一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法
【专利摘要】本发明涉及一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，包括：功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物的制备、表面功能化修饰及表征；功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA的制备；功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA的基因转染效率的研究。本发明制备的载体用于基因转染具有易操作，转染条件简单，转染效率高，特异性强等优点，在癌症基因治疗等方面有良好的应用前景。
【专利说明】一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于高分子纳米载体靶向基因转染领域，特别涉及一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法。
【背景技术】
[0002]基因治疗在治疗各种遗传疾病和后天性疾病中有很大的应用如景。现在，许多正在进行的针对癌症，遗传疾病和其它方面疾病的临床试验，都考虑将基因治疗作为一种新颖的药用策略。然而，目前在基因治疗中的一个主要的障碍就是缺乏安全有效的转移和表达载体，将遗传物质传递到生物体所需的位置。
[0003]外部基因可以借助病毒和病毒载体传递到生物体内。失活的病毒外壳或感染系统由于其高效的基因传递效率，已经被应用到各种基因疗法的临床测试上，但是将其作为基因运载工具却对身体有着严重的安全隐患。病毒载体的主要缺点包括大规模生产上的限制，分裂细胞上的限制，免疫原性和由于插入突变导致的致肿瘤性，这些都制约其未来的应用。
[0004]另一方面，非病毒载体被作为研究的对象，发现其具有低细胞毒性，无免疫原性，容易操作和基因装载量大等特点。非病毒的基因传递系统包括阳离子脂质体、阳离子聚合物、环糊精和纳米管，这些材料都可以有效的克服固有病毒载体所存在的问题。
[0005]在目前报道的所有不同的载体中，树状大分子作为非常有潜力的研究对象，可将之应用于开发安全、高效的适合基因传递载体。聚酰胺-胺(poly (amidoamine), PAMAMMi状大分子是有着精确的构架和单分散性的核壳纳米结构，表面丰富的阳离子不仅能通过共价键修饰各种靶向或者药物分子，还能与裸DNA通过静电相互作用，形成理想的纳米粒子。而其独特的内部空腔结构可以包裹目标分子，有选择性地结合客体分子，十分适合于作为金属纳米颗粒的载体。在一些癌细胞中，比如人恶性胶质母细胞瘤细胞(U87MG细胞)的细胞膜表面具有整合素α V β 3，能够专一性的识别环状的精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸氨基酸序列肽(RGD)并与之结合。因此，在聚酰胺-胺树状大分子表面修饰RGD，聚乙二醇(PEG)，并包裹纳米金颗粒，有望·制备出一种聚乙二醇化的RGD修饰的包裹金纳米颗粒的聚酰胺-胺树状大分子，实现其对基因的负载及靶向运输。
[0006]检索国内外相关文献和专利结果表明:以聚乙二醇化的RGD修饰的包裹金纳米颗粒的聚酰胺-胺树状大分子为载体，用于靶向基因转染的方法，尚未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明所要解决的技术问题是提供一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，该方法具有易操作，转染条件简单，转染效率高，特异性强等优点，在癌症治疗等方面有良好的应用前景。
[0008]本发明的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，包括:
[0009](I)分别将1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液、N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液加入羧基端甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH溶液中，搅拌反应2_4h，得到活化的mPEG-COOH ;然后将活化的mPEG-COOH加入到第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液中，反应12-30h，得到功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH2-mPEG20 ;其中EDC和NHS与mPEG-COOH的摩尔比为1.8:1，mPEG-COOH与树状大分子的摩尔比为20:1 ;
[0010](2)将上述功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH2-mPEG2(l加入到氯金酸HAuCl4.4H20溶液中，搅拌反应20-30min，再加入硼氢化钠NaBH4溶液，搅拌2_4h，得到包裹纳米金颗粒的功能化聚酰胺胺树状大分子溶液{(Au°)25-G5.NH2-mPEG20}DENPs ;其中HAuCl4.4H20与树状大分子的摩尔比为25:1，NaBH4与HAuCl4.4H20的摩尔比为5:1;
