MicroRNA-429在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及MicroRNA-429在制备抗肝癌药物中的应用。本发明首次揭示miR-429在维持肝癌干细胞特性中起到重要的作用。高表达miR-429能够增强EpCAM+的肝癌干细胞的增殖、自我更新以及肿瘤形成能力；抑制miR-429的表达能够引起相反的效应。因此，miR-429可作为肝癌治疗的新靶点，miR-429抑制剂可作为肝癌治疗药物，同时对肝癌复发及转移起到预防作用。
【专利说明】MicroRNA-429在制备抗肝癌药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药领域，更具体地，本发明涉及一种以microRNA-429(miR-429) 为靶点的抗肝癌药物的制备和应用。
【背景技术】
[0002] 肝癌是常见的恶性肿瘤之一，死亡率高，我国每年死于肝癌的患者占全世界肝癌 死亡人数的45%。目前，关于肝癌发生的机制仍不清楚，而近年来的"干细胞"理论在肿瘤的 研究方面引起了众多学者的关注。
[0003] 肿瘤干细胞假说认为只有很小一部分细胞有无限的增殖能力和分化潜能，具有 引起肿瘤发生、维持肿瘤生长、保持肿瘤异质性的能力，这样的细胞叫肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC)。它在肿瘤的发生、恶化、转移、复发中起重要作用。目前，研究学者先后在 多种恶性肿瘤，如白血病、脑胶质瘤、乳腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、肝癌、前列腺癌、结肠癌、鼻 咽癌等实体肿瘤中鉴定分离到肿瘤干细胞的存在[1-5]。
[0004] 国内外专家学者对肝癌干细胞表面标志物不断进行着探究，研究表明EpCAM是高 致瘤性肿瘤细胞的一个标记[6-8]。譬如，Kimura等[9]发现肝癌EpCAM+亚群具有更强的 克隆形成率。体内致瘤实验发现在超免疫缺陷NOD/SCID/Ycnull (NOG)鼠中，最少100个 EpCAM+细胞即能形成肿瘤，而EpCAM-细胞不能成瘤。
[0005] miRNAs是一种内源性的、长约22nt的RNA，它通过靶向mRNA导致其降解或翻译抑 制而在动、植物中起到重要的调节作用。miRNAs广泛存在于灵长类、啮齿类、鸟类、鱼类、蝇 类、蠕虫类、植物、病毒中，从2002年有统计的200多种到2008年底的将近9000种，miRNAs 的发现呈现爆发性增长，并且不断有新物种中的miRNAs被发现。人类miRNAs基因仅约占 基因总数的2-3%，但却能调控人体内1/3的蛋白表达，这种转录后调控作用直接影响了这 些靶基因的功能，参与了包括消化系统在内的多个系统的生理、病理过程。miRNAs在消化系 统中的作用涉及发育、老化、分泌、代谢、病毒感染、免疫反应、肿瘤等等方面，尤其是作为癌 基因或者抑癌基因在肿瘤发生发展中的作用显的尤为重要。
[0006] 以前的研究表明，miR-200microRNA家族成员，尤其是miR-429在多种肿瘤中高表 达，并且对于保持上皮表型、诱导细胞基质上皮转化起重要作用[10-14]。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供肝癌治疗的新靶点。
[0008] 本发明的另一目的在于提供MicroRNA-429在制备抗肝癌药物中的应用。
[0009] 本发明的另一目的在于提供以miR-429为靶点的小分子核酸药物及其在肝癌治 疗中的应用。
[0010] 在本发明的第一方面，提供一种用于治疗肝癌的小分子核酸药物。所述的药物是 一类miR-429的抑制剂，通过抑制或阻止miR-429与其靶基因结合的物质，从而抑制EpCAM 阳性的肝癌干细胞的增殖、自我更新及肿瘤形成能力，起到对肝癌的治疗、预防复发及转移 等效果。
[0011] 所述的miR-429抑制剂包括（但不限于）：miR-429的反义核酸、miR-429的锁核 酸反义核酸、siRNA ;或携带或表达miR-429的反义核酸、miR-429的锁核酸反义核酸、siRNA 的构建物（如表达载体）。
[0012] 所述的miR-429抑制剂是：包含SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示的反义核苷酸， 或其修饰形式包括（但不限于）：锁核酸修饰、甲氧基化修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸 骨架由磷脂连接骨架代替的修饰。
