多价pcv2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法

多价pcv2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法
【专利摘要】本发明涉及多价PCV2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法。本发明提供一种用于回收由猪2型圆环病毒可读框2表达的蛋白质的改进方法。还提供一种重组PCV2ORF2蛋白，和包含PCV2ORF2蛋白的免疫原性组合物。此外，提供多价组合疫苗，它们包含能有效减少PCV2感染发病率或减轻其严重性的免疫剂，优选PCV2ORF2蛋白，或者一种包含PCV2ORF2蛋白的免疫原性组合物，以及对抗猪中其它致病生物的至少一种免疫原活性组分。
【专利说明】多价PCV2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法
[0001]本申请是申请日为2006年12月28日、中国申请号为200680053576.8、发明名称为“多价PCV2免疫原性组合物和制备此类组合物的方法”的发明申请的分案申请。
[0002]序列表
[0003]本发明包括纸质和计算机可读的序列表，在此以提述方式并入其教导和内容。
[0004]发明背景
发明领域
[0005]本发明一方面涉及回收由2型猪圆环病毒(PCV2)之可读框2(0RF2)表达的蛋白质。更具体地说，该蛋白质为由转染病毒表达的重组蛋白质，该转染病毒含有2型猪圆环病毒可读框2的重组编码序列。更具体地说，容许该转染病毒感染将长培养基中的细胞，并在上清液中，而非从细胞内部回收由可读框2表达的蛋白质。再更具体地说，该方法涉及下列步骤:自2型猪圆环病毒 扩增可读框2基因，将该经扩增的部分克隆到第一载体内，从该第一载体中切下可读框2，并将其克隆到转移载体内，将转移载体和病毒载体共同转染到生长培养基中的细胞内，使细胞被病毒载体感染并藉此表达可读框2，然后在上清液中回收表达的由可读框2编码的重组蛋白质。
[0006]另一方面，本发明涉及可有效引起对抗PCV2之免疫反应的免疫组合物，以及产生这些免疫组合物的方法。更具体地说，本发明涉及一种免疫学组合物，它可有效提供免疫反应，该免疫反应保护接受该组合物的动物，并减少与PCV2感染有关的临床症状或降低其严重性。更具体地说，本发明涉及一种基于蛋白质的免疫学组合物，其赋予对抗PCV2感染的有效保护。再更具体地说，本发明涉及一种包含PCV2的0RF2的免疫学组合物，其中PCV2-0RF2的施用导致对抗PCV2感染的保护。最具体的是，本发明涉及可有效地对接受该免疫组合物的猪赋予有效免疫力的免疫组合物，且其中该组合物包含由PCV2的0RF2表达的蛋白质。
[0007]在另一方面，本发明亦提供组合疫苗或多价疫苗。更具体地说，本发明提供可有效引起对抗PCV2及至少一种其它猪致病生物所致感染的免疫反应的免疫组合物。
[0008]现有抟术描沭
[0009]2型猪圆环病毒(PCV2)是小型(直径17-22纳米)、二十面体无包膜的DNA病毒，其含有单链的环状基因组。PCV2与I型猪圆环病毒(PCVl)共享大约80%的序列同一性。然而，与通常无毒力的PCVl相反，被PCV2感染的猪显示出一种通常称为小猪断奶后多系统消耗综合征(PMWS)的症状。PMWS的临床特征在于消瘦、皮肤苍白、生长不振(unthriftiness)、呼吸窘迫、腹湾、黄疸(icterus)和黄疸(jaundice)。在一些受累的猪中，出现所有症状的组合，而在其它的猪则仅有这些症状中一者或二者。在尸体剖检中，微观和宏观损害亦出现在多种组织和器官上，淋巴器官是最常见的损害位置。已观测到PCV2核酸或抗原的量与微观淋巴损害严重性之间的强相关性。感染有PCV2的猪的死亡率可达80%。PCV2还与包括下列各项的若干其它感染相关:伪狂犬病、猪生殖及呼吸综合征(PRRS)、格拉塞氏病(Glasser’ s disease)、链球菌性脑膜炎、沙门氏菌病、断乳后大肠杆菌病、饮食性肝功能障碍(dietetic hepatosis)及化脓性支气管肺炎。
[0010]PCV2的可读框2 (0RF2)蛋白质，当在SDS-PAGE凝胶上电泳时，具有大约30kDa的分子量，从前已经利用它作为PCV2疫苗的抗原性组分。获得用于这类疫苗中的0RF2的典型方法通常由下列步骤组成:扩增编码0RF2的PCV2DNA，以0RF2DNA转染病毒载体，用含有0RF2DNA的病毒载体感染细胞，容许病毒在细胞内表达0RF2蛋白质，并通过细胞溶解，从细胞中提取0RF2蛋白质。这些程序通常在以病毒载体感染细胞之后，需花费多达4天。然而，这些程序的缺点在于提取程序昂贵且耗时。此外，从细胞中回收的0RF2量并不是很高；结果，需要以大量的病毒载体感染大量的细胞，以便获得足量的重组表达的蛋白质供用于疫苗等。
[0011]近来PCV2免疫的手段包括基于DNA的疫苗，如在美国专利第6，703，023号中描述的那些。然而，这类疫苗不能有效地赋予对抗PCV2感染及其相关临床症状的保护性免疫力。
[0012]猪生殖与呼吸综合征(PRRS)是由一种病毒引起的，到1991年才首先分离并将其分类为动脉炎病毒(arterivirus)。该疾病症状首先在1980年代中期在美国被发现，并被称为〃神秘猪病〃。它也曾被称为蓝耳病(blue ear disease)。最近提议的名称为猪动脉炎病毒。PRRS的病毒对巨噬细胞，特别是在肺中找到的那些巨噬细胞有特殊的亲和力。巨噬细胞是身体防御系统的一部分。出现在肺中的那些巨噬细胞又叫做肺泡巨噬细胞(alveolar macrophages)。它们摄取并消除入侵的细菌和病毒,但对PRRS病毒则不然。这种病毒反而在那些巨噬细胞内繁殖，产生更多的病毒，并杀死巨噬细胞。一旦这种病毒进入猪群，便往往无限期地维持存在并保持活性。高达40%的巨噬细胞被破坏，导致身体防御机制丧失了一个重要部分，使得细菌和其它病毒得以增殖并进行破坏。最常见的例子是当生长/肥育猪被PRRS病毒感染时，地方性肺炎的严重性有显著的增加。首次使整个生育畜群(breeding stock)(特别是在大的畜群中)感染可能花费一年时间，而且虽然该病毒在畜群中似乎散播很快，但可能在4-5个月时才会有至少90%的母猪变成血清-阳性。有一些母猪仍保持无经历(naive)。此外，母猪群在感染1_2年之后包含少于20%的血清学阳性动物也是屡见不鲜的。然而，这不一定意味着它们不再具有免疫力，也不意味着它们已经不再传递免疫力给它们的后代。与正在生长的猪(其排泄病毒持续1-2个月)相比较，成年动物排出病毒的时间短很多(14天)。临床情况可随着猪群不同而发生巨大的改变。作为指标，每三个头一次接触PRRS的猪群，就有一个不显示可辨认的疾病，第二个将显示轻微的疾病，而第三个则有中等到严重的疾病。其原因尚未清楚了解。然而，猪群的健康状况越好，疾病的影响就越轻。可能是病毒随着增殖而发生突变，产生一些具有高毒力的株系和一些无毒力的株系。PRRS感染所有类型的猪群，包括良好或普通健康状况的，以及室内和室外的猪群，不论大小。
[0013]猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae) (M hyo)是一被分类在枝原体科(mycopIasmataceae)中的小型细菌(400_1200nm)。M hyo 与地方性肺炎(EnzooticPneumonia)有关，这是一种在生长和肥育猪中常见的猪呼吸道疾病。M hyo攻击气管和肺上皮细胞的纤毛，引起纤毛停止振动(纤毛静止)，且最终引起肺区域的塌陷。依据疾病的程度，被感染猪的每日活增重可能减少多达17%。地方性肺炎在猪群中是广泛流传的，且几乎出现在每个猪群中。M hyo被认为是帮助PRRSV和其它呼吸道病原体进入肺内的主要病原体。已经确定了三种不同株系——232、J和7448的基因组序列(Minion等人，J.Bacteriol.186:7123-33，2004; Vasconcelos 等人，J.Bacteriol.187:5568-77，2005)。
[0014]猪增殖性肠炎(procine proliferative enteritis)是生长-肥育和年轻种猪常见的腹泻性疾病，其特征在于回肠和结肠的增生和炎症。其通常是轻微且自限的，但有时却引起持续腹泻、严重的坏死性肠炎或出血性肠炎，死亡率很高。病因是一种新近被分类的胞内细菌-细胞内劳索尼亚氏菌(Lawsonia intracellularis)。该生物仅在细胞培养中培养，而在无细胞培养基中繁殖它的尝试都没有成功。通过将细胞内劳索尼亚氏菌的纯培养物接种在以传统方式饲养的猪内；产生该疾病的典型损害，并再度从损害中分离出了细胞内劳索尼亚氏菌，从而满足了科赫法则。这种疾病的更常见的、非出血形式经常侵袭18-至36-公斤的猪，其特征为突然发作的腹泻。粪便是水状至糊状的，淡褐色或稍带血丝的。在大约2天后,猪可能排出已经在回肠中形成的黄色纤维坏死性(fibrinonecrotic)成形物(casts)。大多数受累的猪会自然恢复，但相当多发展成慢性坏死性肠炎，伴有进行性消瘦。出血形式的特征为皮肤苍白、虚弱并排出血便或黑色、焦油状粪便。怀孕的母猪可能会流产。损害可能出现在小肠下半段、盲肠或结肠中的任何地方，但最常见和明显的是在回肠。小肠壁变厚，且肠系膜可能水肿。肠系膜淋巴结变大。小肠黏膜呈现变厚且多皱纹，可能被淡褐色或黄色的纤维坏死性膜覆盖，而有时有淤斑出血。黄色的坏死性成形物可在回肠中找到，或通过结肠排出。在慢性病例中的弥漫性、完全的黏膜坏死，导致小肠变硬，很像园艺用的软管(garden hose)。增殖性黏膜损害经常发生在结肠中，但仅在尸体剖检时小心检查才能发现。在大量出血的类型中，在结肠中有红或黑色、焦油状的粪便，且在回肠中有凝固的血液。
[0015]牛病毒性腹?写病毒(BVD)和边境病(Border’s Disease)是两种病毒，它们与猪痕(猪霍乱)的病毒同属瘟病病毒(pestivirus)类群，但它们主要分别感染牛和绵羊。它们可进入猪生育畜群中，并引起生殖方面的问题。该疾病并非母猪不孕的常见原因，且从诊断的观点来看，在诸多可能原因中排名也是靠后的。
[0016]钩端螺旋体病是一种动物(包括人类)的接触传染疾病，由各种免疫学上不同的钩端螺旋体血清型引起，这些血清型中的大多数被视为问号钩端螺旋体(Leptospirainterrogans)的亚群。在猪中有五种重要的血清型和群:波摩那钩端螺旋体(pomona)、澳大利亚钩端螺旋体(australis)、塔拉索夫钩端螺旋体(tarassovi)、犬钩端螺旋体(canicola)、出血黄疸钩端螺旋体(icterohaemorrhagicae)和流感伤寒钩端螺旋体(grippotyphosa)。感染可能是无症状的，或引起各种征象，包括食欲不振、发热、倦怠、黄疸、流产、死产和其它不明确的生殖问题，以及死亡。在急性感染之后，钩端螺旋体经常局限于肾脏或生殖器官，由局灶性间质性肾炎的零星灰色小病灶组成，并从尿中排出，有时大量排出持续数月或数年。因为钩端螺旋体长时间存活于水表面，该疾病经常是水媒传播的。在美国，该疾病主要起因于哈德焦钩端螺旋体O^ptospira hardjo)、波摩那钩端螺旋体和流感伤寒钩端螺旋体等血清型。诊断可能比较困难，因为抗体效价可能是暂时存在的，持续时间不足一个月。此外，钩端螺旋体亦可在健康的动物中发现。澳大利亚钩端螺旋体布拉提斯拉瓦(Bratislava)血清型最常与生殖问题有关。慢性感染的猪群出现流产，死产和小猪虚弱。
[0017]布鲁氏菌病是由布鲁氏菌(Brucella)属的细菌引起，其特征在于流产、胎盘滞留、不孕、公猪的睾丸炎，和母猪严重的子宫炎。在小猪，该疾病之特征为后躯麻痹(posterior paralysis)和跋足(lameness)。该疾病在猪中几乎完全是由猪布鲁氏菌(Brucella suis)生物变型(biovars) 1、2和3引起的。许多其它的哺乳动物可携带猪布鲁氏菌并将其传播给猪。在未接种疫苗的猪群中感染迅速地传播并可引起许多流产。传染主要是通过接触其它的猪而发生，虽然性传播是有可能的。血清学诊断可能较困难，因为有一种相对较常见的生物-小肠结肠型耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)0:9与布鲁
氏菌有共同的抗原，且经常引起假阳性的结果。死后损害经常包括子宫炎和睾丸炎，并可包括脓肿，有时在肝脏还有坏死病灶。
[0018]梭菌(Clostridium)是普遍存在的革兰氏阳性细菌，属于梭菌科(clostridiaceae)，通常在土壤中找到，但也天然存在于大多数动物的肠道中。猪中的艰难梭菌(C.difficile)感染的特征是严重的结肠系膜水肿、腹泻和其它组织的水肿，如水胸。猪的梭菌性肠炎是由产气荚膜梭菌(C.perffingens)引起,其特征是慢性肠炎,伴随有腹泻、体重减轻和发热。被产气荚膜梭菌A、B和C型感染，引起严重的肠炎，痢疾、毒血症，而在幼牛中有高死亡率。B和C型两者皆产生高度致坏死性且致命的β毒素，它是造成严重肠损害的主因。该毒素对蛋白水解酶敏感，而病情与小肠中蛋白水解被抑制有关。已经有人提出，含有胰蛋白酶抑制剂的母猪初乳是年幼小猪易感的因素。该疾病可能引起小于I周龄小猪的突然死亡，最常见的是在出生3天内。在较大的小猪中，梭菌性肠炎引起小肠变厚，使食物和营养不易吸收。小猪通常因感染和缺乏营养的结合而死亡。死亡可能发生在数小时内，但较不严重的病例可存活数天，并可能在数天内恢复。出血性肠炎伴随黏膜溃疡是所有种类中的主要损害。在肉眼观察下，受侵袭的肠道部分为深蓝-紫色，乍看之下似乎是与肠系膜扭转相关的梗塞形成。可检查肠内容物抹片中是否有大量革兰氏-阳性杆状细菌，并制备滤液，检测毒素，然后通过与特异性抗血清的中和作用进行鉴定。
[0019]已经怀疑但尚未证实诺氏梭菌(Clostridium novyi)是喂食高水平谷类食物的牛和猪突然死亡的原因，这些牛和猪中检测不到原先存在的肝脏损害。致命且致坏死性毒素(主要是α毒素)伤害肝实质，藉此容许细菌繁殖并产生致命量的毒素。死亡通常突然发生，没有确定的征象。受累的动物往往落在兽群后面，采俯卧姿，并在数小时内死亡。大部分的病例发生在夏季和早秋，此时肝吸虫感染正值高峰期。该疾病在I至4岁大的绵羊中最为盛行，且仅限于感染肝吸虫的动物。可能不易与急性片形吸虫病区别，但动物的极急性(peractute)死亡，在尸体剖检时显示典型的损害，应疑为传染性坏死性肝炎。最具特色的损害是在肝脏中灰黄色的坏死病灶，它们经常依循着幼吸虫的迁移轨迹出现。其它常见的现象是心包囊变大，充满淡黄色的液体，并在腹膜和胸腔中有过量的液体。皮下组织中微血管通常有广泛的破裂，导致邻近皮肤变成黑色(因此俗称为“黑病”)。
[0020]败毒梭菌(Clostridium septicum)在全世界的土壤以及动物(包括人类)的肠内容物中均有发现。感染通常是通过含有失活组织、土壤或一些其它组织致弱因素(tissue-debilitant)的伤口的污染而发生的。由意外、去势、截尾、不卫生地接种疫苗和分娩引起的伤口都可能被感染。全身性，如食欲不振、中毒和高热，以及局部损害，在致易感性伤害(predisposing injury)之后数小时至数天内出现。局部损害是柔软的肿胀，压下形成凹窝，而且迅速地蔓延，这是因为形成的大量渗出液浸润受累区的皮下和肌肉内的结缔组织。气体的积累较为少见。与撕裂相关的恶性水肿的特征为明显的水肿，严重的毒血症，并在24-48小时内死亡。 [0021]破伤风毒血症是由坏死组织中的破伤风梭菌(Clostridium tetani)产生的特殊的神经毒素引起的。几乎所有的哺乳动物，包括猪，均易受该疾病感染。虽然破伤风分布在全世界，但有些地区，如美国的北落矶山脉，在土壤中很少发现该生物，在那里破伤风几乎不为人知。通常，在各大陆较温暖的地区，破伤风梭菌在土壤中的出现率以及人类感染破伤风的发病率都较高。破伤风梭菌是一种厌氧菌，有终端球状的芽孢，在土壤和肠道中都有发现。在大多数情况下，其通过伤口，特别是深的穿刺伤被导入组织内，伤口为其提供了合适的厌氧环境。
[0022]沙门氏菌属的某些种(Salmonella spp)感染可能在所有年龄的动物中导致腹泻，特别是受到应激、密集饲养或接触严重污染之食物或水源供应的那些动物。沙门氏菌病是由沙门氏菌属(salmonellae)的许多物种引起的，其临床特征为下列主要症状中的一或多种:败血症、急性肠炎和慢性肠炎。发生率随着家畜生产的密集程度而增加。虽然各种类型的沙门氏菌均可能引起猪的感染，在猪中发现的典型沙门氏菌是猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis)和鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)。大多数沙门氏菌所致的临床特征并非截然不同，而沙门氏菌属不同物种在它们的流行病学上有分歧的倾向。质粒谱(plasmid profile)和药物-抗药性模式在流行病学研究中有时是有用的标记。败血性沙门氏菌病通常与猪霍乱沙门氏菌有关。被感染的小猪不愿移动、食欲不振、高热40.5°C-41.6°C，可能还有浅咳。亦可能发现小猪死亡，且四肢发绀。猪霍乱沙门氏菌是能同时引起肺炎和腹泻的少数疾病之一，且被感染小猪的死亡率通常很高。小肠结肠炎通常与更常见的鼠伤寒沙门氏菌有关。感染的特征是黄色或水状腹泻，随着感染进行，可能含有血或黏液。死亡率低，且常与腹泻所致的脱水和钾缺乏有关。被感染动物的粪便可能污染食物和饮水、来自屠宰场的新鲜或加工肉类、用来当作肥料和饲料的植物和动物产品、牧场和牧地，以及许多惰性材料。虽然很少在饲料中发现猪霍乱沙门氏菌。它亦可能直接通过与被感染动物接触而传递。沙门氏菌可在潮湿、温暖的地方存活数个月，如在肥育猪棚或在水井中。啮齿动物和野鸟也是传染来源。感染的盛行程度在不同物种和国家之间有所不同，而且高于临床疾病的发生率，通常由于应激性状况，如突然缺乏食物、运输、干旱、拥挤、分娩，以及某些药物的施用而造成。
[0023]大肠杆菌(Escherichiacoli)是肠杆菌科(enterobacteriaceae)的细菌，是天然出现在所有哺乳动物小肠中的细菌的主要类型之一。虽然大肠杆菌通常是无害的，但有些大肠杆菌株系可产生一些外毒素和内毒素，引起感染和疾病。有一些株系主动地产生热不稳定(LT)和热稳定(ST)的外毒素，并这些毒素是引起腹泻的原因。类志贺毒素第II型变种(SLT-1Ie)、Stx2e和志贺样毒素(verotoxin)水肿病作用于小动脉壁，结果导致水肿。内毒素，如脂质A，在乳腺炎和尿道感染中扮演某种角色。大肠杆菌感染的特征在于一些不同的症状，视所涉及的具体株系而定，包括腹泻、眼窝凹陷、生长不振(unthriftiness)、可见的体重丧失、生长受阻、抑郁、肠水肿、乳腺炎、膀胱炎、肾盂肾炎和死亡。可根据细胞壁(O抗原)和细毛(fimbriae) (F抗原)将大肠杆菌分类和编码。例如，腹泻通常与大肠杆菌Abbotstown:0147、F4、F5有关，而肠水肿则与F18细毛有关。正确地确认编码，对于选择正确的疫苗是非常重要的。大肠杆菌感染危及猪的免疫系统，而死亡通常是继发感染和疾病的结果。[0024]猪痘是引起皮肤损害、丘疹、脓疱和痂的疾病。
[0025]血虫体病(eperythrozoonosis)是立克次氏体(血营养型(haemotrophic))疾病，由猪血虫体(Eperythrozoon suis)引起,猪血虫体是一种细胞外的细菌生物,其附贴在猪红细胞膜上，导致红细胞变形和损伤。该疾病之特征为贫血和黄疸(黏膜、巩膜和内耳变黄色)。它可能导致不优选的怀孕率、其它不明确的生殖问题，甚至死亡。 [0026]猪瘟也称为经典型猪瘟(Classical Swine Fever, CSF)或非洲猪瘟(ASF)，是由一种黄病毒科(Flaviviridae)病毒引起的疾病,该病毒是一种有包膜的RNA病毒；或者,在非洲猪瘟的情况下，是由与痘病毒有亲缘关系的有被膜的DNA病毒引起的。在临床上，CSF和ASF是无法区分的。最先的症状是降低活力和困乏，有一些食欲不振，且猪可能呈现寒颤。在数天内，猪出现明显的发热(41-42°C )，有时伴随有皮肤发红。接下来，猪出现结膜炎和便秘，导致淡黄色腹泻。在猪群中，猪表现出寒冷而经常挤在一起。少数的猪在死亡之前可能抽搐。猪只开始死亡时皮肤有蔓延的紫斑，且死亡经常出现在感染后10-20天内。存活的猪常发生严重的生长延迟和弓背。在已确立的猪群中，小猪在怀孕期被母亲传染，结果导致流产、干尸化、畸形、死产和出产小猪虚弱。由感染CSF母猪生下的小猪可能仍然是健康的，但在其一生中持续散布疾病。
[0027]肺炎性巴斯德氏菌症(Pneumonic pasteurellosis)和链球菌病(Streptococci),是由多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocidia)和各种链球菌引起的，最具代表性的是猪链球菌(S.suis)。被病原感染通常代表断奶后呼吸道综合征的最终阶段。临床症状呈现三种类型，急性类型最常与多杀巴斯德氏菌血清型B有关，动物出现呼吸困难、用力呼吸、心跳加剧(thumping)、高热(42.2°C )、虚脱而最后死亡。在一些病例中，腹部变成紫色。第二种类型为亚急性类型，其特征在于胸膜炎、咳嗽和呼吸困难。猪只可能大量丧失体重，并可能生长极差或没有生长，给猪流量(flow)造成严重影响。慢性类型出现偶发的咳嗽、心跳加剧和少量或没有发热。该类型通常影响10-16周龄的猪。