[0011](3)将端基分别为氨基和羧基的聚乙二醇NH2-PEg-COOH溶液加入到6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-MAL溶液中，搅拌反应6-8h，得到MAL-PEG-C00H溶液；然后加入巯基端环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列肽RGD-SH溶液，搅拌反应10-12h，得到RGD-PEG-C00H溶液；然后再分别加入EDC溶液、NHS溶液，得到活化的RGD-PEG-C00H ;然后将活化的RGD-PEG-C00H加入第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液中，反应12_30h，得到功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH2- (PEG-RGD) 10 ;然后按步骤(I)中的过程，得到活化的mPEG-C00H，加入到G5.NH2- (PEG-RGD) 10中，反应12_30h，得到功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 ;其中 NH2-PEG-C00H、6_MAL、RGD-SH 的摩尔比为 1:1:1，EDC 和 NHS 与 mPEG-COOH 的摩尔比为 1.8:1，EDC 和 NHS 与 RGD-PEG-C00H 的摩尔比为 1.8:1，mPEG-COOH与树状大分子的摩尔比为20:1 ;
[0012](4)将上述功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10中加入HAuCl4.4Η20溶液搅拌15-30min，再加入NaBH4溶液，搅拌2_4h，得到包裹纳米金颗粒的功能化聚酰胺胺树状大分子溶液{(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs ;其中 HAuCl4.4Η20与树状大分子的摩尔比为25:1，NaBH4与HAuCl4`.4Η20的摩尔比为5:1;
[0013](5)将步骤(I) (2) (3) (4)所得的溶液进行透析、冷冻干燥处理，得到干燥的G5.NH2-mPEG20, {(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs, G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs ;分别将 G5.NH2, G5.NH2_mPEG20，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20}DENPs，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs 给它们命名为 Κ0, ΚΙ, Κ2, Κ3, Κ4 ；
[0014](6)按照相应的Ν/Ρ比，取Κ1，Κ2，Κ3，Κ4用无菌水稀释，并用无菌水稀释质粒，然后混合均匀，37°C孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA ;其中N/P比为树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比，数值范围为 1:1-5 ;
[0015](7)将U87MG细胞种于24孔板上，于37°C、5%C02培养24h，更换成无血清的培养基，加入步骤(6)所得的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA,混合均匀，在培养箱中孵育4h，然后将培养基换成有血清的培养基继续培养24h，检测基因转染效率。
[0016]所述步骤(I)中mPEG-COOH溶液的浓度为11.6mmol/mL, EDC和NHS溶液的浓度为20.88mmol/mL，第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为0.58mmol/mL，溶液溶剂均为二甲基亚砜DMSO。[0017]所述步骤(2)中HAuCl4水溶液浓度为30mg/mL，NaBH4溶液的浓度为10mg/mL。
[0018]所述步骤(3)中NH2-PEg-COOH 溶液、6-MAL 溶液、RGD-SH 溶液、mPEG-COOH 溶液的浓度均为5.8mmol/mL, EDC和NHS溶液的浓度为10.44mmol/mL,第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为0.58mmol/mL，溶剂均为DMS0。
[0019]所述步骤(4)中HAuCl4.4H20溶液的浓度为30mg/mL，NaBH4溶液的浓度为IOmg/mL，溶剂均为水。
[0020]所述步骤(5)中透析为透析袋截留分子量为14000，用去离子水透析2-3d，每天3次，每次2L去离子水。
[0021]所述步骤(6)中质粒为带有荧光素酶基因的质粒或带有增强的绿色荧光蛋白EGFP基因的质粒。
[0022]所述步骤(7)中无血清的培养基为MEM培养液；有血清的培养基为10%FBS的MEM
培养基。
[0023]所述步骤(7)中转染后表达时间为24_48h。
[0024]细胞毒性试验的具体步骤:
[0025]将U87MG细胞种于96孔板上，于37°C、5%C02培养24h，更换培养基，加入含K1，K2, K3, K4 终浓度分别为 0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM 和 3000nM 的细胞培养液，37°C、5%C02培养24h，加入MTT溶液，继续培养4h，去除培养基，加入DMS0，摇床振荡15-30min ;在酶标仪下测试吸光值。
.[0026]所述的MTT浓度为5.0mg/mlo
[0027]所述吸光值测试参数为:测试波长570nm，参比波长630nm。
[0028]本发明以功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物为靶向基因载体，以人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG细胞作为靶细胞，进行基因转染。
[0029]本发明中使用1.8倍量EDC与NHS活化mPEG-COOH和RGD-PEG-C00H的羧基，增强与树状大分子反应的活性，活化的mPEG-COOH和RGD-PEG-C00H在快速搅拌的情况下，以均匀的速度加入到树状大分子溶液中，以保证树状大分子接枝PEG的均一性，而PEG又可以增加材料在体内的生物相容性。
[0030]本发明中加氯金酸溶液时，采用逐滴滴加的方式加入到树状大分子溶液中，使氯金酸分子和树状大分子充分混合；在加NaBH4的时候，快速的加入，以保证树状大分子空腔内的AuC14_离子能快速的被还原为金纳米颗粒。
[0031]本发明通过核磁共振(1H NMR)对修饰在树状大分子表面的PEG和RGD的数量进行了表征；紫外可见光谱(UV-Vis)对载体中的金纳米颗粒的存在进行了表征；透射电子显微镜(TEM)对载体中的金纳米颗粒的分布和大小进行了表征；凝胶阻滞实验以及表面电势和粒径的测定对载体/pDNA复合物进细胞的能力进行了表征；MTT法测定了载体对细胞的毒性；荧光素酶表达实验和绿色荧光蛋白表达实验对载体的基因转染能力进行了测定；自由RGD阻断实验对载体的靶向转染能力进行了表征。
[0032]本发明制备的基因载体能够明显的提高pDNA对人恶性胶质母细胞瘤细胞的转染能力，因此发明制备的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物能够作为基因载体用于癌细胞的靶向基因传输。
[0033]核磁共振(1H NMR)、紫外可见光谱(UV-Vis)、透射电镜图(TEM)、凝胶阻滞实验、表面电势和粒径、细胞毒性试验、荧光素酶表达实验、绿色荧光蛋白表达实验和自由RGD阻断实验的实验结果分别如下:
[0034](I)1H NMR 测试结果
[0035]1H NMR图谱用于表征PEG和RGD对树状大分子表面的修饰。参见说明书附图1a:在化学位移3.5ppm处有个质子峰，它是PEG分子结构中特征基团的质子峰，根据积分面积可以求出每个Kl和K2表面连接了 19.9个PEG分子；参见说明书附图1b:在化学位移3.5和7.2ppm处分别有个质子峰，它是PEG和RGD分子结构中特征基团的质子峰，根据积分面积可以求出每个K3和K4表面接了 9.2个RGD，19.2个PEG。
[0036](2) UV-Vis 测试结果
[0037]UV-Vis用于表征载体中的金纳米颗粒。参见说明书附图2:本发明中制备得到的K2和K4表面等离子体共振(SPR)峰位于510nm。这表明本发明中制备得到了金纳米颗粒。
[0038](3) TEM 结果
[0039]TEM图用于表征载体中金纳米颗粒的形貌和直径大小。参见说明书附图3:制备的K2和K4形状接近球形，单分散性好，平均直径分别只有只有2.1nm和1.9nm。
[0040](4)凝胶阻滞实验测试结果
[0041 ] 凝胶阻滞实验用于表征载体对pDNA的包裹能力，参见说明书附图4:K1，K2，K3，K4均可以在较低Ν/Ρ (Ν/Ρ=0.5)下与pDNA很好复合，将pDNA完全阻滞，说明这四种载体均具有很好的PDNA包裹能力。
[0042](5)粒径和表面电势测试结果
`[0043]粒径和表面电势测试用于表征载体/pDNA复合物进细胞的能力，参见说明书附图5:载体/pDNA复合物的大小在合适转染的尺寸范围内。修饰了 RGD的K3/pDNA复合物，K4/pDNA复合物的粒径较没有修饰RGD的Kl/pDNA复合物，K3/pDNA复合物的粒径小，而他们的复合物电势则相差不大，都在适合转染的电势范围内。
[0044](6)细胞毒性试验结果
[0045]细胞毒性试验用于表征载体对细胞的毒性，参见说明书附图6:随着浓度的增大毒性不断的上升，但即使在高浓度下(3000nM)，经材料处理过的细胞活力都在80%以上，这表明在合适的浓度范围内，载体材料没有细胞毒性，为转染提供有利条件。相反，未经任何修饰的氨基封端的G5.NH2 (KO)则在高浓度时具有明显的细胞毒性。
[0046]( 7 )荧光素酶表达实验结果
[0047]荧光素酶表达实验用于表征载体的基因转染能力，以带有荧光素酶基因的质粒并以具有表达ανβ3整合素的人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG细胞为模型细胞来检验四种材料对癌细胞的转染效果，参见说明书附图7:四种材料的转染效率均与Ν/Ρ有关，在相同N/P下，载体的转染效率为Κ4>Κ2>Κ3>Κ1，而在Ν/Ρ=2.5时，材料的转染效率最高。表明修饰了RGD的材料比没有修饰RGD的材料转染效率高，而包裹了金纳米颗粒的材料比没有包裹金纳米颗粒的材料转染效率高。