[0013] 本发明还提供一种miR-429的用途，用于作为筛选治疗肝癌的潜在物质的靶标； 以及一种筛选治疗肝癌的潜在物质的方法；较佳地，所述的肝癌是肝细胞癌或EpCAM+的肝 癌。
[0014] 所述筛选治疗肝癌的潜在物质的方法，包括：
[0015] (1)用候选物质处理表达miR-429的体系；和
[0016] (2)检测所述体系中miR-429的表达情况；
[0017] 其中，若所述候选物质可降低miR-429的表达，则表明该候选物质是治疗肝癌的 潜在物质。
[0018] 再一个优选例中，所述筛选方法中，步骤（1)包括：在测试组中，将候选物质加入 到表达miR-429的体系中；和/或
[0019] 步骤⑵包括：检测测试组的体系中miR-429的表达，并与对照组比较，其中所述 的对照组是不添加所述候选物质的表达miR-429的体系；
[0020] 如果测试组中miR-429的表达在统计学上低于（优选显著低于，如低20%以上，较 佳的低50%以上；更佳的低80%以上）对照组，就表明该候选物是治疗肝癌的潜在物质。
[0021] 在另一优选例中，所述的候选物质包括（但不限于）：针对miR-429设计的干扰分 子、核酸抑制物、结合分子（如抗体或配体）、小分子化合物。
[0022] 在另一优选例中，所述的体系选自：细胞体系（如表达miR-429的细胞）（或细胞 培养物体系）、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
[0023] 在另一优选例中，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验 和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于治疗肝癌有用的物质。
[0024] 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
【专利附图】
【附图说明】
[0025] 图I、miR-429促进EpCAM+细胞的比例。
[0026] 图2、过表达以及干扰miR-429表达对Spheroids形成的影响。
[0027] 图3、miR-429抑制剂对肿瘤生长的抑制作用。
【具体实施方式】
[0028] 本发明人经过长期研究，首次揭示miR-429在维持肝癌干细胞特性中起到重要的 作用。高表达miR-429能够增强EpCAM+的肝癌干细胞的增殖、自我更新以及肿瘤形成能 力。相反的，在EpCAM+的肝癌干细胞中抑制miR-429的表达能够引起相反的效应。因此， miR-429可作为肝癌治疗的新靶点，抑制miR-429的小分子核酸药物可用于肝癌患者术后 辅助治疗的有效手段，同时对肝癌复发及转移起到预防作用。
[0029] miR-429 及其用途
[0030] 本发明中，所述的miR-429是具有如下所示核酸序列的小核糖核酸（SEQID N0:1)：
[0031] miR-429:5'-UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3' ；
[0032] miR-429是为一种本领域已知的microRNA (miRNA)小分子，其对于调控RNA是有用 的。然而本领域之前对于miR-429与肝癌的干细胞特性之间的相关性没有研究。
[0033] miR-429可以被分离自细胞，或者可通过人工合成的方式获得。在得知了 miR-429 或其前体的序列后，本领域人员可以方便地制备获得miR-429或其前体。
[0034] 在本发明的具体实施例中，利用细胞生物学实验及模型动物体内实验等方法，发 现以miR-429为靶点的小分子核酸药物在制备抗肿瘤药物中的应用方面的新功能，并对其 进行了如下研究：
[0035] 1、通过磁珠分选出EpCAM+的肝癌干细胞，通过miR-429过表达以及对其进行干 扰，验证其对于肝癌干细胞特性的影响。
[0036] (a)其中使用的miR-429过表达试剂中至少包含以下任一序列：
[0037] SEQ ID N0:1 :5, -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3，
[0038] SEQ ID N0:2 :5' -TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3'
[0039] 使用的过表达试剂为包含上述任一序列的核酸片段或经过修饰的核酸片段；
[0040] (b)其中使用的miR-429抑制剂中包含以下任一序列：
[0041] SEQ ID N0:3 :5, -ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3'
[0042] SEQ ID N0:4 :5' -ACGGTTTTACCAGACAGTATTA-3'