[0028]链球菌性脑膜炎引起脑膜一即覆盖脑的膜一的炎症反应。在吮乳小猪中，通常是由猪链球菌、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis),或有时为诸如大肠杆菌之类的杆菌(bacteria)，以及其它的链球菌引起。猪链球菌有许多血清型。在大多数的国家中，猪链球菌第I型在吮乳小猪中是主要的一种，但这在其它国家中则可能不是事实。例如，在丹麦是猪链球菌第7型。猪链球菌亦引起关节问题，特别是第I和14型。猪链球菌可在扁桃腺保留长时间，并可从母猪或从其它小猪传播给吮乳小猪。母猪在初乳中亦提供不同水平的免疫力。在吮乳小猪中，链球菌性脑膜炎散发于小猪个体中。当该生物头一次进入猪群中时，或在其继发于PRRS感染时，在吮乳小猪中链球菌性脑膜炎可能更加恶劣。
[0029]伪狂犬病(Pseudorabies)，亦称为猪狂犬病病毒、猪疱疹病毒，其中该病原为有被膜的疱疹DNA病毒。在无经历(naive)猪群中，新生的猪出现严重的中枢神经症状，从阵发痉挛(fitting)到严重的协调问题。后躯麻痹可能导致小猪的坐姿像狗。此外，死亡率高。在断奶的猪中，中枢神经症状可能有所减少，但可能伴随有呼吸道征象的增加。呼吸道疾病时常与继发感染关联。断奶的猪可能发生消耗、生长状况不佳，且经常发育受阻。在生长中的猪中，中枢神经症状进一步减少，而呼吸道症状则增加。呼吸道疾病的程度视继发感染的出现和严重性而定。在成年猪中，主要是生殖系统症状。母猪可能流产，而被感染动物在怀孕末期可能产下死胎或虚弱的小猪。在已确立的猪群中，可能几乎没有临床症状。[0030]猪流感病毒引起猪流感，并属于甲型流感病毒群。在无经历(naive)兽群中，临床症状可能爆炸性地出现，全部或许多动物同时生病。动物可能出现不活泼、抑郁、挤成一团/蜂拥和食欲不振。动物常以口呼吸，且呼吸费力。在运动时可能接着发生咳嗽。其它的临床症状包括流鼻涕和眼睛肿胀，直肠温度在40.5-41.5°C之间。在生育畜群中的高体温可导致流产、不孕、产下小而弱的幼兽，并增加死产。在已确立的兽群中，出现每年重复感染。
[0031]结肠炎螺旋体是由结肠菌毛样短螺旋体(Brachyspira pi1sicoli)细菌引起。该感染通常影响10-20周龄的生长/肥育猪。其特征在于对生长猪为非致命的消耗性腹泻，结果增加了肥育所需的天数。腹泻亦导致饲料效率的降低，并产生水状腹泻或松散的粪便。大约一半的猪可能显示出暂时或持续的水状或黏液样绿至浅棕色的腹泻，不含血。临床症状较常出现在混合和改变饲料之后10-14天。
[0032]猪痢疾(swine dysentery)是由细菌猪痢疾短螺旋体(Brachyspirahyodysentheriae)引起。目前已知有12种血清型。在已确立的猪群中，临床症状包括腹泻、在一些猪中出现迅速掉膘(loss of condition)、外观多毛、脱水、腹痛，并在其它猪显现任何症状之前有一两只猪死亡。在无经历(naive)猪群中关键性的爆发可能影响从吮乳小猪到成年母猪的所有年龄群。
[0033]传染性胃肠炎是由一种冠状病毒引起的肠道疾病。这种冠状病毒与猪呼吸道冠状病毒、流行性腹泻病毒和凝血性脑脊髓炎病毒属于相同的科。一开始的临床症状是水状腹泻、呕吐和食欲不振。小于21天的小猪通常会死亡，断奶猪变得生长不振，而生长猪、肥育猪和成猪受到的影响通常轻微，若提供适当的水将会存活。
[0034]细小病毒病(parvovirus)是特征为猪生殖系统问题的疾病。病原是小型DAN无-包膜病毒。胎儿是唯一受影响的群体，而对胎儿的影响将视遭感染时的年龄而定。在10-30天大时，感染导致胎儿的死亡和重吸收。在30-70天之间，感染导致死亡和木乃伊化。而从70天到足月，感染导致生下虚弱的小猪和木乃伊化。该疾病能够越过胎盘，然后沿着子宫移往每个胎儿。在母猪中的临床症状为死产、木乃伊化的小猪、死胎、不孕，并产生明显减少的活产后代数目。流产并非细小病毒感染的特征。
[0035]放线杆菌性大叶性肺炎，亦称为APP和嗜血性大叶性肺炎，是由细菌大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuopneumonia)所引起的。目前已描述了 15种血清型病毒(serovirus)，且临床症状之严重性在不同的血清型病毒之间及其它因素的存在下有所不同。认为血清型病毒1、5、9、10和11是较具毒力的。此外，血清型病毒1、9和11 ;2、6和8 ;以及4和7可能有交叉反应。所有年龄的猪均易感。临床症状为突然发病，结果许多动物躺倒，并出现41.5°C的直肠高温。动物通常食欲不振且不喝水，它们肢端发绀且摸起来冰冷。发绀可能扩散至全身，并在死前发生严重的呼吸困难，常用口呼吸。可能在口部和鼻孔看到带血的泡沫，通常死亡发生在24-48小时内。急性临床症状包括群体中高比例的动物不活泼，躺倒、发生40.5-51°C的直肠高温、食欲不振、严重的呼吸窘迫、咳嗽、用口呼吸、发绀、呕吐和流产。亚急性临床症状包括在猪群中有间歇的咳嗽、普通的食欲不振，且生长减退。变体(Cyrovar)第3型出现关节炎、心内膜炎和脓肿。在受到慢性影响的兽群中，每日增重可能不受影响，但可能听到间歇的咳嗽。
[0036]格拉塞氏病(Glassersdisease)是由副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)(Hps)引起的，其具有至少15种不同的类型。在世界各地均发现它，甚至在极为健康的兽群中亦出现该生物。若兽群是使用SPF或MEW技术建立的且不含Hps，则当它们首次被污染时可能造成极大的破坏，产生类似炭疽的病情，在母猪有高死亡率。在该细菌地方性流行大多数兽群中，母猪产生强的母体免疫，其正常留存它的后代中，直到8至12周龄为止。结果，感染在断奶仔畜中的影响通常是零或极小的。然而，在吮乳小猪中可能出现病情。若猪只仍受到母体抗体的保护，然后刺激它们自己的免疫反应，则通常成为亚临床感染。然而，若母体免疫在它们被感染之前消失，则可能发展出严重的疾病。这通常是在断奶之后。其亦可成为其它主要疾病，特别是地方性肺炎(EP)(肺炎枝原体)的继发病原体。在吮乳小猪中，特别是在小母猪(gilt)群中，有时有疾病爆发。Hps攻击关节的平滑表面、小肠的覆盖部分、肺、心脏和脑，引起肺炎、心包囊感染、腹膜炎和胸膜炎。它是经呼吸传播的。Hps很少在母猪中引起疾病，除非干乳期母猪是无经历的。在小母猪中偶而可见跛足或僵硬、关节和肌腱处稍微肿胀，以及罕有的脑膜炎。在小猪中，急性病情表现为:猪只迅速消沉，体温升高，无食欲，不愿起身。一次2-3下的短咳是典型特征之一。吮乳良好的小猪中的突然死亡并不少见。亦已知Hps在个别病例中引起关节炎和跛足，伴随有发热和无食欲。慢性疾病的特征是猪肤色苍白和生长状态不佳。亦可能发生突然死亡。至于断奶小猪和生长猪，患有格拉塞氏病的猪变得迅速消沉，或可能才发现就死亡了。其它的症状包括体温升高、食欲不振、不愿起身、神经症状，如痉挛和抽搐，包括脑膜炎，常导致猪状况不良、日渐消耗和多毛。在幼龄的生长猪中，下列的症状是最常见的:发热、轻微的脑膜炎、关节炎、跛足、肺炎、心包囊感染、腹膜炎和胸膜炎。同样，一次仅2-3下的短咳是典型的特征。
[0037]渗出性皮肤炎是由一种细菌-猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)引起的，
其正常生活在皮肤 上，不会引起疾病。不知为何它有时加剧，并引起皮肤炎，渗出油腻的液体。其产生毒素，毒素被吸收到体内，并伤害肝脏及肾脏。在吮乳小猪中，疾病通常限于个别的动物，但在新小母猪群和断奶猪中可能造成严重的问题。在即将产仔前的几天内，细菌在母猪的阴道内大量繁殖，使得小猪在出生过程中或出生后不久被感染。母猪的症状包括少见但局限的损害，尤其可见于在眼睛和面部后方。严重受累的小猪将会死亡。小猪中的症状包括胁部上和耳后的局限损害。损害开始时通常是面部四周或在腿上的小型、暗色、局限的感染区。沿着腹侧面和在腿之间的皮肤变成棕色，逐渐累及全身。皮肤起皱纹，伴随着大面积的剥落，并有油腻的触感。在严重的病例中，皮肤因坏死而变黑，且小猪死亡。若母猪将一些免疫力传递给小猪，则可见较局限的状况，直径大约5-10毫米的小型、界限性、不扩展的损害。至于断奶和生长猪，症状通常在断奶后大约3天开始，在脸部四周或在腿上皮肤已经受损之处有局限性的棕色感染区或皮肤炎。其可能溃疡。沿着肚子侧面和在腿之间的皮肤变成棕色，逐渐牵涉到全身。皮肤起皱纹，伴随着大面积的剥落，并发展成暗色油腻的质地，在严重的病例中变成黑色。这类病例通常因葡萄球菌体产生的毒素而死亡。在养殖场中，群体中高达15%可能被累及，且经常发生脱水。
[0038]猪丹毒是由细菌猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的,在大多数但非全部的猪场中发现。高达50%的动物可能在其扁桃腺中带有这种细菌。该细菌总是出现在猪中或环境中，因为它通过唾液、粪便或尿排泄。该细菌亦在许多其它的物种中有发现，包括鸟类和绵羊，并可在猪体外存活数周，而在轻质土中更久。因此，从畜群中除去这种细菌是不可能的。被感染的粪便或许是感染的主要来源，特别是在生长和肥育畜栏中。这种细菌可单独引起该疾病，但若同时有病毒感染，如PRRS或流感，可能引起爆发。疾病在小于8-12周龄的猪中较不常见，因为从母猪通过初乳获得的母体抗体提供了保护。最易感染疾病的动物是生长中的猪，未接种疫苗的母猪，和经产数不超过4次(up to4th parity)的母猪。该生物在体内繁殖，并侵入血流，产生败血症。然后，在猪中的繁殖速度和免疫力之水平可决定临床症状。
[0039]血虫体病(Epe)是由一种叫做猪血虫体的细菌引起的疾病，这种细菌附贴在红细胞的表面，有时破坏它们。猪可能贫血，而在细胞破坏之后留下的产物可能引起黄疸。在年幼的生长猪中最常发生临床病情。然而，它亦可能在生育畜群中引起呼吸道问题。母猪可能带有Epe但仍相当健康,然而,Epe可能越过胎盘,导致出生的小猪虚弱苍白。Epe出现在大多数但并非所有的兽群中，但还不知道是什么机制使它具有致病性，而且在一些群体中导致疾病而在其它群体中则不致病。疾病的发生率低。
[0040]脑心肌炎，或EMC，感染各种脊椎动物中并引起疾病，但猪似乎是最易感染的农场动物。该病毒遍布全世界，但在不同的国家和地区，在致病性和毒力上有差异。在大部分欧洲国家中，特别是在欧盟国家中，它有相对较轻微或非致病性的倾向，且很少在猪中诊断出该疾病。澳大利亚的株系似乎比新西兰的株系对猪的毒力强得多。佛罗里达、加勒比海和(可能的)中美洲的毒力株系，可损害心脏并引起死亡，而在美国中西部的株系有引起生殖问题的倾向。当大鼠数目增加至猖獗的程度时，猪便有发生临床疾病的倾向。猪可从大鼠被感染，或从大鼠污染的饲料或水被感染。感染似乎不会在猪之间非常迅速地散播。在受累的兽群中，断奶和生长中的猪通常没有临床症状。
[0041]奥耶斯基氏病(Aujeszky’s disease)或称AD,是由疱疫病毒引起的一种重要的猪类疾病。该病毒可在携带状态下，持续隐藏在神经内一段长时间，然后再度被活化。一旦进入兽群中，病毒通常保留在其中，且它能够不同的水平持续影响生殖功能。病毒在猪体外可存活最多3周。当有毒力的病毒株系首次影响未接种疫苗的易感染兽群时，便发生疾病的急性爆发。病毒能越过子宫和胎盘并感染胎儿。猪是主要的寄主。但狗和牛亦可被感染，显示神经症状,并死亡。
[0042]猪巨细胞病毒感染(PCMV)是由一种疱疹病毒引起的；这种病毒在全身组织中都可找到，包括新生小猪的鼻子，在那里引起炎症(鼻炎)。PCMV在全世界都有存在，并存在于差不多所有的猪群中，但大部分的感染为亚临床的，很少有临床疾病。例如，在英国进行的血清学分析指出，有超过90%的兽群已经暴露在感染之下。由该病毒产生的鼻炎是罕见的，主要发生在新生小猪，与产毒素细菌——多杀巴斯德氏菌引起的萎缩性鼻炎无关。因此，在大多数的兽群中，感染是不显著的，除了有时引起轻微的打喷嚏之外，对猪的健康没有重大影响。
[0043]蓝眼病(blue eye disease)是病毒性疾病，引起神经症状、生殖障碍和角膜不透明或变蓝。主要见于墨西哥，但在其它国家也曾有报告。未见于欧洲。症状包括无食欲、角膜不透明-结膜炎、神经症状，如阵发痉挛和抽搐、好采取犬坐姿、发热、返情(returns)增加、断奶到交配的间隔增加、死产、小猪木乃伊化的、小猪高死亡率、睾丸肿大和丧失性欲。
[0044]日本乙型脑炎病毒(JE)是由蚊子传播的病毒，且仅在昆虫盛行的国家中是重要的。它侵袭大多数的家畜。它可在人类引起脑炎。猪是重要的感染源。症状包括小猪木乃伊化或死产，小猪的神经症状，如阵发痉挛和抽搐，且在小猪中有水肿液。它还可引起公猪不孕和睾丸肿大。[0045]猪流行性腹泻(PED)是由一种冠状病毒引起的，这种病毒与引起TGE者的冠状病毒略为类似。该病毒在欧洲广泛流传。病毒损害肠绒毛，从而使吸收表面减少，伴随体液丧失和脱水。在病毒进入易感染的种畜群之后，在二至三周内出现强的免疫力。然后初乳的免疫力保护小猪。病毒通常自发地从生育畜群，特别是小型的兽群(〈300只母猪)中消失。当病毒头一次进入易感染的群体中时，便发生腹泻的急性爆发。在这类情况下，可能高达100%的母猪被侵袭，出现轻微至极度水状的腹泻。确认了两种临床现象:PED第I型仅侵袭生长中的猪，而PED第II型侵袭所有年龄，包括吮乳猪和成熟母猪。潜伏期约2天，而腹泻则持续7至14天。在吮乳小猪中，疾病可能是轻微或严重的，死亡率高达40%。在大型生育畜群，特别是大规模饲养的生育畜群中，头一次并不是所有的雌兽都被感染(first timearound)，而可能会有再发。这仅在无母体抗体的母猪的吮乳小猪中发生，因此是散发的。 [0046]猪呼吸道冠状病毒感染(PRCV)，在十多年或更久以前，首次出现在欧洲的猪只中。它与另一种冠状病毒一TGE病毒相近但不相同。人们认为这种病毒凭借风力在农场之间传播，保持兽群中没有该病毒是极为困难的。感染经常发生在2至3周龄的吮乳小猪，但不是很重要。当在慢性呼吸疾病综合征中出现其它呼吸道病原体时，它可能对肺组织有影响。母猪通常无症状，但在其它与咳嗽有关的呼吸道病原体的存在下，可能出现咳嗽。在断奶和生长猪中，头一次接触的兽群几乎没有症状。最常见的症状是短暂的咳嗽，仅持续数小时。
[0047]轮状病毒(IOtavirus)感染是一种在猪群中广泛流传的病毒感染。它出现在绝大多数猪群中，在成年牲畜中差不多有100%的血清转变。其另一流行病学特征是它在猪体外的持久性；在猪体外它对环境改变和许多杀菌剂有抗性。母体抗体持续3-6周，在此之后猪成为易受感染的，但接触不一定会导致疾病。估计猪中仅有10-15%的腹泻是由原发的轮状病毒感染引起的。在成熟兽群中，在小猪7至10天大之后出现病情。随着年龄增长而越来越不重要。然而，若存在致病的大肠杆菌株系，可能发生严重的病情且死亡率很高。
[0048]狂犬病是由病毒引起，而在猪则被视为一种罕见的疾病。它在所有物种包括人类中都是致命的，因此极为重要。狂犬病在英国没有，但在世界上的其它国家中都有出现。很少感染小猪和母猪。在母猪、断乳小猪和生长猪中，疾病发生是突然的，症状包括脸部肌肉的神经性痉挛、阵发痉挛和抽搐、快速地咬、流唾、肌肉发生痉挛，并可能出现后躯麻痹。通常在3天内死亡。
[0049]猪水疱病(SVD)是与引起口蹄疫(FMD)的病毒不同的病毒。然而，它在猪身上产生的疾病，在临床上与FMD无法区别。若突然普遍出现跛足，且在口鼻部、舌和爪尖有水泡或脓泡，便应认为是该疾病。
[0050]结核病侵袭哺乳动物，包括人、鸟类和猪。病原体结核分枝杆菌，分成人型、牛型和鸟型。鸟型又叫做鸟分枝杆菌(M.avium)或更常称为鸟/胞内(avian/intracellulare)复合体，因为它不是均一存在的物种。鸟分枝杆菌本身主要感染鸟类，但也在环境中与胞内分枝杆菌(M.1ntracelIulare) —起被发现,其主要是腐生的,不需活体。猪很少被人或牛型感染，但经常被鸟/胞内复合体感染。鸟/胞内复合体亦在健康的人中引起亚临床非进行性的感染。主要的担忧是它可能在免疫抑制的人和患有AIDS的人中引起更严重的疾病。在大多数国家中，若在屠体颈部发现损害，整个头部就要禁止使用，若在引流肠的肠系膜淋巴结中发现损害，则内脏禁止使用。若在体内更广泛散布——这种情况很少见——则可能禁止使用整个屠体或将其进行蒸煮。若肉品检查员漏检了小的损害，正常的厨房烹煮将会破坏该生物。在所有的猪中，感染在颈部和引流小肠的淋巴结中引起小结节。在绝大多数的病例中，损害是非进行性的，不会散播到全身，也不会使猪生病且不会被排出。没有临床症状，且感染和未感染猪之间在表现上并无差异。
[0051]猪水疱疹(VES)病毒与引起口蹄疫(FMD)和猪水疱病(SVD)的那些病毒不同，但它在猪身上产生的疾病在临床上与FMD和SVD无法区别。和FMD不同，它仅影响猪。症状包括低死亡率，但在吮乳小猪可能有一些死亡。其它的症状包括流唾、无食欲，并在嘴、鼻、舌和足部周围有水泡。
[0052]水泡性口炎(VS)引起的疾病，主要发生在南美洲和中美洲，偶尔发生在美国，极少数情况下在北至加拿大南达阿根廷的范围内流行。VS病毒在猪身上产生的疾病，在临床上与FMD、SVD和VES无法区别。然而，感染的猪最常是亚临床的。在所有的猪中，感染的特征为流唾、足部损害和跛足、生长速率降低、体温升高至40-41°C (106-107 °F )，在鼻、唇和乳头上，以及在蹄冠周围出现直径最高达30毫米的水泡(脓泡)，这可能使猪跛足。死亡率通常很低，大部分的猪在一到两周内恢复。 [0053]萎缩性鼻炎，进行性和非进行性疾病，其引起鼻子的炎症，可能由各种细菌和刺激性物质引起。在感染过程中，伤害鼻内细致的结构和鼻甲骨，使其萎缩并消失。进行性萎缩性鼻炎，是指鼻组织永久萎缩的特定疾病。它是由特定的产毒素型多杀巴斯德氏菌菌株(PMt)引起的。分A和D两型。在吮乳猪中，最先的症状是打喷嚏、鼻塞和流鼻涕，但在急性爆发且几乎没有母体抗体时，鼻炎可能严重到鼻子流血的程度。到三至四周龄为止，并从断奶开始，有泪液污染和鼻子扭曲与缩短(twisting and shortening)之畸形的证据。受到严重影响的猪，可能有进食的问题。有降低很多的每日增重。在严重爆发的猪只中，可能无法生长至上市的体重。
[0054]东方马脑炎病毒(EEEV)是披盖病毒科(Togaviridae), α病毒(alphavirus)属的成员。当被感染的蚊子叮咬时，EEEV可传播给马和人类。除了马和人类之外，EEEV可在普通的家畜中产生严重疾病，如猪和牛。已经从鸟类,如火鸡、雉、鹌鹑、驼鸟和鸸鹋中回收了 EEEV或病毒特异性的抗体。
[0055]枝原体关节炎是由猪关节液枝原体(Mycoplasma hyosynoviae)感染引起的。该关节炎之特征为一个或多个关节的炎症，且常见于所有吮乳和生长猪，以及母猪中。然而，在小猪中很少发生。
[0056]腺病毒和凝血性脑脊髓炎病毒亦可引起猪的感染。
[0057]因此，在本领域中，需要一种获得0RF2蛋白质，但不需从被感染的细胞内提取0RF2蛋白质的方法。更需要以足以高效地制备疫苗组合物的量获得重组0RF2蛋白质的方法。更需要无需像现有0RF2蛋白质提取规程所需的复杂且劳动力密集的方法，而能够获得0RF2蛋白质的方法。最后，关于组合物，在本领域中，需要免疫组合物，其赋予对抗PCV2感染的保护性免疫力，并减轻与其相关的临床体征的严重性或预防与其相关的临床体征。
发明概要
[0058]本发明克服了在现有技术中固有的问题，并为现有技术发展水平提供了明显的进步。具体而言，本发明的一方面提供了用于产生和/或回收重组PCV20RF2蛋白质的改进方法，所述方法i)通过容许含有PCV20RF2DNA编码序列的重组病毒载体感染培养中的易感细胞，其中该重组病毒载体表达0RF2蛋白质，并ii)随后回收上清液中的0RF2。已经意外地发现，若容许感染和后续的感染细胞培养越过(progress past)现有技术中典型的PCV20RF2回收过程(该过程从细胞内提取PCV20RF2)，便会释放大量的0RF2至上清液中。而且，亦已经意外地发现，PCV 0RF2蛋白质对于生产细胞外部的原型降解作用(prototypicaldegradation)是鲁棒(robust)的。这两个发现共同容许从利用含有PCV20RF2DNA并表达PCV20RF2蛋白质的重组病毒载体感染的细胞培养上清液中回收高量的PCV20RF2蛋白质。高量的PCV20RF2蛋白质意指超过大约20 μ g/ml上清液，优选超过大约25 μ g/ml，更优选超过大约30 μ g/ml,甚至更优选超过大约40 μ g/ml,甚至更优选超过大约50 μ g/ml,甚至更优选超过大约60 μ g/ml,甚至更优选超过大约80 μ g/ml,甚至更优选超过大约100 μ g/ml,甚至更优选超过大约150 μ g/ml,最优选超过大约190 μ g/ml。亦可通过在实施例1至3中描述的方法达到那些表达率。