[0048](8)绿色突光蛋白表达实验结果
[0049]绿色荧光蛋白表达实验用于表征载体的基因转染能力，以带有增强型绿色荧光蛋白基因的质粒并以具有表达ανβ3整合素的人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG细胞为模型细胞来检验四种材料对癌细胞的转染效果，参见说明书附图8:对于U87MG细胞，在Ν/Ρ=2.5时，绿色荧光信号表达的强弱为K4>K2>K3>K1。这也表明修饰了 RGD的材料比没有修饰RGD的材料基因转染效率高，而包裹了金纳米颗粒的材料比没有包裹金纳米颗粒的材料基因转染效率高。
[0050](9)自由RGD阻断实验结果
[0051]自由RGD阻断实验用于表征载体的靶向转染能力，以带有cy3标记的增强型绿色荧光蛋白质粒(cy3-pEGFP)并以在添加RDG-SH的培养基生长的人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG细胞为模型来检测两种材料K3和K4对表达α ν β 3整合素被屏蔽后的癌细胞的转染效果。参见说明书附图9:对于在添加自由RGD-SH的培养基中培养24h的U87MG细胞(表达低α ν β 3整合素)，在Ν/Ρ=2.5时，复合物在U87MG细胞中的荧光强度显著性的高于其在U87MG细胞(未经自由RDG-SH屏蔽)中的荧光强度，这表明修饰了 RGD的材料Κ3和Κ4具有显著的癌细胞靶向性。
[0052]有益.效果
[0053](I)本发明制备的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物具有良好的基因转染效果，为癌症基因治疗的进一步开发打下了基础；
[0054](2)本发明制备的RGD功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物对人恶性胶质母细胞瘤细胞具有靶向作用，可用于基因的靶向输送；
[0055](3)本发明具有易操作，转染条件简单，转染效率高，特异性强等优点，在癌症治疗等方面具有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0056]图1为本发明制备的Kl Ca)和K3 (b)的核磁共振氢谱图；
.[0057]图2为本发明制备的K2 Ca)和K4 (b)的紫外吸收光谱图；
[0058]图3为本发明制备的K2 Ca)和K4 (b)的TEM图和粒径分布直方图；
[0059]图4为本发明制备的Kl，K2，K3，K4的凝胶阻滞实验电泳图谱；
[0060]图5为本发明制备的Kl，K2，K3，K4与pDNA复合物的粒径(a)和电势(b)图；
[0061]图6为本发明制备的Kl，K2，K3，K4对U87MG细胞毒性比较图；
[0062]图7为本发明制备的Kl，K2，K3，K4在不同N/P下对U87MG细胞的荧光素酶基因转染效率比较图；
[0063]图8为本发明制备的Kl，K2，K3，K4在N/P=2.5时，对U87MG细胞的绿色荧光蛋白基因转染的激光扫描共焦显微镜图；
[0064]图9为本发明制备的K3和K4和两种材料在N/P=2.5时，U87MG细胞的低ανβ3整合素表达(RGD+)和高α νβ 3整合素表达(RGD-)对载体/pDNA复合物的转染效率比较图；
[0065]图10为功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物的制备原理示意图。
【具体实施方式】
[0066]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。[0067]实施例1
[0068]称取mPEG-C00H23.16mg,溶于 5mL DMSO0 称取 4.0mg EDC 和 2.4mg NHS，分别溶于ImL DMSO中，先后将EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG_C00H溶液中，搅拌反应3h。称取第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH2) 15.06mg,溶于5mL DMSO中。将上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到G5.NH2溶液中，室温下磁力搅拌，反应3d。得到样品Kl:G5.NH2-mPEG20 溶液。
[0069]在上述溶液中逐滴加入198.67 μ L HAuCl4水溶液(30mg/mL)混合搅拌30min，然后快速的加入27.4 μ L的10mg/mL的NaBH4溶液，反应3h。得到样品K2:
[0070]{(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20} DENPs。