[0043] 使用的抑制剂为包含上述任一序列的核酸片段或经过修饰的核酸片段；
[0044] (c)过表达实验表明miR-429能够促进肝癌干细胞的自我更新、增殖和化疗抵抗； 在EpCAM+的肝癌干细胞中抑制miR-429的表达能够引起相反的效应。
[0045] 2、通过NOD-SCID老鼠皮下荷瘤实验，体内水平验证抑制miR-429的小分子核酸药 物（包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4任一序列的核酸片段或经过修饰的核酸片段）在肝 癌治疗中的作用。研究发现抑制miR-429的小分子核酸药物对于肝癌的生长具有显著抑制 作用。
[0046] 以上实验结果判定，miR-429是一个肝癌分子治疗新的靶点，抑制miR-429的小分 子核酸药物可用于治疗肝癌，并预防术后复发及转移。
[0047] 因此，miR-429是一个新的、与肝癌的干细胞特性密切相关的药物靶点。针对 miR-429的各种治疗手段可以作为治疗肝癌的新颖和有效的手段。
[0048] miR-429为靶点的药物筛选
[0049] 在得知了 miR-429与肝癌的干细胞特性的密切相关性后，可以基于该特征来筛选 抑制miR-429的物质。之后，可从所述的物质中找到对于治疗肝癌真正有用的药物。
[0050] 因此，本发明提供一种筛选治疗肝癌的潜在物质的方法，所述的方法包括：用候 选物质处理表达miR-429的体系；和检测所述体系中miR-429的表达或活性；若所述候选 物质可抑制miR-429的表达或活性，则表明该候选物质是治疗肝癌的潜在物质。所述的表 达miR-429的体系例如可以是细胞（或细胞培养物）体系，所述的细胞可以是内源性表达 miR-429的细胞；或可以是重组表达miR-429的细胞。所述的表达miR-429的体系还可以 是亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系（如动物模型，优选非人哺乳动 物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等）等。
[0051] 在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到miR-429的表达或活 性的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达miR-429的 体系。
[0052] 作为本发明的优选方式，所述的方法还包括：对获得的潜在物质进行进一步的细 胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于治疗肝癌真正有用的物质。
[0053] 另一方面，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的治疗肝癌的潜在物质。这 些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于抑制 miR-429的表达和活性，进而治疗肝癌有用的物质。
[0054] miR-429调节剂及其用途
[0055] 基于本发明人的上述新发现，本发明提供了一种miR-429抑制剂的用途，用于制 备治疗肝癌的组合物。所述的miR-429抑制剂还用于：抑制EpCAM阳性的肝癌干细胞的增 殖、自我更新及肿瘤形成能力。
[0056] 如本文所用，所述的"miR-429抑制剂"包括了核酸抑制物、拮抗剂、下调剂、阻滞 齐U、阻断剂等，只要它们能够下调miR-429或其前体的表达水平。它们可以是化合物、化学 小分子、生物分子。所述的生物分子可以是核酸水平（包括DNA、RNA)的，也可以是蛋白水 平的。
[0057] 所述的miR-429抑制剂是指任何可阻止miR-429 (特别是其中的结合关键位点） 或其前体与其靶向序列结合、降低miR-429或其前体的活性、降低miR-429或其前体的稳定 性、下调miR-429或其前体的表达、减少miR-429或其前体有效作用时间的物质，这些物质 均可用于本发明，作为对于下调miR-429有用的物质，从而可用于治疗肝癌、抑制EpCAM阳 性的肝癌干细胞的增殖、自我更新及肿瘤形成能力。例如，所述的抑制剂是：核酸抑制物，蛋 白抑制剂，抗体，配体，核酸酶，核酸结合分子，只要其能够下调miR-429的表达。
[0058] 作为本发明的一种优选方式，所述的抑制剂是核酸抑制物。较佳地，所述的核酸抑 制物通过阻止miR-429与其祀向序列结合，从而发挥作用。所述的核酸抑制物例如选自（但 不限于）：miR-429的反义核酸，miR-429的锁核酸反义核酸；肽核酸；siRNA (沉默miR-429 前体）。