[0059]优选的细胞培养物具有在大约0.3-2.0xlO6个细胞/mL之间的细胞计数，优选从大约0.35-1.9xl06个细胞/mL，甚至更优选从大约0.4-1.8xl06个细胞/mL，甚至更优选从大约0.45-1.7xl06个细胞/mL，而最优选的是从大约0.5-1.5xl06个细胞/mL。优选的细胞可以由本领域技术人员加以决定。优选的细胞是易于利用含有PCV20RF2DNA的适当重组病毒载体加以感染，并表达PCV20RF2蛋白质的那些细胞。该细胞优选地是昆虫细胞，更优选其包括以商标名Sf+昆虫细胞市售的昆虫细胞(Protein SciencesCorporation, Meriden, CT)。
[0060]适当的生长培养基亦可由本领域技术人员决定，优选的生长培养基是不含血清的昆虫细胞培养基，如Excell420 (JRH Biosciences, Inc.，Lenexa, KS)等等。优选的病毒载体包括杆状病毒，如 BaculoGold (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA),特别是在生产细胞为昆虫细胞时。虽然杆状病毒表达系统是优选的，但本领域技术人员了解其它的表达系统对本发明的目的，即表达PCV20RF2至细胞培养物的上清液中也是有用的。这类其它的表达系统可能需要使用信号序列，以便将0RF2表达至培养基内。已经意外地发现，当由杆状病毒表达系统产生0RF2时，不需要任何信号序列或进一步的修饰来使0RF2表达在培养基内。人们认为该蛋白质可独立地形成类病毒颗粒(Journal of GeneralVirology第81册，第2281-2287页(2000))，并被分泌至培养物上清液中。重组的病毒载体含有PCV20RF2DNA序列，当用来感染易感细胞时，具有在大约0.03-1.5之间的优选感染复数(MOI)，更优选从大约0.05-1.3，甚至更优选从大约0.09-1.1，而最优选的是从大约0.1-1.0。上文提及的优选MOI是相对于ImL细胞培养液。优选的是，在本文中描述的方法包括使用含有PCV20RF2DNA并表达PCV20RF蛋白质的重组病毒载体，以大约0.03-1.5，更优选大约0.05-1.3，甚至更优选大约0.09-1.1，最优选大约0.1-1.0的MOI (感染复数)感染0.35-1.9xl06个细胞/mL，更优选大约0.4-1.8xl06个细胞/mL，甚至更优选大约0.45-1.7xl06个细胞/mL,最优选大约0.5-1.5xl06个细胞/mL。
[0061]然后培养被感染的细胞最多10天，更优选大约2天到大约10天，甚至更优选大约4天到大约9天，最优选从大约5天到大约8天。优选的培养条件包括在大约22-32°C之间的温度，优选的是从大约24-30°C，更优选从大约25-29°C，甚至更优选从大约26-28°C，最优选的是大约27°C。优选的是，在接种之后观察Sf+细胞中杆状病毒诱导的独特变化。这类观察可包括监视感染后的期间内细胞密度的动向和存活率的降低。结果发现，在感染后3-5天观察到病毒效价的高峰，并且在第5到8天之间，和/或当细胞存活力降低至10%以下时，ORF2从细胞中到上清液中的释放达到高峰。[0062]因此，本发明的一个方面提供一种用于产生和/或回收(优选以上文所述的量)重组PCV20RF2蛋白质的改良方法，所述方法是通过i)容许用重组病毒以如上文定义的MOI载体感染若干培养中的易感染细胞(参见上文)，ii)由该重组病毒载体表达0RF2蛋白质，且iii)然后，从感染后5-8天之间和/或细胞活力降低至10%以下(时)获得的细胞的上清液中回收PCV20RF2。优选的是，重组病毒载体是含有PCV20RF2DNA编码序列的重组杆状病毒，且该细胞为Sf+细胞。此外，最好在感染之后的期间内周期性地检查培养物中污染的宏观和微观证据，或是细胞形态学上的非典型变化。任何培养物出现任何污染时均应予以抛弃。优选的是，所表达的0RF2重组蛋白质被细胞分泌至维持细胞生存的周围生长培养基内。然后从细胞周围的上清液中，而不是从细胞本身中回收0RF2。
[0063]回收过程优选以分离培养基中的细胞碎屑与被表达的0RF2的分离步骤开始。优选的分离步骤包括过滤、以最高达大约20，OOOxg的速度离心、连续流离心、使用离子交换或凝胶过滤的层析分离，以及传统的免疫亲和法。那些方法均为本领域技术人员已知的，例如(Harris和Angel (编辑)，Protein purification methods-a practical approach, IRLpress 0xfordl995)。最优选的分离法包括以高达大约20，OOOxg的速度离心，以及过滤。优选的过滤法包括封端(dead end)式微量离心，以及切向流(或交叉流)过滤，包括中空纤维过滤封端式微滤(dead end microfiltration)。其中,封端式微滤是优选的。封端式微滤的优选孔大小是在大约0.30-1.35微米之间，更优选在大约0.35-1.25微米之间，甚至更优选在大约0.40-1.10微米之间，最优选在大约0.45-1.0微米之间。相信任何常规的过滤膜均适合可实现本发明目的，但优选的是聚醚砜膜。在过滤步骤期间，移除任何低分子量(low weight)的核酸种类。
[0064]因此，本发明的另一个方面提供一种用于产生和/或回收(优选以上文所述的量)重组PCV20RF2蛋白质的改良方法，所述方法通过i)容许用重组病毒以如上文定义的MOI载体感染若干培养中的易感染细胞(参见上文)，?)由该重组病毒载体表达PCV 0RF2蛋白质，iii)从感染后5-8天之间和/或细胞活力降低至10%以下(时)获得的细胞的上清液中回收PCV20RF2，并iv)通过分离步骤分离细胞碎屑与已表达的PCV20RF2。优选的是，该重组病毒载体是含有PCV20RF2DNA编码序列的重组杆状病毒，且该细胞为Sf+细胞。优选的分离步骤是上述的那些。最好是使用孔大小为大约0.30-1.35微米之间，更优选大约0.35-1.25微米之间，甚至更优选大约0.40-1.10微米之间，最优选大约0.45-1.0微米之间的膜进行封端式微滤。
[0065]为了回收将用于免疫原性或免疫学组合物(如疫苗)的PCV20RF2，优选包含失活化步骤，以便使病毒载体失活。〃免疫原性或免疫学组合物〃意指这样的物质的组合，其包括至少一个在宿主中诱发免疫反应的抗原，该免疫反应是针对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫反应。通常，"免疫反应"包括但不限于一或多个下列效应:特异地针对感兴趣之组合物或疫苗中所含的抗原的抗体、B细胞、T辅助细胞、抑制性T细胞，和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞的产生或激活。优选的是，宿主将展现治疗性或预防性免疫反应，从而提高对新感染的抵抗力，和/或降低疾病的临床严重性。这样的保护作用表现为:减少或消除被感染宿主通常展现的症状、加快恢复时间，和/或降低在被感染宿主中的病毒效价。因此，本发明还涉及用于产生和/或回收(优选以上文所述的量)重组PCV20RF2蛋白质的方法，所述方法是通过i)容许用重组病毒以如上文定义的MOI载体感染若干培养中的易感染细胞(参见上文)，?)由该重组病毒载体表达PCV 0RF2蛋白质，iii)从感染后5-8天之间和/或细胞活力降低至10%以下(时)获得的细胞的上清液中回收PCV20RF2，iv)通过分离步骤分离细胞碎屑与已表达的PCV20RF2，并V)使该重组病毒载体失活。
[0066]优选的是，在即将进行过滤步骤之前或之后马上实施失活化，而优选的失活化时间是在过滤步骤之后。任何传统的失活化方法均可用于本发明的目的。因此，可通过化学和/或物理处理进行失活化。在优选的形式中，测定收获液的体积，并使温度达到大约32-42°C之间，更优选在大约34-42°C之间，最优选大约35_39°C之间。优选的失活化方法包括加入环化二元氮丙啶(BEI)，优选是以大约I至大约20mM的浓度，更优选的是大约2至大约IOmM,更优选大约2至大约8mM,甚至更优选大约3至大约7mM,最优选的是大约5mM。例如，失活化包括在液体中加入优选为大约0.4M的2-溴乙撑胺氢溴化物的溶液(其已经在0.3N NaOH中被环化成0.2M的二元氮丙啶(BEI))，得到终浓度大约5mM的BEI。优选的是，然后持续搅拌该液体72-96小时，并可将失活的收获液冷冻储存在_40°C或更低，或在大约1-7°C下。在完成失活化之后，加入硫代硫酸钠溶液，优选是1.0M，中和任何残余的BEI。优选的是，加入的硫代硫酸钠与先前为了失活化而加入的BEI相比是等量的。例如在加入EBI至终浓度为5mM的情况下，加入1.0M硫代硫酸钠溶液，得到5mM的最低终浓度，以中和任何残余的BEI。
[0067]因此，本发明更进一步的一个方面涉及一种产生重组PCV20RF2蛋白质(优选以上文所述的量)的方法，该方法是通过i)容许用重组病毒以如上文定义的MOI载体感染若干培养中的易感染细胞(参见上文)，?)由该重组病毒载体表达PCV 0RF2蛋白质，iii)从感染后5-8天之间和/或细胞活力降低至10%以下(时)获得的细胞的上清液中回收PCV20RF2, iv)通过分离步骤分离细胞碎屑与已表达的PCV20RF2，并V)使该重组病毒载体失活。优选的是，该重组病毒载体是含有0RF2DNA编码序列的杆状病毒，且该细胞为Sf+细胞。优选的分离步骤是上述的那些，最优选是过滤步骤。优选的失活化步骤是上述的那些。优选的是，在大约35-39°C之间，在2至8mM BEI的存在下，更优选在大约5mM BEI的存在下进行失活化。已经意外地发现，较高浓度的BEIJ^ PCV20RF2蛋白质有负面的影响。
[0068]根据本发明更进一步的方面，上述的方法还包括在步骤V)之后的中和步骤。该步骤vi)包括加入等量的中和溶液内的失活剂的试剂。优选的是，若失活剂是BEI，则优选加入等量的硫代硫酸钠。因此，根据另一个方面，当失活剂为BEI时，步骤vi)包括加入硫代硫酸钠溶液至大约I至大约20mM的终浓度,优选的是大约2至大约10mM，更优选大约2至大约8mM,甚至更优选大约3至大约7mM,最优选是大约5mM。
[0069]在优选的形式中，且特别是重组PCV20RF2蛋白质将用于免疫组合物，如疫苗的形式中，对每一批收获的0RF2，通过在贴壁依赖性、杆状病毒易感性的Sf+细胞中传代来测试其失活情况。在这种测试方法的优选形式中，以1.0mL失活的PCV2液接种150cm2的适当细胞培养物单层，并维持在25-29°C下14天，传代至少两次。在维持期结束时，对细胞单层检查PCV20RF2杆状病毒典型的致细胞病变作用(CPE)。优选的是，亦使用阳性细胞对照组。这类对照组可由一个以未失活参考PCV20RF2杆状病毒接种的Sf+细胞培养物，以及一瓶保持未接种的Sf+细胞组成。在培养和传代之后，若在BEI处理病毒液中没有病毒感染的细胞，则是令人满意的失活测试。以参考病毒接种的对照组细胞应显示PCV20RF2杆状病毒典型的CPE，而未接种烧瓶应该不显示任何PCV20RF2杆状病毒CPE的迹象。或者，在维持期间结束时，可收集上清液试样，接种在载有Sf+细胞的Sf+96孔培养板上，维持在25-29°C下5-6天。然后固定该板，并用与FITC偶联的抗-PCV20RF2抗体染色。若通过IFA显微镜检查在BEI处理的病毒液中没有CPE和0RF2表达，则是令人满意的失活测试。以参考病毒接种的对照组细胞，应显示CPE和IFA活性，而未接种的瓶则不应显示任何PCV20RF2杆状病毒CPE的迹象，且不含IFA活性。
[0070]因此，本发明更进一步的方面涉及一种用于测定重组病毒载体失活化的有效性的失活测试，包括步骤:i)使至少一部分含重组病毒载体的培养液与失活剂接触，优选如上述的失活剂，ii)加入中和剂来中和失活剂，优选如同上述，并iii)通过如上述测定法测定残余的感染性。
[0071]本发明更进一步的方面涉及一种用于构建重组病毒载体的方法，所述重组病毒载体含有PCV20RF2DNA，并在感染至易感细胞内时以高量表达PCV20RF2蛋白质。意外地发现，本文提供的重组病毒载体在感染易感细胞之后，以如上所述的高量表达PCV20RF2。因此，本发明还涉及一种用于产生和/或回收PCV20RF2蛋白质的改良方法，优选包括下列步骤:构建含有PCV20RF2DNA的重组病毒载体并表达PCV20RF2蛋白质。优选的是，该病毒载体为重组的杆状病毒。构建本文提供的含有PCV20RF2DNA并表达PCV20RF2蛋白质的重组病毒载体的方法的细节，描述如下:在优选的形式中，通过将其中克隆了 0RF2基因的转移载体转染至病毒载体内，来产生用于感染细胞的、含有PCV20RF2DNA并表达PCV20FR2蛋白质的重组病毒载体。优选的是，仅将转移载体中含有0RF2DNA的部分转染到病毒载体内。"转染至病毒载体内〃 一词用作 〃导入〃或〃克隆〃异源DNA至病毒载体内的同义词，如导入杆状病毒载体内。该病毒载体优选是但不必是杆状病毒。
[0072]因此，根据本发明更进一步的方面，重组病毒载体是通过在含有异源PCV20RF2DNA的转移载体和病毒载体之间的重组作用而产生的，所述病毒载体优选是杆状病毒，更优选是线性化的复制缺陷的杆状病毒(如Baculo Gold DNA)。〃转移载体〃意指这样的DNA分子，其包括至少一个复制起点、异源基因(在本案中为PCV20RF2)、以及容许克隆该异源基因至病毒载体内的DNA序列。优选地，容许克隆异源基因至病毒载体内的序列位于该异源基因的侧翼。甚至更优选地，那些位于侧翼的序列与病毒载体的序列至少部分上是同源的。该序列同源性容许两个分子一一病毒载体和转移载体一发生重组，产生含有异源基因的重组病毒载体。一种优选的转移载体为PVL1392载体(BD Biosciences Pharmingen),它被设计用于与BaculoGold DNA共转染至优选的Sf+细胞株内。该转移载体优选包括PCV20RF2DNA。共染的构建体约为10，387个碱基对长。
[0073]在更优选的形式中，本发明的方法将以PCV20RF2DNA的分离开始。通常，这可来自已知或未知的株系，因为0RF2DNA似乎是高度保留的，在不同的分离株之间有至少大约95%的序列同一性。为了本发明的目的，可使用本领域中已知的任何PCV20RF2基因，因为每一个都将表达到上清液中。优选使用PCR法扩增PCV 0RF2DNA，更优选同时导入5’侧翼Kozak’s 共有序列(CCGCCAUG) (SEQ ID NO:1)和 / 或 3’ 侧翼 EcoRl 位点(GAATTC) (SEQ ID NO: 2)。所述5’ Kozak's共有序列的导入优选导致PCV20RF2的天然存在之起始编码子AUG的去除。3’ EcoRl位点优选被导入在PCV20RF2之终止编码子的下游。更优选的是，它被导入在多聚A转录终止序列的下游，多聚A转录终止序列自己则位于PCV20RF2终止密码子的下游。已经发现Kozak’s共有序列的使用，特别是如上述的使用，会增加随后PCV20RF2蛋白质的表达水平。将扩增后PCV20RF2DNA及这些额外的序列一起导入载体内。一种适合这个初步克隆步骤的载体是pGEM-T-Easy载体(Promega, Madison, WI)。优选是在Notl限制位点从载体中切下包含一些PGEM载体序列(SEQ ID NO: 7)的PCV20RF2DNA。然后将所得的DNA克隆到转移载体内。
[0074]因此，在本发明的一个方面中，提供一种用于构建含有PCV20RF2DNA的重组病毒载体的方法。该方法包括下列步骤:i)将重组的PCV20RF2克隆到转移载体内，并ii)将转移载体的含有重组PCV20RF2的部分转染到病毒载体内，产生重组的病毒载体。优选的是，该转移载体是如上所述的，或是按照如上所述构建的，或在图1中例举的那样构建的。因此，根据更进一步的一个方面，用来构建如上述之重组病毒载体的转移载体含有SEQ IDNO:7的序列。
[0075] 根据更进一步的一个方面，该方法在步骤i)之前，还包括下列步骤:在体外扩增PCV20RF2DNA,其中按照上述修饰PCV20RF2DNA的侧翼序列。在体外扩增PCV20RF2DNA并修饰该侧翼序列，在体外将经扩增之PCV20RF2DNA克隆到转移载体内的方法，以及适当的转移载体，已在上文中描述、在图1中举例说明，或是本领域技术人员已知的。因此，根据更进一步的方面，本发明涉及构建含有PCV20RF2DNA并表达PCV20RF2蛋白质之重组病毒载体的方法，包括下列步骤:i)在体外扩增PCV20RF2DNA，其中修饰该PCV20RF2DNA的侧翼序列，ii)将经扩增之PCV20RF2DNA克隆到转移载体内，并iii)将转移载体或其含有重组PCV20RF2DNA的部分转染至病毒载体内，产生重组的病毒载体。优选如上文所述进行PCV20RF2DNA之侧翼序列的修饰，例如通过导入5’ Kozak’s序列和/或EcoRl位点，优选如上文所述的方式进行。
[0076]根据更进一步的方面，提供一种用于产生和/或回收由PCV2的可读框2表达的重组蛋白质的方法。该方法通常包括下列步骤:i)将重组PCV20RF2克隆到转移载体内，ii)将转移载体中含有重组PCV20RF2的部分转染到病毒内，iii)用被转染的病毒感染在培养基中的细胞，iv)使经转染的病毒从PCV20RF2表达重组蛋白质，v)分离细胞与上清液；并vi)从上清液中回收已表达的PCV20RF2蛋白质。
[0077]在上文中描述了如何将重组的PCV20RF2DNA克隆到转移载体内的方法。优选的是，转移载体含有SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4或SEQ ID N0:7的序列。然而，转移载体可含有任何未经修饰或经修饰的PCV20RF2DNA，只要该PCV20RF2DNA被转染至重组病毒载体内时，在细胞培养物中表达即可。优选的是，该重组病毒载体包括SEQ ID NO: 8之序列。此外，在上文中详述了如何感染细胞的方法，优选是如何以一定数目的含有PCV20RF2DNA并表达PCV20RF2蛋白质的重组杆状病毒来感染昆虫细胞的方法。再者，还在上文中详述了分离细胞与上清液的步骤，以及回收已表达之PCV20RF2蛋白质的步骤。在本文中描述的任何这些具体的处理步骤，均为如上文所述的用于产生和/或回收由PCV2的可读框2表达的重组蛋白质之方法的一部分。优选的是，该细胞为Sf+细胞。更优选地，细胞培养物具有在大约0.3-2.0xlO6个细胞/mL之间的细胞计数，更优选从大约0.35-1.9xl06个细胞/mL,甚至更优选从大约0.4-1.8xl06个细胞/mL，甚至更优选从大约0.45-1.7xl06个细胞/mL,最优选的是从大约0.5-1.5xl06个细胞/mL。优选的是，当用来感染易感细胞时，含有PCV20RF2DNA之重组病毒载体具有在大约0.03-1.5之间的优选感染复数(MOI)，更优选从大约0.05-1.3，甚至更优选从大约0.09-1.1，甚至更优选从大约0.1-1.0，最优选的是大约0.5。优选是在感染后5-8天之间，和/或细胞存活力降低至10%以下时所获得之细胞的上清液中回收PCV20RF2蛋白质。为了产生PCV20RF2蛋白质，优选将细胞培养在25至29°C下。优选的分离步骤是离心或过滤步骤。
[0078]任选地，该方法可包括在将PCV20RF2DNA克隆到转移载体内之前，扩增来自PCV2株系之PCV20RF2DNA的步骤。在优选的形式中，还可在被扩增的序列中加入5’ Kozak’s序列、3’ EcoRl位点及其组合，优选是在扩增作用之前或期间加入。优选的5’ Kozak's序列包括SEQ ID NO:1。优选的3’EcoRl位点包括SEQ ID NO:2。优选的PCV20RF2DNA包括核苷酸序列 Genbank 登录编号 AF086834 (SEQ ID NO: 3)和 SEQ ID NO: 4。优选的重组 PCV20RF2蛋白质包括SEQ ID NO: 5的氨基酸序列，它是由SEQ ID NO: 3 (Genbank登录编号AF086834)编码的蛋白质，以及SEQ ID NO:6的氨基酸序列，它是由SEQ ID N0:4编码的蛋白质。优选的培养基包括不含血清的昆虫细胞培养基，更优选EXcell420培养基。当进行任选的扩增步骤时，优选是先将扩增后的可读框2克隆到第一个载体内，从该第一个载体中切下可读框2，并使用切下来的可读框克隆至转移载体内。优选用于共转染的细胞株是Sf+细胞株。优选用于共转染的病毒是杆状病毒。在该方法的优选形式中，转移载体中被转染的部分包括SEQ ID N0:8。最后，对该方法而言，优选在以病毒感染细胞之后至少5天，回收在细胞培养上清液中的PCV2可读框2(0RF2)蛋白质。 [0079]因此，本发明更进一步的方面涉及一种产生和/或回收PCV2可读框2的方法，包括下列步骤:i)在体外扩增PCV20RF2DNA，优选是通过加入5’ Kozak's序列和/或加入3’EcoRl限制位点，ii)将经扩增之PCV20RF2克隆到转移载体内；iii)将转移载体之含有重组PCV20RF2的部分转染到病毒内；iv)以经转染的病毒感染在培养基中的细胞；v)使该经转染的病毒从PCV20RF2表达重组蛋白质；vi)分离细胞与上清液；并vii)从上清液中回收已表达的PCV20RF2蛋白质。
