合物；DNA+0.25mM H2O2 ；DNA+0.25mM H202+0.075mM配合物，并使用氮气保护；泳道4-7分别为DNA对照；DNA+0.075mM 配合物；DNA+0.25mM H2O2 ；DNA+0.25mM H202+0.075mM 配合物，并在氧气条件下进行。实验结果如图5所示。配合物对DNA的切割活性均没有明显抑制(在切割误差范围内)，排除了单线态氧、超氧阴离子和羟基自由基是反应过程中活性物种的可能性。因此，我们初步判断锌化合物对PBR322 DNA的切割机理可能为水解机理。双核锌化合物 对几种癌细胞的选择性实验:我们利用MTT法测定了配合物对体外HeLa、MCF_7和RL952细胞生长的抑制能力。其基本步骤是:将细胞接种于96孔培养板，每孔2X105个细胞，6复孔。5% C02，37°C下孵育24h后，不同浓度药物加入相应孔板中作用肿瘤细胞48h，同时设置对照孔(细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜)，并且每组设定3复孔。每孔加入MTT (5mg/mL) 20 μ L，继续培养4h，小心吸弃上层清液，加二甲基亚砜(100 μ L/孔)，轻微震荡，室温反应0.5h，用酶标仪检测570nm处的吸光度值，然后分析数据。 如表3所示，该配合物分别作用宫颈癌HeLa、乳腺癌MCF-7和子宫内膜癌RL952细胞48小时后，发现对HeLa细胞有明显的抑制作用，其半数抑制率(IC5tl)值为33.53μΜ，表明化合物对HeLa细胞具有较好的抗癌活性，可作为潜在的抗癌药物。表I锌化合物晶体结构的主要数据
权利要求
1.一种双核锌配合物，其特征在于它的化学式为[Zn2L(OAc)2(CH3OH)4] (ClO4)2，其中L为4，4’ - 二〔N，N-二(吡啶-2-甲基)〕二氨基二苯甲烷，OAc为醋酸根。
2.根据权利要求1所述的双核锌配合物，其特征在于该配合物晶体属于单斜晶系，空间群为 C2/c，晶胞参数为:a=32.809(7)A，b=8.8990(18) A, c= 19.459(4) A, β =117.93(3)°，Z = 4，单胞体积V=5020(2) A3。
3.根据权利要求1所述的双核锌配合物，其特征在于其结构为:基本单元由一个[Zn2L(OAc)2(CH3OH)4]2+阳离子和外界的两个高氯酸跟阴离子组成海个配体与两个锌离子参与配位，两个锌离子之间的距离为9.463 A;锌离子均采取六配位的八面体配位构型；每一个锌离子与配体L的两个吡啶氮原子和一个叔胺氮原子配位，另外还与一个醋酸根和两个乙醇分子配位。
4.权利要求1所述的双核锌配合物的制备方法，其特征在于它包括如下步骤:Zn (OAc) 2.2H20和配体L.XHClO4按比例混合，溶于体积比为1:1的乙腈和乙醇的混合溶剂中，加入三乙胺调节体系PH = 7 ;常温搅拌反应5-10小时，反应液过滤；滤液静置5-7天后析出针状晶体即为产物。
5.根据权利要求4方法，其特征在于所述的Zn(OAc)2.2H20和配体L.xHC104的摩尔比为2:1。
6.根据权利要求4 方法，其特征在于所述三乙胺的量与L.XHClO4的量的摩尔比为I: 10
7.权利要求1所述的双核锌配合物的应用，其特征在于是在抗癌药物制备中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种双核锌配合物与制备方法及其应用。它的化学式为[Zn2L(OAc)2(CH3OH)4](ClO4)2，其中L为4，4’-二〔N，N-二(吡啶-2-甲基)〕二氨基二苯甲烷，OAC为醋酸根。化合物晶体属于单斜晶系，空间群为C2/c，晶胞参数为β＝117.93(3)°。配体L·xHClO4与醋酸锌反应制的目标化合物。多种光谱方法表征发现化合物对CT-DNA具有较强的键合作用；琼脂糖电泳实验证实化合物对pBR322 DNA有明显的切割效果；MTT实验证实化合物对HeLa细胞具有较好的抗癌活性，可作为潜在的抗癌药物。本发明制备方法简单，可靠。
文档编号A61P35/00GK103214502SQ20131015946
公开日2013年7月24日 申请日期2013年5月3日 优先权日2013年5月3日
发明者高春艳, 田金磊, 汪碧微, 阎世平 申请人:南开大学