[0059] 作为本发明的优选方式，所述的miR-429的抑制剂是miR-429的反义 核酸。如本文所用，"反义核酸"又称为"反义核酸"或"反义寡核苷酸（AS-ONs， antisense-oligonucleotides) "或"反义药物"，是指长度约为15-30个碱基的DNA分子、 RNA分子它们的经修饰的形式或它们的类似物，可与mRNA互补。
[0060] 本领域人员均了解，根据本发明提供的反义核酸，可以进行适当的变化并保留其 活性，这些变化形式均可用于本发明。任何可起到抑制或沉默miR-429的作用的反义核酸 都是可用于本发明的，其类型不限于DNA或是RNA。例如，所述的miR-429的反义核酸是与 miR-429的序列基本上（较佳地为完全）互补的序列。例如，所述的miR-429的反义核酸 与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示的序列具有80%以上的相同性，较佳地具有85%以上 的相同性，更佳地具有90%以上的相同性，最佳地具有95%以上的相同性，如具有96%、97%、 98%或99%以上的相同性；或者所述的miR-429的反义核酸是SEQ ID NO:3或SEQID N0:4 所示序列的片段；它们均具有SEQ ID NO:3或SEQ ID N0:4所示序列的反义核酸相同的功 能。
[0061] 现有技术中已经指出了一些反义核酸的变化形式是可取的，它们也可以针对相 应的祀序列发挥抑制作用。如 Design and delivery of antisense oligonucleotides to block microRNA function in cultured Drosophila and human cells(NATURE PROTOCOLS ;V0L. 3N0. 10 ;2008 ; 1537-1549)文献综述了多个研究，认为一般而言，在反义核 酸的两边延长一些碱基是可以的。而在反义核酸和miRNA间亲和性很高（如锁核酸修饰） 时，反义核酸可以被截短到约2/3长度。
[0062] 在本发明中，所述的"反义核酸"还包括经修饰的反义核酸，所述的修饰基本不改 变反义核酸的活性，更佳地，所述修饰可提高反义核酸的活性、稳定性或治疗效果。对反义 核酸的修饰包括但不限于：锁核酸修饰、甲氧基化修饰、肽核酸修饰、硫代修饰、磷酸骨架由 磷脂连接骨架代替的修饰，这些修饰均是本领域技术人员易于实现的。优选地，所述的修饰 为锁核酸修饰。
[0063] 药物组合物
[0064] 本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的miR-429抑制剂，以及药学上可接 受的载体。所述的组合物可用于治疗肝癌、抑制EpCAM阳性的肝癌干细胞的增殖、自我更新 及肿瘤形成能力。任何前述的miR-429或其抑制剂均可用于组合物的制备。
[0065] 如本文所用，所述"有效量"是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和 /或动物所接受的量。所述"药学上可接受的载体"指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋 形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没 有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在组合物中药学上可接受的 载体可含有液体，如水、盐水、缓冲液。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充 齐U、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、PH缓冲物质等。所述的载体中还可以含有细胞转染 试剂。
[0066] 在得知了所述miR-429抑制剂的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所 述的miR-429抑制剂或含有其的药物组合物给药于哺乳动物。包括但不限于：皮下注射、肌 肉注射、经皮给予、局部给予、植入、缓释给予等。
[0067] 本发明所述的miR-429制剂的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程 度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定（例如 通过临床试验）。所述的因素包括但不限于：所述的miR-429抑制剂的药代动力学参数例 如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫 状况、给药的途径等。