[0080]本发明的一个更进一步的方面涉及制备包含PCV20RF2蛋白质和失活病毒载体的组合物的方法。该方法包括下列步骤:i)将经扩增之PCV20RF2克隆到转移载体内；ii)将转移载体之含有重组PCV20RF2的部分转染到病毒内；iii)以经转染的病毒载体感染在培养基中的细胞；iv)使该经转染的病毒载体从PCV20RF2表达重组蛋白质；v)分离细胞与上清液；vi)从上清液中回收已表达的PCV20RF2蛋白质；并^丨)使重组病毒载体失活。优选的是，该重组病毒载体是含有PCV20RF2编码序列的杆状病毒，而该细胞是Sf+细胞。优选的分离步骤是上述的那些，优选是过滤步骤。优选的失活步骤是上述的那些。优选的是，在大约35-39°C下，在2至8mM BEI的存在下，更优选在大约5mM BEI的存在下进行失活化。已经意外地发现，较高浓度的BEI对PCV20RF2蛋白质有负面的影响，而较低浓度则不能在24至72小时的失活期间内有效地使病毒载体失活。优选的是，失活化进行至少24小时，更优选24至72小时。
[0081]根据更进一步的方面，如上文所述的制备包括PCV20RF2蛋白质和失活病毒载体的组合物的方法，在步骤vii)之后还包括中和步骤。该步骤viii)包括加入等量的能中和溶液中失活剂的试剂。优选的是，若失活剂为BEI，优选加入等量的硫代硫酸钠。因此，根据更进一步的方面，当失活剂为BEI时，步骤viii)包括加入硫代硫酸钠溶液至大约I至大约20mM的终浓度,更优选大约2至大约IOmM,甚至更优选大约2至大约8mM,甚至更优选大约3到大约7mM，最优选的是大约5mM。
[0082]根据更进一步的方面，如上文所述的制备包括PCV20RF2蛋白质和失活病毒载体之组合物的方法，在步骤i)之前，包括下列步骤:在体外扩增PCV20RF2DNA，其中如上文所述修饰PCV20RF2DNA的侧翼序列。用于在体外扩增PCV20RF2DNA并修饰侧翼序列、在体外将经扩增之PCV20RF2DNA克隆到转移载体内的方法，以及适当的转移载体，已在上文中描述、在图1中举例说明，或者是本领域技术人员已知的。因此，根据更进一步的方面，该方法包括下列步骤:i)在体外扩增PCV20RF2DNA，其中修饰该PCV20RF2DNA的侧翼序列，ii)将经扩增之PCV20RF2DNA克隆到转移载体内；并丨^)将转移载体或其含有重组PCV20RF2DNA的部分转染到病毒载体内，产生重组的病毒载体；iv)以经转染病毒感染在培养基中的细胞；V)使该经转染的病毒从PCV20RF2表达重组蛋白质；vi)分离细胞与上清液；vii)从上清液中回收已表达的PCV20RF2蛋白质；viii)使该重组病毒载体失活，优选的是在大约I到大约20mM BEI的存在下，优选是在大约5mM BEI的存在下；和ix)加入等量的中和剂来中和溶液中的失活剂，当失活剂为BEI时，优选的是加入硫代硫酸钠溶液至大约I至大约20mM的终浓度，优选是大约5mM。
[0083]在本发明另一项方面中，提供了一种用于制备诱发对抗PCV2的免疫反应的组合物，优选抗原性组合物，例如疫苗的方法。通常，该方法包括将构建体转染到病毒内的步骤，其中该构建体包括i)得自PCV2之0RF2的重组DNA，ii)以经转染病毒感染在生长培养基中的细胞，iii)使该病毒从PCV20RF2表达重组蛋白质，iv)从上清液中回收已表达的0RF2蛋白质，和V)通过将回收的蛋白质与适当的佐剂和/或可药用载体组合来制备组合物。
[0084]当在本文中使用〃佐剂〃 一词时，可包括氢氧化铝和磷酸铝、皂角苷，例如Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA)、GP1-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.，Birmingham, A L)、油包水乳剂、水包油乳剂、水包油包水乳剂。乳剂特别是以轻质液状石蜡油(欧洲药典型式)；来自链烷，特别是异丁烯或癸烯的低聚作用的类异戊二烯油，如角鲨烷或角鲨烯油；含有直链烷基基团之酸或醇的酯类，特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二 _(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三_(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯类，特别是异硬脂酸酯为基础。使用油与乳化剂混合，形成乳剂。乳化剂优选是非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇(sorbitan)、二缩甘露糖醇(例如无水甘露糖醇油酸酯)、甘油、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸等的酯类，它们任选是乙氧基化的，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯嵌段共聚物，特别是普罗尼克(Pluixmic)产品，尤其是 L121。参见 Hunter 等人，The Theory and Practical Application of Adjuvants (编辑 Stewart-Tul 1，D.E.S.)。John Wiley and Sons, NY,第 51-94 页(1995)和 Todd 等人，Vaccinel5:564-570(1997)。
[0085]例如，有可能使用由M.Powell 及M.Newman编写的〃Vaccine Design, The Subunitand Adjuvant Approach", Plenum Press, 1995 的第 147 页中描述的 SPT 乳液，及在同一本书的第183页中描述的乳液MF59。
[0086]佐剂的另一例子是这样的化合物，其是选自丙烯酸或甲基丙烯酸之聚合物和顺丁烯二酸酐与链烯基衍生物之共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的交联的聚合物，尤其与糖类或多元醇的聚链烯基醚交联的聚合物。这些化合物被叫做卡波姆(carbomer) (Phameuropa第8册,第2期，1996年6月)。本领域技术人员还可参考美国专利第2，909，462号，其描述这类丙烯酸聚合物，与具有至少3个羟基基团的聚羟基化的化合物交联，更优选不超过8个，至少三个羟基的氢原子被具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族基团取代。优选的基团是含有从2至4个碳原子的那些，例如乙烯基、烯丙基和其它烯族不饱和基团。不饱和基团本身可含有其它的取代基，如甲基。以卡巴普(Carbopol)之名市售的产品(BF Goodrich, Ohio, USA)是特别适合的。它们与烯丙基鹿糖或烯丙基季戍四醇交联。其中，可例举卡巴普974P、934P和971P。最优选的是使用卡巴普971P。在顺丁烯二酸酐和链烯衍生物的共聚物中，共聚物EMA(Monsanto)是顺丁烯二酸酐与乙烯的共聚物。这些聚合物溶解于水中，会产生酸性溶液，其将被中和，优选中和至生理pH，以便得到一种佐剂溶液，免疫原性组合物、免疫学组合物或疫苗组合物本身将加入该佐剂溶液中。[0087]更多适当的佐剂包括，但不限于RIBI佐剂系统(Ribi Inc.)、嵌段共聚物(CytRx, Atlanta GA)、SAF-M(Chiron, Emeryville CA)、单憐酸基脂质 A、阿夫立定(Avridine)脂质-胺佐剂、得自大肠杆菌的热-不稳定之肠毒素(重组或其它的)、霍乱毒素、IMS1314或胞壁酰基二肽等等。
[0088]优选的是，以每个剂量大约100微克到大约10毫克的量加入佐剂。更优选地，以每个剂量大约100微克到大约10毫克的量加入佐剂。甚至更优选地，以每个剂量大约500微克到大约5毫克的量加入佐剂。甚至更优选地，以每个剂量大约750微克到大约2.5毫克的量加入佐剂。最优选的是，以每个剂量大约I毫克的量加入佐剂。
[0089]因此，根据更进一步的方面，制备诱发对抗PCV2之免疫反应的抗原性组合物，例如疫苗的方法，包括i)制备并回收PCV20RF2蛋白质，并ii)将其与适当之佐剂混合。优选的是，该佐剂为卡巴普971P。更优选地，以每个剂量大约500微克到大约5毫克的量，更优选以每个剂量大约750微克到大约2.5毫克的量，最优选的是每个剂量大约I毫克的量加入卡巴普971P。优选的是，过程步骤i)包括如对制备和回收PCV20RF2描述的过程步骤。例如，在该方法的优选形式中，在转移载体中获得包括PCV20RF2DNA的构建体。上文描述了适当的转移载体和制备它们的方法。任选地，该方法可包括在将0RF2克隆到转移载体内之前，通过PCR从PCV2株系扩增0RF2的步骤。优选的可读框序列、Kozak’s序列、3’ EcoRl位点序列、重组蛋白质序列、转染的构建体序列、培养基、细胞和病毒均如同在先前方法中描述的。该方法的另一任选步骤包括将经扩增的PCV20RF2DNA克隆到第一个载体内，从该第一个载体中切下0RF2DNA，并使用该切下的PCV20RF2DNA进行克隆到转移载体内。和其它方法一样，优选是在用经转染的杆状病毒感染细胞之后，等待至少5天，然后才从上清液中回收重组0RF2蛋白质。优选的是，该方法的回收步骤还包括分离培养基与细胞和细胞碎屑的步骤。这可利用各种方式进行，但为了容易及便利，优选是通过孔大小从大约0.45 μ M至大约1.0 μ M的滤器过滤细胞、细胞碎屑和生长培养基。最后，对该方法而言，优选在组合物中混合回收之重组PCV20RF2蛋白质之前，包括病毒失活化步骤。这可利用各种方式进行，但在本发明的实施中优选是使用ΒΕΙ。
[0090]因此，根据更进一步的方面，该方法包括下列步骤:i)在体外扩增PCV20RF2DNA，其中修饰该PCV20RF2DNA的侧翼序列，ii)将经扩增之PCV20RF2DNA克隆到转移载体内；并iii)将该转移载体或其含有重组PCV20RF2DNA的部分转染到病毒载体内，产生重组的病毒载体，iv)以该转染病毒感染在培养基中的细胞；v)使该转染的病毒从PCV20RF2表达重组蛋白质；vi)分离细胞与上清液；vii)从上清液中回收已表达的PCV20RF2蛋白质；viii)使该重组病毒载体失活，优选的是在大约I至大约20mM BEI的存在下，优选是在大约5mMBEI的存在下；ix)加入等量的能中和溶液中失活剂的中和剂，当失活剂为BEI时，优选的是加入硫代硫酸钠溶液至大约I到大约20mM，更优选大约5mM的终浓度；和x)加入适量的佐剂，优选的是加入卡巴普，更优选卡巴普971P，甚至更优选以上述的量(例如，每个剂量大约500微克至大约5毫克，更优选以每个剂量大约750微克到大约2.5毫克的量，最优选的是以每个剂量大约I毫克的量)。 [0091]此外，组合物还可包括一种或多种可药用载体。当在本文中使用时，“可药用载体”包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣(coatings)、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂、延迟吸收剂等。最优选的是，本文提供的组合物含有下列各项:从在体外培养之细胞的上清液中回收的PCV20RF2蛋白质，其中以含有PCV20RF2DNA并表达PCV20RF2蛋白质的重组病毒载体感染该细胞，且其中以大约2至大约8mM BEI处理该细胞培养物，优选是以大约5mM BEI使病毒载体失活；和相等浓度的中和剂，优选是硫代硫酸钠溶液，至大约2大约8mM的终浓度，优选的是大约5mM ;卡巴普，更优选卡巴普971P，优选是以每个剂量大约500微克到大约5毫克的量，甚至更优选以每个剂量大约750微克到大约2.5毫克的量，最优选的是以每个剂量大约I毫克的量；以及生理盐水，优选以大约50至大约90%(体积/体积)的量，更优选大约60至80% (体积/体积)，甚至更优选大约70% (体积/体积)。
[0092]因此，更进一步的方面涉及制备诱发对抗PCV2之免疫反应的抗原组合物，例如疫苗的方法，包括下列步骤:i)在体外扩增PCV20RF2DNA，其中修饰该PCV20RF2DNA的侧翼序列，ii)将经扩增之PCV20RF2DNA克隆到转移载体内；并iii)将该转移载体或其含有重组PCV20RF2DNA的部分转染到病毒载体内，产生重组的病毒载体，iv)以该转染病毒感染在培养基中的细胞；v)使该经转染的病毒从PCV20RF2表达重组蛋白质；vi)分离细胞与上清液；vii)从上清液中回收已表达的PCV20RF2蛋白质；viii)使该重组病毒载体失活，优选的是在大约2至大约20mM BEI的存在下，优选是在大约5mM BEI的存在下；ix)加入等量的中和剂，中和溶液中的失活剂，当失活剂为BEI时，优选的是加入硫代硫酸钠溶液至大约0.5到大约20mM之终浓度，更优选大约5mM ；x)加入适量的佐剂，优选的是加入卡巴普，更优选卡巴普971P，甚至更优选以上述的量(例如，每个剂量大约500微克至大约5毫克，更优选以每个剂量大约750微克到大约2.5毫克的量，最优选的是以每个剂量大约I毫克的量)；并11)加入生理盐水，优选的是以大约50至大约90%(体积/体积)的量，更优选大约60至80% (体积/体积)，甚至更优选大约70% (体积/体积)。该方法还可任选包括加入保护剂。当在本文中使用保护剂时，意指抗微生物的活性剂，例如庆大霉素、硫柳汞等等。特别是对于制备多-剂量组合物而言，优选加入保护剂。那些抗微生物的活性剂添加的浓度可以有效防止感兴趣的组合物被任何微生物污染，或抑制任何微生物在感兴趣的组合物中的生长。
[0093]再者，该方法还可包括加入任何稳定剂，例如糖类(saccharides)、海藻糖、甘露糖醇、蔗糖等等，以便增加和/或维持产物的保质期。然而，已经意外地发现，在不加任何其它稳定剂的条件下，所得的配制剂在至少24个月的时间内是免疫学上有效的。
[0094]本发明更进一步之方面涉及由上述方法所得的产物。具体地，本发明涉及包括重组表达之PCV20RF2蛋白质的物质组合物。此外,本发明还涉及包括从昆虫细胞培养物之上清液中回收的重组表达的PCV20RF2蛋白质的物质组合物。再者，本发明还涉及包括从昆虫细胞培养物之上清液中回收的重组表达之PCV20RF2蛋白质之物质的组合物。优选的是，该物质之组合物还包括适合使病毒载体失活的制剂。优选的是，该失活剂为BEI。此外，本发明还涉及一种物质组合物,包括从昆虫细胞培养物之上清液中回收的重组表达的PCV20RF2蛋白质，并包括适合使病毒载体失活的试剂，优选是BEI，以及中和该失活剂的中和剂。优选的是，当使用BEI作为失活剂时，该中和剂是硫代硫酸钠。
[0095]在本发明另一个方面中，提供一种免疫组合物，它诱导免疫反应，更优选的是，它赋予对抗PCV2感染的临床体征的保护性免疫力。该组合物通常包括由PCV2的可读框
2(0RF2)表达的多肽或其片段，作为该组合物的抗原性组分。
[0096]在本文中用来制备组合物，及用于本文提供的方法中的“ PCV20RF2DNA和蛋白质”，是在PCV2分离株中的一个高度保守的域，因此，任何PCV20RF2作为本文中使用的PCV0RF2DNA和/或多肽的来源都将是有效的。优选的PCV20RF2蛋白质是SEQ ID NO: 11所示的蛋白质。优选的PCV20RF2多肽是在本文中以SEQ ID NO: 5提供的，但本领域技术人员了解该序列在序列同源 性上可以有多达6-10%的改变，而仍保留抗原性特征使其能够用于免疫组合物中。免疫组合物的抗原性特征,可通过例如由实施例4提供之攻毒实验来评估。此外，若与由SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4之多核苷酸序列编码的PCV20RF2蛋白质相比较，经过修饰的抗原能赋予至少70%，优选的是80%，更优选90%保护性免疫力，则该经修饰抗原的抗原性特征是被保留的。当在本文中使用"免疫原性组合物"时，意指PCV20RF2蛋白质在宿主中诱发了 "免疫反应〃，该反应为对PCV20RF2蛋白质之细胞和/或抗体介导的免疫反应。优选的是，该免疫原性组合物能够赋予对抗PCV2感染，以及与其相关之临床体征的保护性免疫力。在某些形式中，使用PCV20RF2蛋白质的免疫原性部分作为组合物中的抗原性组分。当在本文中使用〃免疫原性部分〃 一词时，意指PCV20RF2蛋白质和/或多核苷酸各自的截短的和/或取代的形式，或者片段。优选的是，这类截短和/或取代的形式或片段，将包括来自全长0RF2多肽的至少6个邻接氨基酸。更优选，截短和/或取代的形式或片段将具有来自全长0RF2多肽的至少10个，更优选至少15个，而甚至更优选至少19个邻接氨基酸。就这一点，在本文中提供了两个优选的序列，即SEQ ID N0:9和10。进一步应当了解，这类序列可能是更大的片段或截短形式的一部分。在本文中提供之优选PCV20RF2多肽是由SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4之核苷酸序列编码的。但本领域技术人员还了解，该序列在序列同源性上多达6-20%的改变而仍保留抗原性特征，使其得以在免疫组合物中有用。在某些形式中，使用0RF2之截短或取代形式或片段作为组合物中的抗原性组分。优选的是，这类截短或取代形式或片段将包括来自全长0RF2核苷酸序列，例如SEQ ID NO: 3或SEQ ID N0:4的至少18个邻接核苷酸。更优选的，该截短或取代形式或片段将具有来自全长0RF2核苷酸序列，例如SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO:4的至少30个，更优选至少45个，甚至更优选至少57个邻接核苷酸。
[0097]在本领域中所知的"序列同一性"，意指在两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的一种关系，即参考序列和待与该参考序列进行比较的给定序列。序列同一性是这样确定的:将给定序列与参考序列进行最优比对以产生最高的序列相似度(由各条序列之间的匹配所决定)，然后将给定序列与参考序列进行比较。当进行这类排列时，序列同一性是以位置-对-位置为基础来确认的，例如，若在某个位置上的核苷酸或氨基酸残基是相同的，则序列在该特定位点是"同一"的。然后将这样的位置的总数除以参考序列中核苷酸或残基的总数，得到百分比序列同一性。可由已知的方法迅速地计算出序列同一'I"生，所述方法包括但不限于在计算机化分子生物学(ComputationalMolecular Biology), Lesk, A.N.,编辑，Oxford University Press, New York(1988),Biocomputing:1nformatics and Genome Projects, Smith, D.ff.编辑,AcademicPress, New York (1993) ； Computer Analysis of Sequence Data),第 I 部，Griffin, A.M.和 Griffin, H.G.编辑,Humana Press, New Jersey (1994) ；Sequence Analysis inMolecular Biology), von Heinge, G., Academic Press (1987) ；Sequence AnalysisPrimer, Gribskov, M.和 Devereux, J.编辑，M.Stockton Press, New York (1991)；以及Carillo1H.和 Lipman, D.，SIAM J.Applied Math., 48:1073 (1988)中描述的那些，将其教导以提述的方式并入本文中。设计确定序列同一性的优选方法使得在受试序列之间得到最大的匹配。将确定序列同一性的方法编码成在可公开获得的计算机程序，其确定所给序列之间的序列同一性。这类程序的实例包括，但不限于GCG程序包(DeVereUX，J.编辑，Nucleic Acids Research, 12(I):387(1984))、BLASTP、BLASTN 和 FASTA(Altschul, S.F.等人，J.Molec.Biol., 215:403-410 (1990)。可公开获自NCBI和其它来源的BLASTX程序 (BLAST 手册，Altschul, S.等人，NCVI NLM NIH Bethesda, MD20894, Altschul, S.F.等人，J.Molec.Biol.，215:403-410 (1990)，将其教导以提述的方式并入本文中)。这些程序使用缺省的缺口权重将序列适切地排列，以便在所给予序列和参考序列之间产生最高程度的序列同一性。举例来说，具有与参考核苷酸序列有至少例如85%，更优选90%，甚至更优选95%的"序列同一性"之核苷酸序列的多核苷酸，意在表示除了所述给定多核苷酸序列可能相对于参考核苷酸序列的每100个核苷酸含有最多15个,优选最多10个,更优选最多5个点突变之外，所述给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是相同的。换句话说，在对于参考核苷酸序列具有至少有85%,更优选90%,甚至更优选95%同一'丨生之核苷酸序列的多核苷酸中，在参考序列中有最多15%，更优选10%，甚至更优选5%的核苷酸可能被删除或被其它核苷酸取代，或可能有数目占参考序列之核苷酸总数的最多15%，更优选10%，甚至更优选5%的核苷酸被插入该参考序列中。参考序列的这些突变可发生在参考核苷酸序列的5’或3’端位点，或在这些末端位点之间的任何地方，或者在个别地散在于参考序列中的核苷酸之间，或在参考序列内形成一个或多个邻接群体。同样地，具有与参考氨基酸序列有至少例如85%，更优选90%，甚至更优选95%序列同一性之所给氨基酸序列的多肽，意在表示除了给定的多肽序列可能相对于参考氨基酸序列的每100个氨基酸包含最多15个，优选最多10个，更优选最多5个氨基酸改变之外，给定的多肽的氨基酸序列与参考序列是相同的。换言之，为获得具有与参考氨基酸序列的至少85%，优选90%，甚至更优选95%的序列同一性的给定多肽序列，可将参考序列中的至多15%，优选至多10%，甚至更优选至多5%的氨基酸残基删除或用另一氨基酸取代，或者可以向参考序列中插入数目占参考序列氨基酸残基总数的至多15%，优选至多10%，甚至更优选至多5%的氨基酸。参考序列的这些改变可发生于参考氨基酸序列的氨基末端或羧基末端位置处或这些末端位置之间的任何地方，或者个别地散布于参考序列的残基间，或者散布成参考序列内一个或多个邻接群体。优选地，不一致的残基位置是通过保守氨基酸取代而相异的。然而，当测定序列同一性时，保守取代不算作匹配。[0098]本文中使用的"序列同源性"是指一种测定两个序列的相关性的方法。为测定序列同源性，将两个或两个以上序列最优比对，必要时引入缺口。然而，与〃序列同一性〃相t匕，当测定序列同源性时，将保守氨基酸取代视为匹配。换言之，为获得与参考序列具有95%序列同源性的多肽或多核苷酸，参考序列中的85%，优选90%，甚至更优选95%的氨基酸残基或核苷酸必须与另一氨基酸或核苷酸匹配或与另一氨基酸或核苷酸构成保守取代，或可向参考序列中插入数目占参考序列氨基酸残基或核苷酸总数(不包括保守取代)的至多15%，优选至多10%，甚至更优选至多5%的氨基酸或核苷酸。优选地，同源序列包含至少一段50个，甚至更优选至少100个，甚至更优选至少250个，甚至更优选至少500个核苷酸。