[0071]称取Nh2-PEG-COOhI L 58mg，溶于5mL DMS0。边搅拌边逐滴滴加溶于ImL DMSO溶液的干重为 1.785mg 的 6-MAL，反应 8h，得到了 MAL-PEG-C00H 溶液。将 ImL RGD-SH 的 DMSO溶液(4mg/mL)，逐滴加入到上述的MAL-PEG-C00H溶液中，反应12h，得到RGD-PEG-C00H溶液。称取4.0mg EDC和2.4mg NHS，分别溶于ImL DMSO中，先后将EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加RGD-PEG-C00H溶液中，搅拌反应3h。称取第五代聚酰胺-胺树状大分子(G5.NH2)15.06mg,溶于5mL DMSO中。将上述活化好的RGD-PEG-C00H溶液逐滴加入到G5.NH2溶液中，室温下磁力搅拌，反应3d，得到G5.NH2-(PEG-RGD) 1(|。称取mPEG-COOHll.58mg,溶于5mL DMSO。称取2.0mg EDC和1.2mg NHS，分别溶于ImLDMSO中，先后将EDC溶液和NHS溶液逐滴滴加到mPEG-COOH溶液中，搅拌反应3h。将上述中活化好的mPEG-COOH溶液逐滴加入到G5.NH2-(PEG-RGD)10溶液中，室温下磁力搅拌，反应3d。得到样品K3:G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 溶液。
[0072]在上述溶液中逐滴加入198.67 μ L HAuCl4水溶液(30mg/mL)混合搅拌30min，然后快速的加入27.4 μ L的10mg/mL的NaBH4溶液，反应3h。得到样品K4:`[0073]{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs 溶液。
[0074]反应结束后，将反应产物G5.NH2-mPEG2。，{(Au0) 25_G5.NH2IPEG2J DENPs，
[0075]G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs 转移至截留分子量为14000的透析袋中，在蒸馏水中透析三天(2LX3，共三天)。然后进行冷冻干燥处理,得到干燥的 G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25_G5.NH2_mPEG2。} DENPs (K2)，
[0076]G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (Κ3)，{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs(K4)。
[0077]1HNMR表征结果如说明书附图1所示，图a:在化学位移3.5ppm处有个质子峰，它是PEG分子结构中特征基团的质子峰，根据积分面积可以求出每个Kl和K2表面连接了 19.9个PEG分子；图b:在化学位移3.5和7.2ppm处分别有个质子峰，它是PEG和RGD分子结构中特征基团的质子峰，根据积分面积可以求出每个K3和K4表面接了 9.2个RGD，19.2个PEG。UV-vis 结果如说明书附图 2 所示，{(Au°)25-G5.NH2-mPEG2Q}DENPs(K2)和{(Au0) 25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)表面等离子体共振(SPR)峰位于520nm，这表明本发明中制备得到了金纳米颗粒。TEM结果如说明书附图3所示，{(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20}DENPs (K2)和{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)的形状接近球形并且单分散性较好，平均直径分别在2.1nm和1.9nm。
[0078]实施例2[0079]根据实施例1 的方法制备的 G5.NH2-mPEG2Q (Kl)，{(Au°)25_G5.NH2IPEG2JDENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)，{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)与pDNA形成复合物，并进行凝胶阻滞实验。配制8孔含有溴化乙锭(lmg/mL)的琼脂糖凝胶(1.0%w/v),室温放置待琼脂糖凝胶凝固。按照不同N/P比0.125，0.25,0.5,1,2,5, pDNA量为14 8/孔，配制载体如0嫩复合物，孵育30111，并以裸？0嫩为对照。然后将对应的载体/pDNA复合物分别加到琼脂糖凝胶的孔中，电压80V，时间30min。使用凝胶成像仪对PDNA在凝胶中的迁移进行分析。结果如说明书附图4所示。结果表明，G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (Κ3)，{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)均可以在较低 Ν/Ρ (Ν/Ρ=0.5)下与 DNA 很好复合，将DNA阻滞。
[0080]实施例3