[0068] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0069] 实施例1、miR-429过表达片段和抑制片段的制备
[0070] I、miR-429过表达试剂
[0071] 根据miR-429序列，设计miR-429过表达试剂，选自以下任一序列：
[0072] SEQ ID N0:1 :5, -UAAUACUGUCUGGUAAAACCGU-3,；
[0073] SEQ ID N0:2 :5' -TAATACTGTCTGGTAAAACCGT-3' ；
[0074] 其中使用的miR-429抑制剂，选自以下任一序列：
[0075] SEQ ID N0:3 :5, -ACGGUUUUACCAGACAGUAUUA-3,；
[0076] SEQ ID N0:4 :5' -ACGGTTTTACCAGACAGTATTA-3，。
[0077] 实施例2、miR-429过表达以及对其进行干扰，验证其对于肝癌干细胞特性的影响
[0078] EpCAM为肝癌干细胞的表面标志物。用美天旎（Miltenyi Biotech)磁珠结合 EpCAM抗体，从人肝癌细胞系HCCLM3中分选得到了 EpCAM+肝癌干细胞，随后外源转入 miR-429过表达片段或抑制片段，具体实验方法及结果如下：
[0079] 在 24 孔培养皿中接种适量 HCCLM3 (EpCAM+)细胞（500 ii 1DMEM+10%(v/v) FBS)，使 之培养24h后汇合率达到60-70%，在不同I. 5ml离心管中分别加入50 ill生理盐水，分别 加入I y g miR-429过表达核酸片段或抑制片段和2 ill JetPEI并混勻，随即将PEI溶液加 入DNA溶液，振荡混匀，室温放置15-20min，将质粒DNA-脂质体复合物滴加至细胞表面，置 5%C02，37 °C 孵箱内培养 24-48h。
[0080] 在HCCLM3 (EpCAM+)细胞中转入IOOnM miR-429过表达片段4天后，用流式细胞仪 Annexin V法分析，结果，得到EpCAM+细胞的比例从3. 86%上升到60. 8%，如图1 (应用过表 达核酸片段SEQ ID NO: 2)。该结果说明miR-429促进肝癌细胞的EpCAM+亚群的形成率，促 进肿瘤形成。
[0081] 接下来，观察过表达以及干扰miR-429表达后对分选出的肝癌干细胞 HCCLM3 (EpCAM+)形成 Spheroids 的影响。肿瘤多细胞球（Multicellular TumorSpheroids) 是一种经典的体外三维肿瘤细胞培养模型，通过模拟三维细胞网络、细胞与基质、细胞与细 胞之间的相互作用，从而能模拟人类肿瘤组织中相应的病理生理学特性，依据其形态和生 长动力学特性，其近似于肿瘤发生早期的无血管瘤或实体瘤组织中远离血管的区域）。将 转入miR-429过表达片段或抑制片段后的3000个肝癌干细胞接种到低粘附培养板上，培养 10天后发现与各自的对照相比，Spehroids数量与miR-429表达成正比，如图2 (分别应用 过表达核酸片段SEQ ID NO: 2和抑制片段SEQ ID NO:4)。该结果说明，抑制miR-429表达 可以显著降低Spheroids数量，从而可抑制肿瘤组织生长。
[0082] 实施例4、miR-429抑制片段在肝癌动物模型治疗中的应用
[0083] 为了在体内水平进一步验证miR-429抑制剂对于肝脏EpCAM+T-ICs肿瘤形成后的 治疗效果，本发明人制备了 NOD-SCID小鼠皮下荷瘤模型。
[0084] 稳定表达荧光素酶的HCCLM3细胞系的制备方法如下：
[0085] (1)使用JetPEI (购自法国PolyPlus公司，货号101-10N)转染试剂将 pGL3-control vector质粒(购自美国普洛麦格公司，货号为E1741)转染入HCCLM3肝癌细 胞中；
[0086] (2)转染后48小时，使用抗生素G418 (购自美国Life Technology公司，浓度为 800ug/ml)进行筛选；
[0087] (3)筛选3周后获得稳定表达荧光素酶的HCCLM3肝癌细胞系（HCCLM3-Luc)，用于 后续试验。
[0088] NOD-SCID小鼠皮下荷瘤模型建立方法如下：
[0089] (1)磁珠分选出HCCLM3-Luc (EpCAM+)细胞，种6孔板中；
[0090] (2) HCCLM3-Luc (EpCAM+)细胞使用 40 ii M 的 miR-429 抑制剂处理一天；