[0099]"保守取代"是指氨基酸残基或核苷酸被具有类似特征或性质(包括大小、疏水性等)的另一氨基酸残基或核苷酸取代，使得总体功能性不发生显著变化。
[0100]〃经分离的〃意指〃通过人手〃而与其天然状态有所改变，即若其出现在自然界，则其已经改变和/或从其原始环境中移出。例如，当术语用于本文中时，天然存在于活有机体中的多核苷酸或多肽不是经"分离"的，但相同的多核苷酸或多肽与其天然状态的共存物质分开后，则是经“分离”的。
[0101]由此，本发明更进一步的方面涉及可有效降低与PCV2感染相关之临床症状的严重性的免疫原性组合物，其包含PCV20RF2蛋白质。优选的是，该PCV20RF2蛋白质是上述那些中的任一个。优选的是，该PCV20RF2蛋白质为
[0102]i)包括 SEQ ID NO: 5,SEQ ID N0:6、SEQ ID N0:9、SEQ ID N0:10 或 SEQ ID NO: 11之序列的多肽；
[0103]ii)与i)的多肽至少80%同源的任何多肽；
[0104]iii) i)和 /或ii)的多肽的任何免疫原性部分；
[0105]iv)iii)的免疫原性部分，包括 SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 9、SEQ IDNO: 10或SEQ ID NO: 11之序列中所含有的至少10个邻接氨基酸，
[0106]V)由包括SEQ ID N0:3或SEQ ID N0:4之序列的DNA编码的多肽，
[0107]vi)由与V)之多核苷酸至少80%同源的多核苷酸编码的任何多肽，
[0108]vii)由V)和/或vi)之多核苷酸编码之多肽的任何免疫原性部分，
[0109]viii)vii)之免疫原性部分，其中编码该免疫原性部分的多核苷酸包括SEQ IDN0:3或SEQ ID N0:4之序列中所含有的至少30个邻接核苷酸。
[0110]优选的是，那些免疫原性部分中任一个都将具有由SEQ ID N0:3或SEQ ID NO:4之序列编码之PCV20RF2蛋白质的免疫原性特征。
[0111]根据另一方面，在免疫学组合物中提供PCV20RF2蛋白，其中PCV20RF2蛋白的抗原包含水平(antigen inclusion level)可有效用于诱发所需的免疫反应,即降低由PCV2感染的发生率，减轻PCV2感染的严重性，或预防由PCV2感染所致的一或多种临床体征。优选地，PCV20RF2蛋白包含水平为每毫升最终免疫原性组合物至少0.2μ g抗原(μ g/ml),更优选为约0.2 μ g/ml至约400 μ g/ml,更优选为约0.3 μ g/ml至约200 μ g/ml,甚至更优选为约0.35 μ g/ml至约100 μ g/ml,更优选为约0.4 μ g/ml至约50 μ g/ml,更优选为约0.45 μ g/ml至约30 μ g/ml,更优选为约0.6 μ g/ml至约15 μ g/ml,甚至更优选为约0.75 μ g/ml至约8 μ g/ml,甚至更优选为约1.0 μ g/ml至约6 μ g/ml,更优选为约1.3 μ g/ml至约3.0 μ g/ml,甚至更优选为约1.4 μ g/ml至约2.5 μ g/ml,甚至更优选为约1.5 μ g/ml至约2.0 μ g/ml,且最优选为约1.6 μ g/ml。
[0112]根据另一方面，0RF2抗原包含水平为每个剂量最终抗原组合物至少0.2/μ g如上所描述的PCV20RF2蛋白(μ g/剂)，更优选为约0.2 μ g/剂至约400 μ g/剂，更优选为约0.3 μ g/剂至约200 μ g/剂，甚至更优选为约0.35 μ g/剂至约100 μ g/剂，更优选为约
0.4 μ g/剂至约50 μ g/剂，更优选为约0.45 μ g/剂至约30 μ g/剂，更优选为约0.6 μ g/剂至约15 μ g/剂，甚至更优选为约0.75 μ g/剂至约8 μ g/剂，甚至更优选为约1.0 μ g/剂至约6 μ g/剂，更优选为约1.3 μ g/剂至约3.0 μ g/剂，甚至更优选为约1.4 μ g/剂至约
2.5 μ g/剂,甚至更优选为约1.5 μ g/剂至约2.0 μ g/剂,且最优选为约1.6 μ g/剂。
[0113]用于根据本发明的免疫原性组合物中的PCV20RF2多肽可以用任何方式获得，包括PCV20RF2的分离及纯化、标准蛋白质合成及重组方法。用于获得PCV20RF2多肽的优选方法在美国专利申请第11/034，797号中提供，其教导及内容以提述的方式并入本文中。简言之，用含有PCV20RF2DNA编码序列的重组病毒载体感染易感细胞，由重组病毒表达PCV20RF2多肽，通过过滤从上清液回收所表达的PCV20RF2多肽，并用任何已知的方法，优选使用二元乙撑亚胺，使其失活化，随后将其中和以终止失活化过程。
[0114]因此，根据更进一步的方面，该免疫原性组合物包括i)任何上述的PCV20RF2蛋白质，优选具有上文所述的浓度，以及ii)表达该PCV20RF2蛋白质的病毒载体(优选是重组杆状病毒)的至少一部分。此外，根据更进一步的方面，该免疫原性组合物包括i)任何上述的PCV20RF2蛋白质，优选具有上文所述的浓度，ii)表达该PCV20RF2蛋白质的病毒载体(优选是重组杆状病毒)的至少一部分，以及iii) 一部分的细胞培养物上清液。
[0115]根据PCV20RF2蛋白质之产生和回收过程的一个具体实施方案，通过孔尺寸优选在大约0.45到I微米之间的膜来过滤细胞培养物上清液。因此，更进一步的方面涉及这样的免疫原性组合物，其包括i)任何上述的PCV20RF2蛋白质，优选是以上述的浓度，ii)表达该PCV20RF2蛋白质的病毒载体(优选是重组杆状病毒)的至少一部分，以及iii) 一部分细胞培养物；其中大约90%的组分具有小于I微米的尺寸。
[0116]根据更进一步的方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包括i)任何上述的PCV20RF2蛋白质，优选是以上述的浓度，ii)至少一部分表达该PCV20RF2蛋白质的病毒载体，iii) 一部分细胞培养物，以及iv)使重组病毒载体失活的失活剂，优选是BEI，其中大约90%的组分i)至iii)具有小于I微米的尺寸。优选的是，BEI以有效使杆状病毒失活的浓度存在。有效浓度在上文已有描述。
[0117]根据更进一步的方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包括i)任何上述的PCV20RF2蛋白质，优选是以上述的浓度，ii)至少一部分表达该PCV20RF2蛋白质的病毒载体，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活的失活剂，优选是BEI，以及V)用于中止由该失活剂介导的失活化作用的中和剂，其中大约90%的组分i)至iii)具有小于I微米的尺寸。优选的是，若失活剂是BEI，则该组合物包括与BEI等量的硫代硫酸钠。
[0118]将多肽掺入可施用于对PCV2感染敏感的动物的组合物中。组合物的优选形式亦可包括本领域技术人员已知的额外组分(亦参见Remington’s PharmaceuticalSciences (1990)。第18版,Mack Publ., Easton)。另外,该组合物可包括一或多种兽医学上可接受的载体。本文中使用的〃兽医学上可接受的载体"包括以下载体中的任一项及全部:溶剂、分散介质、包衣(coatings)、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌剂及抗真菌剂、等张剂、吸附延迟剂等。在一个优选实施方式中，免疫原性组合物包含本文提供的PCV20RF2蛋白，优选具有上文所述的浓度，其与佐剂[优选卡巴普]及生理盐水混合。
[0119]在优选的具体实施方案中，免疫原性组合物包括本文提供的PCV20RF2蛋白质，优选具有上文所述的浓度，作为抗原性组分，将其与佐剂，优选是卡巴普，以及生理盐水混合。
[0120]本领域技术人员应了解用于本文中的组合物可包括已知的可注射生理学可接受无菌溶液。为了制备非经肠注射或灌注的即用溶液，可以容易地获得含水等张溶液诸如盐水或相应的血浆蛋白质溶液。另外，本发明的免疫原性组合物及疫苗组合物可包括稀释剂、等张剂、稳定剂或佐剂。稀释剂可包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等。等张剂典型地可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇及乳糖。稳定剂典型地包括白蛋白及乙二胺四乙酸的碱金属盐。适当的佐剂则是上述的那些。最优选是使用卡巴普，特别是卡巴普971P，优选是以上述的量(例如每个剂量大约500微克到大约5毫克，更优选以每个剂量大约750微克到大约2.5毫克，最优选的是以每个剂量大约I毫克的量)使用。 [0121]因此，本发明还涉及免疫原性组合物，其包括i)任何上述的PCV20RF2蛋白质，优选具有上述的浓度，?)至少一部分表达该PCV20RF2蛋白质的病毒载体，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活的失活剂，优选是BEI，以及V)用于中止由该失活剂介导之失活作用的中和剂，优选是与BEI等量的硫代硫酸钠；以及vi)适当的佐剂，优选是具有上述量的卡巴普；其中大约90%的组分i)至iii)具有小于I微米的尺寸。根据更进一步的方面，该免疫原性组合物还包括可药用的盐类，优选是生理学可接受的浓度的磷酸盐。优选的是，将该免疫原性组合物的PH值调整到生理pH值，也就是在大约6.5到7.5之间。
[0122]因此，本发明还涉及免疫原性组合物，其每ImL包括i)至少1.6微克上述的PCV20RF2蛋白质，ii)至少一部分表达该PCV20RF2蛋白质的杆状病毒，iii) 一部分细胞培养物，iv)大约2到大约8mM的BEI，v)与BEI等量的硫代硫酸钠；以及vi)大约I毫克的卡巴普971，以及vii)生理学可接受浓度的磷酸盐；其中大约90%的组分i)至iii)具有小于I微米的尺寸，且该免疫原性组合物的PH值被调整到大约6.5至7.5。
[0123]免疫原性组合物可进一步包括一或多种其它免疫调节剂，诸如白介素、干扰素或其它细胞因子。免疫原性组合物亦可包括庆大霉素(Gentamicin)及硫柳汞(Merthiolate) 0尽管适用于本发明的语境下的佐剂及添加剂的量及浓度可容易地由本领域技术人员决定，但本发明涵盖这样的组合物，其包含约50 μ g至约2000 μ g，优选约250 μ g/ml剂量疫苗组合物的佐剂。在一个实施方案中，本文中使用的免疫原性组合物意图涵盖还指包含约I μ g/ml至约60 μ g/ml的抗生素,更优选少于约30 μ g/ml抗生素的疫苗组合物。
[0124]因此，本发明还涉及免疫原性组合物，其包括i)任何上述的PCV20RF2蛋白质，优选具有上述的浓度，?)至少一部分表达该PCV20RF2蛋白质的病毒载体，iii) 一部分细胞培养物，iv)使重组病毒载体失活的失活剂，优选是BEI，以及V)用于中止由该失活剂介导的失活化作用的中和剂，优选是与BEI等量的硫代硫酸钠；vi)适当的佐剂，优选是上文所述的量的卡巴普971, vii)可药用浓度的生理盐水缓冲液,优选是磷酸盐，以及viii)抗微生物活性剂；其中大约90%的组分i)至iii)具有小于I微米的尺寸。
[0125]意外地发现，本文提供的免疫原性组合物在24个月的期间内是高度稳定的。还发现本文提供的免疫原性组合物，包括本文提供的表达PCV20RF2蛋白质的重组杆状病毒，在降低与PCV2感染相关之临床体征上是极为有效的。意外地发现，包括本文提供的表达PCV20RF2蛋白质之重组杆状病毒的免疫原性组合物，比包含失活形式的完整PCV2病毒或经分离的病毒PCV20RF2抗原的免疫原性组合物更有效。具体而言，意外地发现了表达PCV20RF2蛋白质之重组杆状病毒在极低浓度下(指最多0.25微克/剂量的浓度)是有效的。PCV20RF2蛋白质的这种令人意外的高免疫原性潜能,可通过加入卡巴普而进一步增加。
[0126]更进一步之方面涉及包括至少一个剂量的本文提供的PCV20RF2蛋白质免疫原性组合物的容器，其中一个剂量包括至少2微克PCV20RF2蛋白质，优选的是2至16微克PCV20RF2蛋白质。该容器可包括从I至250个剂量的免疫原性组合物，优选的是其含有1、10、25、50、100、150、200或250个剂量的？(^201^2蛋白质免疫原性组合物。优选的是，每个容器包括一个以上剂量的PCV20RF2蛋白质免疫原性组合物，还包括抗微生物活性剂。那些试剂为例如抗生素，包括庆大霉素和硫柳汞，等等。因此，本发明一方面涉及包括从I到250个剂量的PCV20RF2蛋白质免疫原性组合物的容器，其中一个剂量包括至少2微克PCV20RF2蛋白质和庆大霉素和/或硫柳萊，优选是从大约I μ g/ml到大约60 μ g/ml的抗生素,优选的是低于大约30 μ g/ml。
[0127]更进一步的方面涉及一种试剂盒，其包括上述的任何容器，以及说明手册，包括有关肌肉内施用至少一个剂量的PCV20RF2蛋白质免疫原性组合物至小猪内以减少与PCV2感染相关之临床症状的严重性的信息。此外，根据更进一步的方面，该说明手册包括有关第二次或更多次施用至少一个剂量的PCV20RF2蛋白质免疫原性组合物的信息，其中第二次施用或任何更多次施用与最初或任何前次施用相隔至少14天。优选的是，该说明手册还包括施用免疫刺激物的信息。优选的是，该免疫刺激物应施用至少两次。在免疫刺激物的第一和第二次施用，或任何更多次施用之间，优选有至少3天，更优选至少5天，甚至更优选至少7天。优选的是，在超过最初施用PCV20RF2蛋白质之免疫原性组合物至少10天，更优选15天，甚至更优选20天，甚至更优选至少22天，给予免疫刺激物。优选的免疫刺激物是例如钥孔血蓝蛋白(KLH)， 优选是以不完全弗氏(Freund’s)佐剂乳化的钥孔血蓝蛋白(KLH/ICFA) ο然而，当然可使用本领域技术人员已知的任何其它的免疫刺激物。当在本文中使用"免疫刺激物"时，意指任何可诱发普通免疫反应，而优选不引发或增加特异的免疫反应，例如对抗特定病原体的免疫反应的试剂或组合物。说明书还进一步教导以适当的剂量施用免疫刺激物。再者，套组还可包括一容器，其包括至少一个剂量的免疫刺激物，优选是一个剂量的KLH或KLH/ICFA。
[0128]此外，还已经意外地发现，通过施用IngelVac PRRS MLV疫苗，进一步提高包含表达PCV20RF2蛋白质之重组杆状病毒的免疫原性组合物(优选与卡巴普联用)的免疫原性潜能(参见实施例5)。当存在PRRS感染时，PCV2临床体征和疾病征候大大增加。然而，本文提供的免疫原性组合物和疫苗接种策略，大大地减少了该影响，并且超出了预期。换句话说，当以任何本文提供的PCV20RF2免疫原性组合物和Ingelvac PRRS MLV疫苗(Boehringer Ingelheim)处理动物,优选是猪时,观察到了意想不到的协同效果。
[0129]因此，本发明更进一步的方面涉及上文所述的试剂盒，包括本文提供的PCV20RF2的免疫原性组合物和说明手册，其中该说明手册还包括与PCV20RF2免疫原性组合物一起或者大约同时施用包括PRRS抗原，优选佐剂化(adjuvanted)之PRRS抗原的免疫原性组合物的信息。该 PRRS 抗原优选是 Illge丨Vac+* PRRS MLV(Boehringer Ingelheim)。
[0130]本发明更进一步的方面还涉及试剂盒，其包括i)含有至少一个剂量的本文提供的PCV20RF2的免疫原性组合物的容器，以及ii)含有包括PRRS抗原，优选佐剂化
(adjuvanted)的PRRS抗原之免疫原性组合物的容器。该PRRS抗原优选是IngelVac? PRRS
MLV(Boehringer Ingelheim)。更优选的是,该试剂盒还包括说明手册,其包括施用这两种药物组合物的信息。优选的是，它包含在含有PRRS的组合物之前施用含有PCV20RF2之组合物的信息。
[0131]更进一步的方面，涉及任何本文提供的组合物在作为药物，优选的是作为兽医药物，更优选作为疫苗的用途。再者，本发明还涉及任何在本文中描述之组合物在制备药物中的用途，所述药物用于减轻与PCV2感染相关之临床症状的严重性。优选的是，该药物用于预防PCV2感染，更优选在小猪中预防PCV2感染。
[0132]更进一步的方面涉及(i)预防PCV2感染或再感染，或(ii)在个体中减少或消除由PCV2引起之临床症状的方法，包括对需要的受试者施用任何本文提供的免疫原性组合物。优选的是，该受试者是猪。优选的是，肌肉内施用该免疫原性组合物。优选的是，施用一或两个剂量的免疫原性组合物，其中一个剂量包括至少大约2微克PCV20RF2蛋白质，更优选大约2到大约16微克，以及至少大约0.1到大约5毫克卡巴普，优选的是大约I毫克卡巴普。更进一步的方面涉及如上文所述之治疗方法，其中第二次施用免疫原性组合物。优选的是，第二次施用是利用相同的免疫原性组合物来进行，优选具有相同量的PCV20RF2蛋白质。第二次施用优选也通过肌肉内施用。优选的是，第二次施用与最初施用相隔至少14天，更优选相隔最初施用至少4周。
[0133]根据更进一步的方面，治疗方法还包括施用免疫刺激物。优选的是，施用该免疫刺激物至少两次。在免疫刺激物的第一和第二次投药之间优选有至少3天，更优选至少5天，甚至更优选至少7天。优选的是，在最初施用PCV20RF2蛋白质免疫原性组合物至少10天，更优选15天，甚至更优选20天，甚至更优选至少22天之后施用免疫刺激物。优选的免疫刺激物是例如钥孔血蓝蛋白(KLH)，优选是以不完全弗氏佐剂乳化的钥孔血蓝蛋白(KLH/ICFA) 0然而，可使用本领域技术人员已知的任何其它的免疫刺激物。以适当的剂量施用免疫刺激物是在本领域技术人员的普通知识范围内。
[0134]根据更进一步的方面，上文所述的治疗方法还包括施用PRRS抗原。优选的PRRS抗原为IngcIVnc ' PRRS MLV (Boehringer Ingelheim)。优选的是,该PRRS抗原的施用在时间上晚于(temporally beyond)PCV20RF2蛋白质免疫原性组合物的施用。