[0081]根据实施例1 的方法制备的 G5.NH2-mPEG2。(Kl)，{(Au°)25_G5.NH2IPEG2JDENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)，{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)分别与5yg pDNA (N/P=l，2.5，5)复合后，终体积固定在100 μ L，室温下孵育，室温下孵育20min，然然后加入ImL的PBS。采用马尔文激光粒度仪(Malvern，MK,633nm激光)对其粒径和表面电势进行了表征，结果如说明书附图5所示。结果表明，随着N/P的增加，复合物的尺寸呈现减小的趋势。相同N/P(l:l，2.5:1，5:1)下，G5.NH2- (PEG-RGD) 10_mPEG10 (K3)和{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10_mPEG10} DENPs (K4) /pDNA复合物尺寸分别较 G5.NH2-mPEG20 (Kl)和{(Au°)25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2) /pDNA 复合物的尺寸更小。表明 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)，{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)的压缩能力分别比 G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)更强，即压缩能力Κ3>Κ1，Κ4>Κ2。说明RGD的修饰有利于纳米载体对pDNA负载。另外，Zeta电势测试结果表明，四种载体的电势都在15mV以下，这非常有利于复合物与细胞间进行静电相互作用，易于细胞吸附和内吞，也就有利于载体对目的基因的传递。
[0082]实施例4
[0083]以具有α ν β 3整合素表达的人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG细胞为模型细胞来检验实施例1制备的材料的细胞毒性。以8χ103/孔的密度将U87MG细胞种于96孔板中，培养于含有10%FBS的100 μ L MEM培养液中，37 °C，5% 二氧化碳浓度下培养24h。然后将培养基换成浓度分别为 0nM、50nM、100nM、500nM、1000nM、2000nM 和 3000nM 的含 G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (Κ3)，{(Au0) 25_G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs (K4)的细胞培养基与细胞共培养24h，随后加入20 μ LMTT(5.0mg/ml)溶液，继续培养4h。去除孔中的培养液，每孔加入150 μ L DMS0，摇床振荡30min，用多功能酶标仪测试吸光值，测试波长570nm，参比波长630nm。结果如说明书附图6所示。结果表明，四种材料的毒性都比G5.NH2的毒性低。随着材料浓度的增加，细胞存活率下降，但在高浓度下，四种材料的细胞毒性为G5.NH2-mPEG20 (Kl)>{ (Au0)25-G5.NH2-mPEG20}DENPs (K2) >G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3) > {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs(K4)。
[0084]实施例5
[0085]以具有α v β 3整合素表达的人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG细胞为模型细胞来检验实施例1制备的材料作为载体对癌细胞的靶向基因转染效果。以5xl04/孔的密度将U87MG细胞种于24孔板中，培养于含有10%FBS的500 μ L MEM培养液中，37 V，5% 二氧化碳浓度下培养24h。随后将培养基换成不含FBS的MEM培养液中，加入一定浓度的G5.NH2-mPEG20 (Kl)，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (Κ3)，{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4) /pDNA 复合物与细胞共培养 4h。然后更换含10%FBS的新鲜MEM培养基，继续培养24h。将细胞裂解，并通过Promega公司的luciferase assay来检测荧光素酶活性，结果见说明书附图7。测试结果显示:四种材料的转染效率均与N/P有关，在N/P=2.5时，材料的转染效率最高，转染效率为{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4) > {(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2) >G5.NH2-(PEG-RGD) 1(l-mPEG1(l (K3) >G5.NH2-mPEG2(l (Kl)；且在 Ν/Ρ=2.5 时，与 G5.NH2 (KO)相比较，{(Au0) 25-G5.NH2-mPEG20} DENPs (K2)，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)，{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)三者都具有显著性差异，这说明RGD修饰的材料对癌细胞具有特异性的靶向效果，而包裹了金纳米颗粒的材料使细胞对复合物摄入的更多。
[0086]实施例6