[0091] (3)阳性对照组是HCCLM3-Luc (EpCAM+)细胞使用生理盐水处理一天；
[0092] (4) 0? 25-0. 5% 的胰酶消化细胞，900rpm，3min，PBS 重悬细胞；
[0093] (5)细胞计数，调整体积，使每100 ill PBS中含2 X IO4个细胞；
[0094] (6)将含2 X IO4的HCCLM3-Luc (EpCAM+)细胞的miR-429抑制剂处理组和生理盐 水处理组分别种植到NOD-SCID小鼠(购自第二军医大学动物中心）躯干右侧皮下；
[0095] (7)记录肿瘤发生情况，肿瘤细胞种植6周成瘤后，进行活体成像，断颈处死动物， 收集肿瘤样本及血浆样本。
[0096] 活体成像分析方法如下：
[0097] (1)荷瘤小鼠麻醉后5分钟使用天平称量体重。按照每公斤体重15mg荧光素酶底 物（Beetle Luciferin, Potassium Salt,购自美国普洛麦格公司，货号为E1605)的标准，注 射相应体积的30mg/ml浓度的荧光素酶底物溶液。
[0098] (2)注射荧光素酶底物溶液后将小鼠置于小动物活体成像仪（PE公司）中对麻醉 小鼠进行成像。
[0099] (3)化学发光检测参数为：成像时间10分钟，bin值为4*4。
[0100] (4)可见光检测参数为：成像时间30毫秒，bin值为4*4。
[0101] (5)成像后采用活体成像仪内置软件对化学发光信号的强度和面积进行分析，t匕 较不同组别小鼠的化学发光信号值。
[0102] 结果发现，miR-429抑制片段对于肿瘤的生长具有显著抑制作用，如图3(应用抑 制片段 SEQ ID NO:4)。
[0103] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
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【权利要求】
1. miR-429的抑制剂的用途，用于制备治疗肝癌的药物。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物还用于：抑制EpCAM阳性的肝癌 干细胞的增殖、自我更新及肿瘤形成能力。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，miR-429抑制剂是抑制或阻止miR-429与其 靶基因结合的物质。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的miR-429抑制剂包括：miR-429的反 义核酸、miR-429的锁核酸反义核酸、siRNA ;或 携带或表达miR-429的反义核酸、miR-429的锁核酸反义核酸、siRNA的构建物。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的miR-429抑制剂包括：包含SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4所示序列的反义核苷酸，或其修饰形式。
6. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肝癌是肝细胞癌或EpCAM阳性的肝 癌。
7. -种miR-429抑制剂，其特征在于，其是：包含SEQ ID NO: 3或SEQ IDNO:4所示序 列的反义核苷酸，或其修饰形式。
8. -种miR-429的用途，用于作为筛选治疗肝癌的潜在物质的靶标；较佳地，所述的肝 癌是肝细胞癌或EpCAM+的肝癌。
9. 一种筛选治疗肝癌的潜在物质的方法，所述方法包括： (1) 用候选物质处理表达miR-429的体系；和 (2) 检测所述体系中miR-429的表达情况； 其中，若所述候选物质可降低miR-429的表达，则表明该候选物质是治疗肝癌的潜在 物质。
10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤（1)包括：在测试组中，将候选物质加 入到表达miR-429的体系中；和/或 步骤（2)包括：检测测试组的体系中miR-429的表达，并与对照组比较，其中所述的对 照组是不添加所述候选物质的表达miR-429的体系； 如果测试组中miR-429的表达在统计学上低于对照组，就表明该候选物是治疗肝癌的 潜在物质。
【文档编号】A61K48/00GK104415351SQ201310413413
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年9月11日 优先权日:2013年9月11日
【发明者】王红阳, 陈磊, 李亮, 杨文 , 唐境 申请人:中国人民解放军第二军医大学东方肝胆外科医院