[0135]根据更进一步的方面，本发明提供多价组合疫苗，其包括有效降低PCV2感染之发生率或减轻其严重性的免疫学作用剂，以及至少一种具有对抗其它在猪中引起疾病的生物的免疫原活性之组分。
[0136]具体地，有效降低PCV2感染之发生率或减轻其严重性的免疫学作用剂为PCV2抗原。优选的是，该PCV2抗原是本文提供的PCV20RF2蛋白质，或任何上述的包括PCV20RF2蛋白质的免疫原性组合物。
[0137]然而，应当理解，PCV2抗原还意指包含至少一种这样的抗原的物质组合物:所述抗原当施用猪时，可诱导、刺激或提高对抗PCV2感染的免疫反应。优选地，所述PCV2抗原是完整的PCV2病毒，优选为失活形式、活的但经修饰的PCV2病毒或减毒的PCV2病毒、包含至少一个PCV2的免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒，包含至少一个PCV2的免疫原性氨基酸序列的任何其它的多肽或组分。当在本文中使用"免疫原性蛋白质"、"免疫原性多肽"或"免疫原性氨基酸序列"等术语时，意指任何这样的氨基酸序列，其在宿主中诱发对抗包含该免疫原性蛋白质、免疫原性多肽或免疫原性氨基酸序列之病原体的免疫反应。当在本文中使用"免疫原性蛋白质"、"免疫性原多肽"或"免疫原性氨基酸序列"等术语时，包括任何蛋白质的全长序列、其类似物或其免疫原性片段。〃免疫原性片段〃意指这样蛋白质的片段，它含有一个或多个表位，因此能诱发对抗相关病原体的免疫反应。可使用本领域中已熟知的许多表位定位技术中的任一种来确认这类片段。参见，例如EpitopeMapping Protocols in Methods in Molecular Biology,第 66 册(Glenn E.Morris,编辑，1996) Humana Press, Totowa, New Jersey。例如,可通过例如下面的方法来确定线性表位:在固体支撑物上同时合成大量的肽，这些肽相当于蛋白质分子的部分，并使这些肽与抗体反应，同时这些肽仍附接在支撑物上。这类技术为本领域中已知的，并在例如美国专利第 4，708，871 号；Geysen 等人(1984) Proc.Natl.Acad.Sc1.USA81:3998-4002 ；Geysen 等人(1986)Molec.1mmunol.23:709-715中描述。同样的，通过确定氨基酸的空间构象，例如通过X-射线结晶术和2-维核磁共振,迅速地鉴定构象表位。例如参见上文Epitope MappingProtocols。该定义中还包括合成抗原,例如多表位(polyepitopes)、侧翼表位(flankingepitopes),及其它重组抗原或合成得来的抗原。例如参见Bergmann等人，(1993)Eur.J.1mmunol.23:2777-2781; Bergmann 等人，(1996)，J.1mmunol.157:3242-3249; Suhrbier, A.(1997), Immunol, and Cell Biol.75:402-408;Gardner 等人，(1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June28-July3, 1998。。
[0138]根据更进一步的具体实施方案，该PCV-2抗原是CireoFLEX? (BoehringerIngelheim Vetmedica inc, St Joseph, MO, USA)、CircoVac' (Merial SAS, Lyon, France)、
CircoVent(Intervet Inc., Millsboro, DE, USA)或 Suvaxyn PCV-2单剂? (Fort DodgeAnimal Health, Kansas City, KA, USA)。 [0139]对组合物或疫苗的〃免疫学或免疫反应〃是在宿主中产生出对抗感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导之免疫反应。通常，"免疫反应"包括但不限于一种或多种下列效应:特异地针对感兴趣之组合物或疫苗中所含的抗原的抗体、B细胞、T辅助细胞、抑制性T细胞，和/或细胞毒性T细胞和/或yd T细胞的产生或激活。优选的是，宿主将展现出治疗性或预防性的免疫反应，而得以提高对新感染的抵抗力，和/或降低疾病的临床严重性。这样的保护作用将表现为与宿主感染相关的上述症状的减少或缺如。
[0140]优选的是，引起猪其它疾病之生物系选自下列所组成之群:大叶性肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuopneumonia) (I);腺病毒(2) ;α病毒，如东方马脑脊髓炎病毒(Eastern equine encephalomyelitis viruses) (3);支气管炎博德特氏菌(Bordetellabronchiseptica) (4);短螺旋体属菌种(Brachyspira spp.) (5),优选的是猪痢疾短螺旋体(B.hyodyentheriae) (6);结肠菌毛样短螺旋体(B.piosicoli) (7),猪布鲁氏菌(Brucellasuis),优选生物变型 1、2 和 3 (8);经典猪痕病毒(classical swine fever virus) (9);梭菌属菌种(Clostridium spp.) (10),优选的是艰难梭菌(Cl.difficile) (11)、产气荚膜梭菌(Cl.perffingens) A、B 和 C 型(12)、诺氏梭菌(Cl.novyi) (13)、败毒梭菌(Cl.septicum)(14)、破伤风梭菌(Cl.tetani) (15);冠状病毒(Coronavirus) (16),优选的是猪呼吸道冠状病毒(Procine Respiratory Corona virus) (17);猪血虫体(Eperyhrozoonosis suis)(18);猪红斑丹毒丝菌(19);大肠杆菌(20);副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis),优选亚型 1、7 和 14(21);凝血性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitisvirus) (22);日本脑炎病毒(23);细胞内劳索尼亚氏菌(Lawsonia intracellularis)(24)；钩端螺旋体属菌种(Leptospira spp.) (25),优选澳大利亚钩端螺旋体(Leptospira australis) (26);犬钩端螺旋体(Leptospira canicola) (27)；流感伤寒钩端螺旋体(Leptospira grippotyphosa) (28);出血黄疸钩端螺旋体(Leptospiraicterohaemorrhagicae) (29);问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans) (30);波摩那钩端螺旋体(Leptospira pomona) (31);塔拉索夫钩端螺旋体(Leptospira tarassovi)(32);分枝杆菌属菌种(Mycobacterium spp.) (33),优选的是鸟分枝杆菌(M.avium) (34)、胞内分枝杆菌(M.1ntracellulare) (35)和牛分枝杆菌(M.bovis) (36);猪肺炎枝原体(Mycoplasma hyopneumoniae) (37);多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida) (38);猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus) (39);猪细小病毒(Porcine Parvovirus) (40)；猪生殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)病毒(41);假狂犬病病毒(Pseudorabies virus) (42);轮状病毒(Rotavirus) (43);沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.) (44),优选的是鼠伤寒沙门氏菌(S.thyhimurium) (45)和猪霍乱沙门氏菌(S.choleraesuis) (46);猪葡萄球菌(Staph, hyicus) (47);葡萄球菌属菌种(Staphylococcus spp.) (48),优选的是链球菌属菌种(Streptococcus spp.) (49),优选的是猪链球菌(Strep, suis) (50);猪疱疫病毒(Swine herpes virus) (51);猪流感病毒(Swine Influenza Virus) (52);猪痘病毒(Swine pox virus) (53);猪痘病毒(54);水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus) (55);猪水疱疫病毒(Virus of vesicularexanthema of swine) (56);哈德焦钩端螺旋体(Leptospira Hardjο) (57)和/或猪关节液枝原体(Mycoplasma hyosynoviae) (58)。
[0141]下文中任何关于 猪病原体的提述，可以指称该病原体，例如猪肺炎枝原体(M.Hyo)，或者可以指称该病原体后面O内的编号(可见上文)。例如，在提述猪肺炎枝原体时，可指称“肺炎枝原体”或“(37) ”。
[0142]因此，本发明涉及用来治疗和/或预防猪的组合疫苗，其包括降低PCV2感染之发生率或减轻其严重性的免疫学作用剂，优选PCV2抗原，以及额外的免疫学活性组分，所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由任何猪病原体(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)、(8)、(9)、(10)、(11)、(12)、(13)、(14)、(15)、(16)、(17)、(18)、(19)、(20)、(21)、(22)、(23)、(24)、(25)、(26)、(27)、(28)、(29)、(30)、(31)、(32)、(33)、(34)、(35)、(36)、(37)、(38)、(39)、(40)、(41)、(42)、(43)、(44)、(45)、(46)、(47)、(48)、(49)、(50)、(51)、(52)、(53)、(54)、(55)、(56)、(57)和/或(58)引起的感染，或者是所述猪病原体的免疫学活性组分。[组合I]。
[0143]当在本文中使用〃免疫学活性组分〃时，意指在施用该组分之动物中诱导或刺激免疫反应的组分。根据优选的具体实施方案，该免疫反应系针对该组分或包括该组分之微生物。根据更优选的具体实施方案，免疫学活性组分是经减毒的微生物，包括经修饰的活病毒(MLV)、灭活的微生物，或至少是微生物的免疫活性部分。
[0144]当在本文中使用"微生物的免疫学活性部分"时，意指微生物之含有蛋白质、糖和/或糖蛋白的部分，其包括至少一种在施用该组分之动物中诱导或刺激免疫反应的抗原。根据更优选的具体实施方案，该免疫反应系针对该微生物的免疫学活性部分，或包括该免疫学活性部分的微生物。
[0145]优选的是，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(41)引起的感染，或者是猪病原体(41)的免疫学活性组分。
[0146]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(37)引起的感染，或者是猪病原体(37)的免疫学活性组分。
[0147]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(1)引起的感染，或者是猪病原体(1)的免疫学活性组分。
[0148]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(7)引起的感染，或者是猪病原体(7)的免疫学活性组分。
[0149]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(24)引起的感染，或者是猪病原体(24)的免疫学活性组分。
[0150]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(38)引起的感染，或者是猪病原体(38)的免疫学活性组分。
[0151]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(21)引起的感染，或者是猪病原体(21)的免疫学活性组分。
[0152]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(40)引起的感染，或者是猪病原体(40)的免疫学活性组分。
[0153]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(2)引起的感染，或者是猪病原体(2)的免疫学活性组分。
[0154]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(44)引起的感染，或者是猪病原体(44)的免疫学活性组分。
[0155]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(50)引起的感染，或者是猪病原体(50)的免疫学活性组分。
[0156]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(19)，优选(20)和/或(21)引起的感染，或者是猪病原体(19)，优选(20)和/或(21)的免疫学活性组分。
[0157]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(22)引起的感染，或者是猪病原体(22)的免疫学活性组分。
[0158]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(41)和(37)引起的感染，或者是猪病原体(41)和(37)的免疫学活性组分。
[0159]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体⑴和(41)引起的感染，或者是猪病原体⑴和(41)的免疫学活性组分。
[0160]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(1)和(37)引起的感染，或者是猪病原体(1)和(37)的免疫学活性组分。
[0161]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(1)、(41)和(37)引起的感染，或者是猪病原体(1)、(41)和(37)的免疫学活性组分。在优选的形式中，该组合以卡巴普佐剂化(adjuvanted with Carbopol)。
[0162]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体⑴和(21)引起的感染，或者是猪病原体⑴和(21)的免疫学活性组分。
[0163]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(21)和(41)引起的感染，或者是猪病原体(21)和(41)的免疫学活性组分。
[0164]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(21)和(37)引起的感染，或者是猪病原体(21)和(37)的免疫学活性组分。
[0165]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(21)和(38)引起的感染，或者是猪病原体(21)和(38)的免疫学活性组分。
[0166]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(7)和(19)引起的感染，或者是猪病原体(7)和(19)的免疫学活性组分。
[0167] 根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(38)和(33)，更优选(34)、(35)和/或(36)引起的感染，或者是猪病原体(38)和(33)，更优选(34)、(35)和/或(36)的免疫学活性组分。
[0168]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(49)，优选(50)和(21)引起的感染，或者是猪病原体(49)，更优选(50)和(21)的免疫学活性组分。
[0169]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(49)，更优选(50)、(20)和(21)引起的感染，或者是猪病原体(49)，更优选(50)、(20)和(21)的免疫学活性组分。
[0170]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(49)，优选(50)、(20)和(21)引起的感染，或者是猪病原体(49)，优选(50)、(20)和(21)的免疫学活性组分。
[0171]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(49)，更优选(50)、(20)、(38)和(21)引起的感染，或者是猪病原体(49)，更优选(50)、(20)、(38)和(21)的免疫学活性组分。
[0172]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(49)，优选(50)、(20)、(33)和(21)引起的感染，或者是猪病原体(49)，优选(50)、(20)、(33)和(21)的免疫学活性组分。
[0173]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(49)，优选(50)、(20)、(38)、(33)和(21)引起的感染，或者是猪病原体(49)，优选(50)、(20)、(38)、(33)和(21)的免疫学活性组分。
[0174]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(41)、(40)和(19)引起的感染，或者是猪病原体(41)、(40)和(19)的免疫学活性组分。
[0175]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(38)、(4)和(19)引起的感染，或者是猪病原体(38)、(4)和(19)的免疫学活性组分。[0176]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(38)、(4)、(21)和(19)引起的感染，或者是猪病原体(38)、(4)、(21)和(19)的免疫学活性组分。
[0177]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(20)，更优选(20)、(31)和(38)引起的感染，或者是猪病原体(20)、(31)和(38)的免疫学活性组分。[0178]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(5)，优选(5)和(24)引起的感染，或者是猪病原体(5)和(24)的免疫学活性组分。
[0179]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(1)，更优选(I)和(5)引起的感染，或者是猪病原体(1)和(5)的免疫学活性组分。
[0180]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(41)，优选(40)、(27)、(28)、(29)、(31)、(19)和(59)引起的感染，或者是猪病原体(41)、(40)、(27)、(28)、(29)、(31)、(19)和(57)的免疫学活性组分。
[0181]根据另一个方面，[组合I]的所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由猪病原体(6)，优选(6)、(19)、(38)和(58)引起的感染，或者是猪病原体(1)和(5)的免疫学活性组分。
[0182]根据进一步的方面，组合疫苗的所述额外的免疫学活性组分选自:Enterisol? ileitis, Enterisol? ileitis ff, Enterisol? sc-54, Enterisol?