[0087]以带有增强型绿色荧光蛋白基因的质粒并以具有ανβ3整合素表达的人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG细胞为模型细胞来检验材料作为载体对癌细胞的靶向基因转染效果。复合物的制备方法如实施例5所示。目的基因用的是增强型绿色荧光蛋白基因。在转染24h后，用激光共聚焦显微镜观察，结果见说明书附图8。通过前面的荧光素酶基因表达实验，我们发现转染效果最佳的N/P比为2.5，因此，我们选取了这个N/P比进行了绿色荧光蛋白表达实验的比较。从图中我们也可以看出，对于U87MG 细胞，{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10_mPEG10} DENPs (K4)和{(Au0) 25_G5.NH2_mPEG20}DENPs (K2)可以更好地将EGFP质粒转染进入细胞，细胞具有较强的绿色荧光信号表达；而G5.NH2- (PEG-RGD) 10 -mPEG10 (K3)和 G5.NH2-mPEG20 (Kl)对 EGFP 质粒转染的效率较低，细胞的绿色荧光信号较弱。这个结果和荧光素酶基因表达实验保持高度一致。
[0088]实施例7
[0089]以带有cy3标记的增强型绿色荧光蛋白质粒(Cy3_pEGFP)并以在添加RDG-SH的培养基生长的人恶性胶质母细胞瘤细胞U87MG细胞为模型来检测两种材料 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)和{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)对RGD受体被屏蔽后的癌细胞的转染效果。将自由RGD-SH (5 μ Μ)加到含有U87MG细胞的培养液中，作用0.5-lh，再加入一定浓度的G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)和{(Au0) 25-G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4) /cy3_pEGFP 复合物与细胞共培养 4h，随后通过流式细胞仪检测复合物的荧光强度，结果见说明书附图9。测试结果显示:在N/P=2.5时，复合物在U87MG细胞的低表达ανβ3整合素(RGD+)的荧光强度显著性的低于其在U87MG细胞的高表达ανβ3整合素(RGD-)的荧光强度，这表明修饰了 RGD的材料G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 (K3)和{(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs (K4)具有显著的靶向特异性。
【权利要求】
1.一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，包括: (O分别将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC溶液、N-羟基琥珀酰亚胺NHS溶液加入羧基端甲氧基聚乙二醇mPEG-COOH溶液中，搅拌反应2_4h，得到活化的mPEG-COOH ;然后将活化的mPEG-COOH加入到第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液中，反应12-30h，得到功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH2-mPEG20 ;其中EDC和NHS与mPEG-COOH的摩尔比为1.8:1，mPEG-COOH与树状大分子的摩尔比为20:1 ; (2)将上述功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH2-mPEG20加入到氯金酸HAuCl4.4H20溶液中，搅拌反应20-30min，再加入硼氢化钠NaBH4溶液，搅拌2_4h，得到包裹纳米金颗粒的功能化聚酰胺胺树状大分子溶液{(Au°)25-G5.NH2-mPEG20}DENPs ;其中HAuCl4.4H20与树状大分子的摩尔比为25:1，NaBH4与HAuCl4.4H20的摩尔比为5:1; (3)将端基分别为氨基和羧基的聚乙二醇NH2-PEg-COOH溶液加入到6-(马来酰亚胺基)己酸琥珀酰亚胺酯6-MAL溶液中，搅拌反应6-8h，得到MAL-PEG-C00H溶液；然后加入巯基端环状的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸氨基酸序列肽RGD-SH溶液，搅拌反应10-12h，得到RGD-PEG-C00H溶液；然后再分别加入EDC溶液、NHS溶液，得到活化的RGD-PEG-C00H ;然后将活化的RGD-P EG-C00H加入第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液中，反应12_30h，得到功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH2- (PEG-RGD) 10 ;然后按步骤(I)中的过程，得到活化的mPEG-COOH，加入到G5.NH2- (PEG-RGD) 10中，反应12_30h，得到功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液 G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10 ;其中 NH2-PEG-C00H、6_MAL、RGD-SH 的摩尔比为 1:1:1，EDC 和 NHS 与 RGD-PEG-C00H 的摩尔比为 