SC-54FF, Enterisol? ery-ALC, Ingdvac? APP ALC, Ingdvac? AR4, Ingelvac⑩
HP-1, Ingelvac? hpe-1, Ingelvac? m.hyo, Ingdvac? prrs mlv, Ingelvac?
PRRS ATP, Ingelvac? prv-gi, Reproeye? PRRS ple, r印rocyc?
PLEj Tetguard?, Toxivac? AD + E，Toxivac? Plus Parsius,(都来自Boehringer Ingelheimj St.Joseph, MO，USA) ;Circovent，Porcilis Coli，PorcilisERY+PARV0，Porcilis EryjPorcilis GlasserjPorcilis ParvojPorcilis PorcoliDF，Porcilis APP，Porcilis AR-T，Porcilis AR-T DF，Porcilis Porcoli，PorcilisPorcoli Diluvac forte, Porcilis PRRS,Porcilis PorcoI 5，Porci I isAujeszkyj Porcilis Begonia Diluvac，Porcilis Begonia 1.D.A.L., Porcilis BegoniaUnisole, Porcilis M_ hyo, Porcilis Atrinord, Myco Silcncer? BPMj Myco Silencer?BPMEj Myco SilenceiH) me, Myco Silencer? M, Myco Silencer? Once，Myco Silencer?MEHj Rhinogen⑩ bpe，Rhinogen? CTE5000，Rhinogen? ctse，Score，Sow Bae?E II，Sow Bac.^ CE IL Sow Bm? TRECj ProSystem? CE，ProSystem?RCEj ProSystem? trec, ProSystem? Pillmunej ProSystem? Rotamune?与 ImugiinR II，ProSystem^
Rota, ProSystem? Rotamune KVj ProSystem?TG-Emime? Rota 与 Imugan? 11, ProSystem? TGE/Rota, ProSystem?TG-Emuae? 与 Imugen-- ProSystem? tge, MaGESTlC7, MaGESTlCS, MaGESTicTM 与 Spur?, MaGESTIc? 7 与 Spur?, MaGESTic? 8 与 Spur?,End-FLUence? 与 Imugen? II，End-FLUenc.e? 2，PRRomiSE?, PRV-Begonia与 Dlluvac Forte?, Argus? sc/st, strep Bac, strep Bac⑩与 Imugen? II，C
olisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo (都来自 Intervet Inc.,Mi Ilsboro，DE,USA) ;Hyoresp,Circovac，Neocolipor, Parvoruvac，Parvosuin,Progressis,Viraflu,Akipor6.3,Jespur gl-，Jesflu gl-(都来自 Merial
LTD, Duluth, GA) ；ER BAC" PLUS, ER BAC?, ER BAC? PLUS/LEPTOFERM-5" E R BAC? Leptoferm-5?, Farrowsure?, Farrowsure? B，FARROWSURE*plus B, FARROWSURE* plus, FARM)胃SURE? prv，farrowsure b-prv，FLUSURE?, FLUSURE?RTU, FLUSURE?/ER BAC? PLUS, FLUSURE?/ER BAC PLUS?,FLUSURE?/RESPISURE?, FLUSURE?/RESPISURE? RTU
[0183]FLIISUR ΙΛνRΠSI11S1.1R R-ONEeZERPLUS, FLUSURE?/
RespiSurel ONEC?/ER BAC Plus?, FLUSURE?/RESPISURE ONE?5, FLUSURE?/RESPISURE1 ONE(B)5 FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/Farrowsure PlusB，LITTERGUARDe L T - c，LITTERGUARD:1 L T，pleuroGuard?
4，Pneumosuis III，Stellamune One, Stellamune Uno，StellamuneOnce,Stellamune Mono, Stellamune Mycoplasma,Respisure One, Respisur鐵
Respisurel ONE?，Respisurel One?/ER Bac PlllS?, Enduracell
Tj Zylexis (原名 Baypamune)，Atrobac? 3，BlUtfVaC?， BrMiVae⑩-B，
Leptoferm-5?Parvo-Vac?/Leptoferm-5?, PR-Vae?4Ciile4 PR-￥ac-- PR-Vac
Plus?.(都来自 Pfizer Inc.，New York, NY, USA) ; Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFend?
MHjSuvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn Aujeszky Bartha+Diluent，Suvaxyn AujeszkyBartha+o/w, Suvaxyn Aujeszky-FlujSuvaxyn Aujeszky783+o/w, Suvaxyn EryjSuvaxynFlu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-Onej Suvaxyn Parvo STj Suvaxyn Parvo/
E, Suvaxyn RespiFend?) APP，Suvaxyn RespiFendCg) HPSj Suvaxyn RespiFend? MH/HPSj Suvaxyn RespiFend? MHj SuvaxynD ar/t/e，Swmyn? ec-4，Suvaxyn?E，Suvaxyn(I)-Ef Suvaxyn? E-oral, SuvaxynfB) PLEj Suvaxyri⑩ ple/PrV gpl-，Suvaxyni) le + b，Suvaxyn? ple + b，Suvaxyn? PLE + B/PrVgpl-, Suvaxyn.: Si V, Suvaxyn? siv/Mh-one, Suvaxyn? p, Suvaxyn? PrVgpl-, Suvaxyn? PCV-20ne Shot (都来自 Fort Dodge Animal Health, OverlandPark, KS, USA (Wyeth) ; SGOURMUNEi),
SCOURMUNE?-C,SCOU RMUN E(B)-CR5AR-PAC?-PD+ER,
AR-P ARAP AC?+ER, M + Rhu si gen? s M+PAC?, MaxiVac Excell?3,
MaxiVac⑩ HlNl，MaxiVac? H3N2，MaxiVae?-FLU? MaxiVac?-M+,Maxi Vac E-XCell?, MaxiVac Excell3, PARAPAC?, PNEU PAC?, PNEUPAC?-ER, PNEU PAC?+ER, PRV/Marker Gold?, PRV/Marker Gold?, PRV/Marker Goid?-MaxiVac? FLU, Rhusigen?, Gletvax6, Covexin8, M+PAC, GletvaX plus, M-ParapaC?SS PAC? (都来自 Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, USA);AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN,⑶LISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS-GLASSER, MYPRAVAC SUIS,
NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (都来自 Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona,Spain);Clostricol, Coliporc Plus,Haeppovac, Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART+EP, RESPIPORC FLU,Respiporc M.HY01SH0T, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35(都来自 IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Germany) ;Mypravac Suis, (Albrecht GmbH, Germany) ;Haemo Shield?P , Parapleuro Shield? P , Parapleuro Shield? P + B E , Rllinicell?FD, RhiniShieId?TX4, Prefarrow Shield? 9, Prefarrow Strep Shield?, Clostratox?15CI), Clostratox^ C, Clostratox? Ultra C1300, Porcine EcoIizerD 3+C, PorcinePili Shield ?+C, Porcine Pili Shield ?Porcine Ecolizer? 3，Ery Serum?EryShield?Ery Vac Oral , Ery Shield?+L5, PanSTAR?Ery, Erycell?Parvo Shield?EjParvo Shields L5E，Parvo Shield? L 5，P a r v。Shield? \ Para




Shield
PneumoSTAR SIVj PneumoSTAR?Myco, Lepto Shield?5, Myco ShieIdr^Salmo Shield
2，Salmo Shield? Live, Amitox Tet?C.Perfingens Type A Toxoid(都来自 NovartisAnimal Health, Basel, Switzerland) ; Nitro-Sal (Akro);或任何包含在上述组合物中的抗原。或者，当PCV2抗原已存在于任何那些疫苗中时，将(i)如本文所述的PCV抗原添加到这些组合物/抗原的任一者中，或(ii)将这些组合物/抗原的任一者中的PCV抗原用本文所述的PCV2抗原替代。
[0184]根据进一步的方面，组合疫苗的所述额外的免疫学活性组分选自:Enteriso瞻 ileitis, Enterisol? ileitis FF, Enterisol? sc-54, Enterisol?SC-54FF, Enterisol? ery-ALC, Ingelvac? app ALC, Ingelvac? AR4, Inge丨vac⑩HP-l, Ingelvac? hpe-1, Ingelvac? m.hyo, Ingelvac? prrs mlv, Ingelvac⑩
p RR s AT P，higdvae? PRV — Gi，Reprocyc? PRRS ple, Reprocyc?
PLE, Tetguard?, Toxivac? AD + E, Toxivac? Plus Parsius,(都来自Boehringer Ingelheimj St.Joseph,MO，USA) ;CircoventjPorcilis ColijPorcilisERY+PARVO，Porcilis EryjPorcilis GlasserjPorcilis ParvojPorcilis PorcoliDF，Porcilis APP，Porcilis AR-T，Porcilis AR-T DF，Porcilis Porcoli,PorcilisPorcoli Diluvac forte，PorciIis PRRS，Porci I is Porco I 5，Porci I isAujeszkyj Porcilis Begonia Diluvac, Porcilis Begonia 1.D.A.L., Porcilis BegoniaUnisole, Porcilis M_ hyo, Porcilis Atrinord, Myco SlletlCert? BPMj Myco Silcnccr?
BPMEj Myco Silencei# ME, Myco Silencer? Mj Myco Sileacei1? Once, Myco Silencei#
MEHj Rhinogen? BPE，廷CXE5000jOCXSE，Score，Sow
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RCEj ProSystem? trec ProS ystem? Pilimune，ProSystem? Rotamune? 与
Imugan? II，ProSystem? Rota, ProSystem? Rotamune KVj Pro System?
TG-Emune? Rota 与 Imugan? II，ProSystem? TGE/Rota，ProSystem?
TG-Emune? 与 tawgen⑩，ProSystem? tge，MaGESTiC7，MaGESTiC8，MaG
ESTic? 与 Spur?，MaGESTldD 7 与 Spw?，MaGESTic? 8 与 Spur?，
End-FLUenceC? 与 ImugeiK? 11，EB1-FLUence⑩ 2，PRRomiSE?，PRV-Begonia
与 Diluvac Forte?5 AfgUS? SC/ST, Strep Bacj Strep Bae? 与 IlIlUgen⑩ II，C
olisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus,Erysorb Parvo (都来自 Intervet Inc.，Mi Ilsboro，DE，USA) ;Hyoresp,Circovac，Neocolipor，Parvoruvac，Parvosuin, Progressis, Viraflu,Akipor6.3,Jespur gl-，JesfIu gl-(都来自 Merial
LTD，Duluth，GA); ER BAC* plus，ER BAC?, ER BAC* PLUS/LEPTOFERM-5?，
ER BAC? Leptoferm-5?, Farrowsure⑧，Farrowsure? B, FARROWSURE?plus B, FARROWSlJRRa plus, FARROWSURE? prv, farrowsure b
-PRV, FLUSURE?, FLUSURE?RTU, FLUSURE?/ER BAC? PLUS, FLUSURE?/ER
BAC Pl.,us;x, FLUSURE?/RESPISURE?, FLUSURE?/RESPISUREu
R T u , FLUSURE?/RE SPISURE-ONE*/ER BAC* plus，FLUSURE?/RespiSurel ONE?/ER BAC Plus?, FLUSURE?/RESPISURE ONE' FLUSURE?/RESPISURE1 ONE?, FLU SURE/Farrowsure Plus, F LU SURE/Farrowsure PlusB，LITTERGUARD* L T - C , LITTERGUARDe L T，PleuroGuarde
4，Pneumosuis III，Stellamune One, Stellamune Uno，StellamuneOnce,Stellamune Mono, Stellamune Mycoplasma,Respisure One, Respisure?,
Respisurel ONE.，Respisurel Onc^/HR Bac Plus?, Enduracell
Tj Zylexis (原名 Baypamune)，Alrubac义 1 3, JBnUiVac?, BratiVac?_B，Leptoferm-51 MParvo-Vac?/Leptoferm-5?, PR-Vac B-Ki I led.PR-Vac κ.PR-VacPlus?.(都来自 Pfizer Inc., New York,NYj USA) ;Suvaxyn MHOne, Suvaxyn RespiFend? MH, Suvaxyn Mycoplasma，Suvaxyn AujeszkyBartha+Diluent，Suvaxyn Aujeszky Bartha+o/w, Suvaxyn Aujeszky-FlujSuvaxynAujeszky783+o/w, Suvaxyn EryjSuvaxyn Flu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-OnejSuvaxyn
Parvo STjSuvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend? app, Suvaxyn RespiFend?hps, Suvaxyn RespiFend? mh/hps, Suvaxyn RespiFend? MH, Suvaxyn? AR/T/E, Suvaxyn? EC-4, Suvaxyn? E, Suvaxyn?-E, Suvaxyn? E-oral, Suvaxyn?ple, Suvaxyn? PLE/PrV gpl-, Suvaxyn? le+b Suvaxyn? ple+b, Suvaxyn?PLE+B/PrV gpl-, Suvaxyn? SIV, Suvaxyn? siv/Mh-one, SuvaxynC? p, Suvaxyn?PrV gpl-, Suvaxyn? PCV-20ne Shot (都来自 Fort Dodge Animal Health, OverlandPark, KS, USA (Wyeth) ; SCOURMUNE?,
SCOURMUNE?-C,SCOURMUNE?-CR,AR-PAC?-PD+ER,
AR-PARAPAC?+ER, M + Rhusigen?, M+PAC?, MaxiVac Excell?3,MaxiVac⑧ H I N I，MaxiVae? H 3 N 2，MaxiVac(R-)-FLU, MaxiVac?-M+，MaxiVac Excell?, MaxiVac Ex c e I I 3 , PARAPAC?, PNEU PAC?，PNEU PAC⑩-ER，PNEU PAC?+ER，PRV/Marker Gold?, PRV/Marker Gold?, PRV/Marker Gold?-MaxiVac? FLU, Rhusigen?, Gletvax6, Covexin8, M+PAC, Gletvaxplus, M-Parapac?..SS PAC'1-:(都来自 Schering-Plough Animal Health Corporation, Kenilworth, NJ, USA);AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, I UPRASUIS-GLASSnR, MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUIN, PARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DT, SUIPRAVAC-PRRS, SUIPRAVAC-RC, TOXIPRA PLUS (都来自 Laboratorios Hipra S.A., Amer, Girona, Spain) ; ClostricoI,Coliporc Plus, Haeppovac,Per-C-Porc, Porciparvac, RESPIPORC ART+EP, RESPIPORCFLU,Respiporc M.HYOlSHOT, Rhusiovac, Rotlauf-Lebendimpfstoff, Salmoporc, Suisaloral, AK-vac MK35(都来自 IDT Impfstoffwerk DessaTornau, Tornau, Germany);Mypravac Suis, (Albrecht GmbH, Germany) ; Haemo Shield? P, Parapleuro Shield?P, Parapleuro Shield? P+BE, Rhiriicell? FD, Rhini Shield?TX4, Prefarrow Shield?9, Prefarrow strep Shield?，Oostratox? BCD，Clostratox(D c, Clostratox? UltraC1300, Porcine Ecolizer? 3+C, Porcine Pili Shield?.+C, Porcine Pili Shield?..Porcine Ecolizer? 3，Ery Serum?..Ery Shield?..Ery Vac Oral, Ery Shield?+L5，PanSTAR?Ery, Erycell?..Parvo Shield? E，Parvo Shield? L5E, Parvo Shield?L5, Parvo Shields, Para Shield-- PneumoSTAR SIVj PneumoSTAR?Myco, Lepto
Shield?5, Myco Shield?..Salmo Shield? 2， Salmo SWeld? Live, AmitoxTet?..C.Perfingens Type A Toxoid(都来自 Novartis Animal Health, Basel, Switzerland) ;Nitro-Sal (Akro);或任何包含在上述组合物中的抗原。或者，当PCV2抗原已存在于任何那些疫苗中时，将⑴如本文所述的PCV抗原添加到这些组合物/抗原的任一者中，或(ii)将这些组合物/抗原的任一者中的PCV抗原用本文所述的PCV2抗原替代。
[0185]配制剂(formulations)
[0186]本发明的一项重要方面是制备组合疫苗(combination vaccines)。本领域技术人员知道可包含在该组合物中的额外组分(还参见Remington’ sPharmaceutical Sciences.(1990).第18版Mack Publ.，Easton)。专家可使用已知的注射用、在生理学上可接受的无菌溶液。为了制备立即可用的非经肠注射或输液用溶液，可容易地获得等张水溶液，例如生理盐水或相应的血浆蛋白质溶液。药物组合物可以冷冻干燥或干制备物的形式存在，可在使用之前，在无菌的条件下直接以已知的注射用溶液加以重建，例如作为包含多个部分的试剂盒。
[0187]此外，本发明之免疫和疫苗组合物可包含一种或多种在兽医上可接受的载体。当在本文中使用时，〃兽医上可接受之载体〃包括任何和所有的溶剂、分散介质、包衣(coatings)、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等张剂、延迟吸收的试剂， 坐坐寸寸ο
[0188]稀释剂可包括水、生理盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等张剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖等等。稳定剂包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐类等
坐寸ο
[0189]优选的佐剂是上述的那些。免疫原性组合物更可包含一种或多种其它的免疫调节剂，例如白介素、干扰素或其它的细胞因子。免疫原性组合物还可包括庆大霉素和硫柳汞。在本发明之语境中所使用的佐剂和添加物的含量或浓度，可由本领域技术人员容易地确定，本发明意图涵盖包括从大约50微克到大约2000微克佐剂的组合物，而更优选大约250 μ g/ml剂量的疫苗组合物。在另一优选的具体实施方案中，本发明意图涵盖包括从大约I μ g/ml到大约60 μ g/ml抗生素，更优选低于大约30 μ g/ml的抗生素的疫苗组合物。
[0190]根据更进一步的具体实施方案，首先将组合疫苗脱水。若先通过其它方法将该组合物冷冻干燥或脱水，然后在接种疫苗之前，以含水(例如生理盐水、PBS (磷酸缓冲之生理盐水))或非-含水溶液(例如油乳剂(以矿物油或植物/可代谢油为基础/单或双乳剂为基础)、以招为基础、以卡波姆(carbomer)为基础的佐剂)，将该组合物再水合。