1.8:1，EDC 和 NHS 与 mPEG-COOH 的摩尔比为 1.8:1，mPEG-COOH与树状大分子的摩尔比为20:1 ; (4 )将上述功能化聚酰胺-胺树状大分子溶液G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10中加入HAuCl4.4Η20溶液搅拌15-30min，再加入NaBH4溶液，搅拌2_4h，得到包裹纳米金颗粒的功能化聚酰胺胺树状大分子溶液{(Au°)25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10}DENPs ;其中 HAuCl4.4Η20与树状大分子的摩尔比为25:1，NaBH4与HAuCl4.4Η20的摩尔比为5:1; (5)将步骤(I)(2) (3) (4)所得的溶液进行透析、冷冻干燥处理，得到干燥的G5.NH2-mPEG20, {(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20} DENPs, G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25-G5.NH2-(PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs ;分别将 G5.NH2, G5.NH2_mPEG20，{(Au0) 25_G5.NH2-mPEG20}DENPs，G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10, {(Au0) 25_G5.NH2- (PEG-RGD) 10-mPEG10} DENPs 给它们命名为 Κ0, ΚΙ, Κ2, Κ3, Κ4 ； (6)按照相应的Ν/Ρ比，取Κ1，Κ2，Κ3，Κ4用无菌水稀释，并用无菌水稀释质粒，然后混合均匀，37°C孵育30min，得到不同N/P比的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA ;其中N/P比为树状大分子的伯氨基与pDNA骨架上磷酸基团摩尔比，数值范围为1:1-5 ； (7)将U87MG细胞种于24孔板上，于37°C、5%C02培养24h，更换成无血清的培养基，加入步骤(6)所得的功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物/pDNA,混合均匀，在培养箱中孵育4h，然后将培养基换成有血清的培养基继续培养24h，检测基因转染效率。
2.根据权利要求1所述的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，其特征在于:所述步骤(I)中mPEG-COOH溶液的浓度为11.6mmol/mL，EDC和NHS溶液的浓度为20.88mmol/mL,第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为0.58mmol/mL，溶液溶剂均为二甲基亚砜DMSO。
3.根据权利要求1所述的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，其特征在于:所述步骤(2)中HAuCl4水溶液浓度为30mg/mL，NaBH4溶液的浓度为 lOmg/mL。
4.根据权利要求1所述的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，其特征在于:所述步骤(3)中NH2-PEg-COOH溶液、6-MAL溶液、RGD-SH溶液、mPEG-COOH溶液的浓度均为5.8mmol/mL, EDC和NHS溶液的浓度为10.44mmol/mL,第五代聚酰胺-胺树状大分子溶液的浓度为0.58mmol/mL，溶剂均为DMS0。
5.根据权利要求1所述的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，其特征在于:所述步骤(4)中HAuCl4.4Η20溶液的浓度为30mg/mL，NaBH4溶液的浓度为10mg/mL，溶剂均为水。
6.根据权利要求1所述的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，其特征在于:所述步骤(5)中透析为透析袋截留分子量为14000，用去离子水透析2-3d，每天3次，每次2L去离子水。
7.根据权利要求1所述的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，其特征在于:所述步骤(6)中质粒为带有荧光素酶基因的质粒或带有增强的绿色荧光蛋白EGFP基因的质粒。
8.根据权利要求1所述的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，其特征在于:所述步骤(7)中无血清的培养基为MEM培养液；有血清的培养基为10%FBS的MEM培养基。
9.根据权利要求8所述 的一种功能化聚酰胺-胺树状大分子及其纳米复合物用于基因转染的方法，其特征在于:所述步骤(7)中转染后表达时间为24-48h。
【文档编号】A61K47/34GK103435815SQ201310291576
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月11日 优先权日:2013年7月11日
【发明者】史向阳, 孔令丹 申请人:东华大学