[0191]剂量和施用[0192]根据本发明，施用于猪的有效量的组合疫苗能提供对抗PCV2和上文列举之至少一种额外病原体引起之微生物感染的有效免疫力。上文列举了用以治疗和预防微生物学疾病之抗原的优选组合。
[0193]根据更进一步的具体实施方案，以大约2至4周的间隔，将I或2个剂量的组合疫苗施用于猪。例如，当动物大约2至3周到大约8周大时，进行第一次施用。在第一次疫苗接种的第一次施用之后大约I至大约4周，进行第二次施用。根据更进一步的具体实施方案，在施用第二个剂量之后间隔3至12个月进行再接种。后续疫苗剂量的施用优选每6个月到一年进行一次。在另一优选的具体实施方案中，在大约2至3周龄之前接种疫苗的动物应再接种。后续疫苗剂量的施用优选每年一次。
[0194]组合疫苗的有效量，将视疫苗的成分和施用时间表而定。通常，当在组合疫苗中使用失活病毒或经修饰的活病毒制备物时，疫苗每个剂量含有大约IO2至大约IO9TCID5tl，优选的是每个剂量大约IO3至大约IO8TCID5tl，更优选每个剂量大约IO4至大约IO8TCID5tlt5 —般而言，失活抗原的用量通常比经修饰的活病毒更高。通常，当在组合疫苗中使用细菌抗原时，该疫苗每个剂量含有大约IO3至大约IO9个菌落形成单位(CFU)，优选每个剂量大约IO4到 大约IO8(CFU)，更优选每个剂量大约IO5到大约IO6(CFU)。亚单位疫苗通常以每个剂量至少
0.2微克抗原的抗原包含水平来施用，优选的是大约0.2到大约400微克/剂量，更优选大约0.3到大约200微克/剂量，甚至更优选大约0.35到大约100微克/剂量，甚至更优选大约0.4到大约50微克/剂量，甚至更优选大约0.45到大约30微克/剂量，甚至更优选大约0.6到大约15微克/剂量，甚至更优选大约0.75到大约8微克/剂量，甚至更优选大约
1.0到大约6微克/剂量，而甚至更优选大约1.3到大约3.0微克/剂量。例如，PCV20RF2抗原的抗原包含水平，优选的是本文提供的PCV20RF2蛋白质，含有大约2微克到大约150微克，更优选大约2微克到大约60微克，甚至更优选大约2微克到大约50微克，甚至更优选大约2微克到大约40微克，甚至更优选大约2微克到大约30微克，甚至更优选大约2微克到大约25微克，甚至更优选大约2微克到大约20微克，甚至更优选大约4微克到大约20微克，而甚至更优选大约4微克到大约16微克。在包含(37)的组合疫苗的情况下，优选是使用至少I至10个log,更优选5-10个log,最优选的是6-8个log。在包含(41)的组合疫苗的情况下，优选使用至少I至10个log,更优选3-10个log,最优选的是5-6个log。
[0195]可以皮内(intradermally)、气管内或阴道内之方式施用根据本发明之组合物。优选是以肌肉内或鼻内之方式施用该组合物。在动物身上，可证明依上文所述通过静脉内或通过直接注射至靶组织来施用所述药物组合物是有利的。对于全身施用，静脉内、血管内、肌肉内、鼻内、动脉内、腹腔内、口服或鞘内路径是优选的。更多局部应用可通过皮下、皮内(intradermally)、皮内(intracutaneously)、心脏内、叶内(intralobally)、髓内、肺内，或直接或在接近待治疗之组织处(结缔组织、骨组织、肌肉组织、神经组织、表皮组织)实施。依据期望的治疗期间和效力，可施用根据本发明之组合物一或多次，还可间歇地施用，例如按日为基础，持续数天、周或月，并以不同的剂量。
[0196]治疗方法
[0197]本发明另一重要的实施方案，是预防或治疗由PCV2以及一种或多种猪致病性微生物引起的疾病的方法，其中以适当的剂量，将PCV2抗原(优选本文提供的PCV20RF2蛋白质)和额外的免疫学活性组分施用于有需要的动物，所述额外的免疫学活性组分可有效治疗和/或预防由所述其他猪致病性微生物引起的感染。根据更进一步的方面，该PCV20RF2蛋白质是上文所述的抗原性组合物的一部分。因此，本发明的另一项方面涉及组合疫苗，其包括本文提供的任一种抗原性组合物，且其包括PCV20RF2蛋白质和可有效治疗和/或预防由所述其他猪致病性微生物引起的感染的其他免疫学活性组分。
[0198]附图简要说明
[0199]图1为PCV20RF2重组杆状病毒的优选构建过程的流程图，以及
[0200]图2a和2b分别为如何产生根据本发明之组合物的流程图。
[0201]优选实施方式详述
[0202]下列实施例展示根据本发明之优选的材料和程序。然而，应了解这些实施例仅为了解释而提供，其中任何内容均不应视为对本发明之全部范围的限制。
[0203]实施例1
[0204]本实施例比较使用本发明之方法和现有技术中已知的方法的0RF2的相对产率。以大约1.(^106个5€+细胞/1^，在3001^昆虫不含血清的培养基Excell420(JRHBiosciences, Inc., Lenexa, KS)中，分别接种四个 1000mL转瓶(spinner flask)。母细胞培养物(master cell culture)鉴定为 Sf+(草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)母细胞忙备物，第19代，批号#N112-095W。用来产制Sf+母细胞贮备物的细胞系获自Protein SciencesCorporation, Inc., Meriden, CT。用于本实施例之Sf+细胞株限制在第19至59代之间。其它的代数也可用于本发明的目的，但为了将过程放大以供大规模生产，至少传代至19代或许是必要的，而传代超过59代可能对表达有影响，虽然对此没有进行研究。更详细地说，使来自液氮储存的起始Sf+ 细胞培养物在无菌转瓶中恒定搅拌下悬浮生长于Excel 1420培养基中。使培养物生长在装有25至150mL的Excel 1420无血清培养基的IOOmL至250mL转瓶中。当细胞繁殖至1.0-8.0xlO6个细胞/mL的密度时，以0.5-1.5xl06个细胞/mL的种植密度，将它们分配至新的容器中。接下来的培养物培养在尺寸最多达36升的转瓶中，或最多300升的不锈钢生物反应器中，在25-29°C下持续2-7天。
[0205]在接种之后，在27°C下培养烧瓶4小时。然后，以含有PCV20RF2基因(SEQ IDNO: 4)的重组杆状病毒接种每个烧瓶。如下制备含有PCV20RF2基因的重组杆状病毒:以PCR扩增来自PCV2之北美株系的PCV20RF2基因，使其含有5’ Kozak’s序列(SEQ ID NO:1)和3’EcoRl 位点(SEQ ID NO: 2)，克隆到 pGEM-T-Easy 载体(Promega, Madison, WI)内。然后，接着将其切下并亚克隆到转移载体pVL1392 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)内。在本文中该亚克隆的部分以SEQ ID勵:7表示。将含有？(^201^2基因的？￥1^1392质粒命名为 N47-064Y,然后与]_iaculoGok.r' (BD Biosciences Pharmingen)杆状病毒 DNA共转染到Sf+昆虫细胞(Protein Sciences, Meriden, CT)内，产生含有PCV20RF2基因的重组杆状病毒。该新的构建体在本文中以SEQ ID N0:8表示。噬斑纯化含有PCV20RF2的重组杆状病毒，且使母病毒种株(Master Seed Virus, MSV)在SF+细胞株中增殖、分成等份试样且储存于_70°C。使用杆状病毒特异性引物的PCR-RFLP，将MSV肯定地鉴定为PCV20RF2杆状病毒。在间接荧光抗体测定中利用多克隆血清或单克隆抗体检测到感染了 PCV20RF2杆状病毒而产生MSV或工作病毒种株(Working Seed Virus)的昆虫细胞表达PCV20RF2抗原。另外，凭借N-末端氨基酸测序确认了 PCV20RF2杆状病毒的身份。还根据9C.F.R.113.27(c)、113.28及113.55测试了 PCV20RF2杆状病毒MSV的纯度。接种于转瓶中的每一重组杆状病毒具有不同的病毒感染复数(MOI)。将瓶I用7.52mL的.088M0I的种株接种；瓶2用
3.0lmL的0.36M0I的种株接种;瓶3用1.5mL的0.18M0I的种株接种；将瓶4用0.75mL的
0.09M0I的种株接种。本文提供构建PCV20RF2重组杆状病毒的基本步骤的示意性流程图作为图1。
[0206]用杆状病毒接种后，随后将转瓶在27 V ±2°C下培养7天，同时还在IOOrpm下搅动。所述转瓶使用通风盖以允许空气流动。对于接下来的7天，每24小时自每一转瓶取样品。提取(extraction)后，将每一样品离心并将离心沉淀及上清液两者分离，随后经由
0.45 μ m-1.0 μ m孔径的膜微过滤。
[0207]随后，通过ELISA测定定量所得样品中存在的0RF2的量。用蛋白G纯化的猪抗PCV2Pab IgG(在PBS中1:250稀释)作为捕捉抗体，在0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)中稀释至1:6000进行ELISA测定。随后，将100 μ L抗体置于微量滴定板的孔中，密封，并在37°C下温育过夜。随后，用包含 0.5mL Tween20 (Sigma, St.Louis, MO)、IOOmLlOX D-PBS (Gibcolnvitrogen, Carlsbad, CA)及899.5mL蒸馏水的洗涤溶液将板洗涤三次。随后，将250 μ L封闭溶液(5g Carnation脱脂奶粉(Nestle, Glendale, CA)加于IOmLD-PBS中，用蒸懼水补至IOOmL)添加至每个孔中。下一步为洗涤测试板，然后添加预稀释的抗原。预稀释抗原的制备是通过将200 μ L稀释剂溶液(999.5mL D-PBS中加0.5mL Tween20)添加到稀释板上的每个孔中。随后，将样品以1:240的比率及1:480的比率稀释，且随后将这些稀释样品中的每一个取100 μ L，添加至稀释板上的一个顶部孔中(即，一个顶部孔容纳IOOyL的1:240的稀释物，另一个顶部孔容纳100 μ L的1:480的稀释物)。随后在板的剩余部分上进行连续稀释，即连续地从一个孔移出100 μ L转移至板上相邻的下一个孔中。每个孔在进行下一次转移之前先混合。测试板的洗涤包括用洗涤缓冲液洗涤该板三次。随后，将该板密封并在37°C温育一小时，然后用洗涤缓冲液再洗涤三次。所使用的检测抗体为PCV 0RF2的单克隆抗体。将检测抗体以稀释剂溶液稀释至1:300，然后将100 μ L经稀释的检测抗体添加至孔中。随后，将板密封并在37°C温育一小时，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。随后，将正常兔血清(Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)添加至稀释剂溶液中至1%浓度而制成偶联稀释剂。将山羊抗小鼠的偶联抗体(H+l)-HRP (Jackson Immunoresearch)用偶联稀释剂稀释至1:10，000。随后，将100 μ L经稀释的偶联抗体添加至每个孔中。随后，将该板密封并在37°C温育45分钟，然后用洗涤缓冲液洗涤三次。将与等体积过氧化物酶底物B (KPL)混合的 100 P L 底物(TMB 过氧化物酶底物，Kirkgaard and Perry Laboratories (KPL),Gaithersberg, MD)添加至每个孔中。将板在室温下温育15分钟。随后，向所有孔中添加IOOyL的IN HCl以终止反应。随后，使该板通过ELISA读取器。此测定的结果提供于以下表1中:[0208]表1
[0209]
[0210]
?Μ j转瓶j离心沉淀中的0RF2(ug) j上清液中的0RF2(ug)
3I 47.5312
【权利要求】
1.一种多价组合疫苗，包括对减少2型猪圆环病毒感染的发生或减轻2型猪圆环病毒感染的严重性有效的免疫学作用剂，以及至少一种能有效对抗在猪中引起疾病的其它生物的免疫原活性组分。
2.权利要求1的多价组合疫苗，其中所述对减少2型猪圆环病毒感染的发生或减轻2型猪圆环病毒感染的严重性有效的免疫学作用剂是2型猪圆环病毒抗原。
3.权利要求2的多价组合疫苗，其中所述2型猪圆环病毒抗原是失活的2型猪圆环病毒抗原、活的经修饰或减毒的2型猪圆环病毒、包含2型猪圆环病毒的至少一种免疫原性氨基酸序列的嵌合病毒、或包含2型猪圆环病毒的至少一种免疫原性氨基酸序列的任何其它多肽或组分。
4.权利要求1至3中任一项的多价组合疫苗，其中所述2型猪圆环病毒抗原是由与2型猪圆环病毒的0RF2具有至少80%序列同一性的DNA序列所编码的蛋白质。
5.权利要求1至4中任一项的多价组合疫苗，其中该2型猪圆环病毒抗原是由杆状病毒表达的ORF2抗原。
6.权利要求1至4中任一项的多价组合疫苗，其中所述能有效对抗在猪中引起疾病的其它生物的免疫原活性组分选自由下列生物的抗原所组成的群组:大叶性肺炎放线杆菌；腺病毒；α病毒，如东方马脑脊髓炎病毒；支气管炎博德特氏菌；短螺旋体属菌种，优选猪痢疾短螺旋体；结肠菌毛样短螺旋体，猪布鲁氏菌，优选生物型1、2和3 ;经典猪瘟病毒；梭菌属菌种，优选艰难梭菌、产气荚膜梭菌Α、B和C型、诺氏梭菌、败毒梭菌、破伤风梭菌；冠状病毒，优选猪呼吸道冠状病毒；猪血虫体；猪红斑丹毒丝菌；大肠杆菌；副猪嗜血杆菌，优选亚型1、7和14 ;凝血 性脑脊髓炎病毒；日本脑炎病毒；细胞内劳索尼亚氏菌；钩端螺旋体属，优选澳大利亚钩端螺旋体；犬钩端螺旋体；流感伤寒钩端螺旋体；出血黄疸钩端螺旋体；和问号钩端螺旋体；波摩那钩端螺旋体；塔拉索夫钩端螺旋体；分枝杆菌属菌种，优选鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌和牛分枝杆菌；猪肺炎枝原体；多杀巴斯德氏菌；猪巨细胞病毒；猪细小病毒；猪生殖与呼吸综合征(PRRS)病毒；假狂犬病病毒；轮状病毒；沙门氏菌属菌种，优选鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌；猪葡萄球菌；葡萄球菌属菌种，优选链球菌属菌种，优选猪链球菌；猪疱疹病毒；猪流感病毒；猪痘病毒；猪痘病毒；水泡性口炎病毒和猪水疱疫病毒。
7.权利要求1-6任一项的多价组合疫苗，其中所述能有效对抗在猪中引起疾病的其它生物的免疫原活性组分选自由下列物质中包含的抗原或它们的组合所组成的群组:Enterisol? Ileitis, Enterisol? Ileitis FF, Enterisol?sc-54, Enteriso瞻 SC-54FF，Enterisol? ery-alc，Ingelvae? app alc, Ingelvac?AR4, Ingelvac? HP-1，Ingelvac? HPE-1，Ingelvac? m.hyo, Ingelvac?PRRS MLV，Ingelvac? prrs atp, Ingelvac? prv-gi, Reprocyc(I) PRRSPLE, Reprocyc? PLE, Tetguard?, Toxivac? AD+E, Toxivac? PlusParsius,(都产自 Boehringer Ingelheim, St.Joseph, MO, USA);Circovent,Porcilis Coli,PorcilisERY+PARVO，Porcilis EryjPorcilis GlasserjPorcilis ParvojPorcilis PorcoliDF，Porcilis APP，Porcilis AR-T，Porcilis AR-T DF，Porcilis Porcoli，PorcilisPorcoli Diluvac forte,Porcilis PRRS，PorciIis PorcoI 5，Porci I isAujeszkyjPorcilis Begonia Diluvac,Porcilis Begonia 1.D.A.L.，PorcilisBegonia Unisole，Porcilis M.hyo，Porcilis Atrinord，Myco Silencer?BPMj Myco Silencer? BPMEj Myco Silencer? ME, Myco Silencei# Mj Myco Silencer?Once1Myco Silencer? meh, RhinogenCD bpe, Rhinogen? CTE5000, Rhinogen?CTSEj Score, Sow Bac? E II，Sow BEG? CE II，Sow Bac?trec, ProSystem?CE, ProSystem? rce, ProSystem? trec, ProSystem? Pillmune, ProSystem?Rotamune? 与 Imugan? n, ProSystem? Rota, ProSystem? RotamuneKV, ProSystem(I) TG~Emune? Rota 与 Imugan? n, ProSystem? tge/Rota, ProSystem? TG-Emune? 与 ImugenC?; ProSystem? tge, MaGESTlC7,MaGESTlC8，MaGESTic? 与 Spur?, MaGESTic? 7 与 spur?5 MaGESTic? 8 与SpurD5 End-FLUence? 与 Imugen(S) II，End-FLUence? 2, PRRomiSE?,PRV-Begonia 与 DlluvaC Forte?', ArgUS(R..SC/ST, Strep Bac, Strep Bac? 与Imugen? II, CoIisorb, Heptavac, Lambivac, Porcovac plus, Erysorb Parvo (都产自 Intervet Inc., Millsboro, DE, USA);Hyoresp, Circovac, Neocolipor, Parvoruvac,Parvosuin, Progressis, Viraflu, Akipor6.3, Jespur gl-, Jesflu gl-(都来自 MerialLTD，Duluth，GA); ER BAC? plus, ER BAC?, ER BAG* PLUS/LEPTOFERM-5*1ER BAC? Leptoferm-5⑩》Farrowsure?, Farrowsure? B, FARROWSURE*PLUS B, FARROWSURE" PLUS, FARROWSURE^ PRV, FARROWSURE B-PRV, FLUSUREtm, FLUSURE?RTU, FLUSUREim/ER BAC? PLUS, FLUSURE?/ERBAC PLus?, FLUSURE?/RESPISURE#, FLUSURE?/RESPISURE^R T u，FLUSURETM/RESPISURE-ONE，ER !AC? plus, Flusuretm/RespiSurel ONE?/ER BAC p〗us?，FLUSURE?/RESPISURE ONE?, FLUSURE?/RESP I SURE I ONE?, FLUSURE/Farrowsure Plus, FLUSURE/FarrowsurePlus B, LITT1-RC1UARD LT-C, LITTFKGUARD_ LT, PleuroGuard*4，Pneumosuis III，Stellamune One,Stellamune UnojStellamuneOncejStellamuneMono, Stellamune Mycoplasma, Respisure One, Respisure?，Respisurel ONE⑩，Respisurel On€?/ER Bac Plus 紙 Enduracell Tj Zylexis (原名 Baypamune) , ΛI ι? bac k 3， BratiVaci κ., Brati Vac R -B,Lq>toferm-5TOParvo-Vac^!/,Leptoferm-5-- PR-Vac^-KiIIeti PR-VacIi? PR-VacPlus?.(都来自 Pfizer Inc.，New York, NY，USA) ; Suvaxyn MH One, Suvaxyn RespiFendC^MHjSuvaxyn Mycoplasma, Suvaxyn Aujeszky Bartha+Diluent，Suvaxyn AujeszkyBartha+o/w, Suvaxyn Aujeszky-FlujSuvaxyn Aujeszky783+o/w, Suvaxyn EryjSuvaxynFlu, Suvaxyn M.hyo, Suvaxyn MH-Onej Suvaxyn Parvo STj Suvaxyn Parvo/E, Suvaxyn RespiFend? APP, Suvaxyn RcspiFend? HPSj Suvaxyn RcSpiFcndtS) MH/HPSj Suvaxyn RespiFendCg) MH，Suvaxyn? AR/T/E，Suvaxyn? ec-4，Suvaxyn?E， Siivaxyn?-E, Suvaxyn? E - o r a I， Suvaxyn? PLE5 Suvaxyn? p L E /PrV gpl-，Swaxyn? le + b，Suvaxyn? PLE + B，Suvaxyn? PLE + B/PrVgpl-，Suvaxyn? siv, Suvaxyn? siV/Mh-one, Suvaxyn? p，Suvaxyn? prvgpl-, Suvaxyn? PCV-20ne Shot (都来自 Fort DodgeAnimal Health, OverlandPark, KS, USA (Wyeth) ; SCOURMUNE?，SCOURMUNE?C，SCOURMUNE ⑧ CR，AR 画 PACPD+ER’ AR-PARAPAC?+ER, M+ Rhusig觀(? M+PAC?, MaxiVac Exeell⑩3,MaxiVac? HlNlj MaxiVae? H 3 N 2，MaxiVac(I)-FLU, MaxiVac€；-M+,MaxiVac Exccll?5 MaxiVac E x c e I I 3 , PARAPAC.，PNEU PAC⑩，PNEU PAC(B)-ER, PNEU PACCB)+ER5 PRV/Marker Gold?，PRV/Marker Gold?，PRV/Marker GoldCD-MaxiVac? FLU, Rhusigen?, Gletvax6, Covexin8, M+PAC, Gletvaxplus, M-Parapac?..SS PAC? (都来自 Schering-Plough Animal Health Corporation，Kenilworth, NJj USA);AMERVAC-PRRS, AUSKIPRA-BK, AUSKIPRA-GN, COLISUIN-CL, COLISUIN-TP, ERYSIPRAVAC, GRIPORK, HIPRASUIS~GLASSER5 MYPRAVAC SUIS, NEUMOSUIN, PARVOSUINjPARVOSUIN-MR, PARVOSUIN-MR/AD, RINIPRAVAC-DTjSUIPRAVAC-PRRSjSUIPRAVAC-RCj TOXIPRA PLUS (都来自 Laboratorios Hipra S.A.，Amerj Girona, Spain) ; Clostrico，1，Coliporc Plus, HaeppovacjPer-C-PorcjPorciparvacjRESPIPORC ART+EPjRESPIPORCFLU,Respiporc M.HY01SH0T，RhusiovacjRotlauf-Lebendimpfstoff，SalmoporcjSuisaloral，AK-vac MK35(都来自 IDT Impfstoffwerk DessaTornauj Tornauj Germany);Mypravac Suisj (Albrecht GmbH, Germany) ;Haemo Shield? P, Parapleuro Shield?Pj Parapleuro Shield? P+BE，Rhilli cel_) FD，Rhini Shield?TX4, Prefarrow Shield?，9, Prefarrow Strep Shieid-- Closiratox? BCD，CtostratOX⑩ C，ClostratoX⑩ UltraC1300, Porcine Ε?οΙ?ζβΛ 3+C，Porcine Pili ShieldTM.+C, Porcine Pili Shield?..Porcine Ecolizer? 3，Ery Serum?..Ery Shield?..Ery Vac Oral, Ery Shield?+L5, PanSTAR?Ery, ErycelI?..Parvo Shield? E, Parvo Shield? L5E, Parvo Shield?L5, Parvo Shield?, Para Shield?, PneumoSTAR SIV, PneumoSTAR?Myco, LeptoShield?5, Myco Shield?..Salmo Shield? 2，Salmo Shield⑩ Live,Amitox Tet?..C.Perfingens Type A Toxoid(都来自 Novartis Animal Health, Basel, Switzerland) ;Nitro-Sal(Akro)。
【文档编号】A61K39/295GK103536914SQ201310472580
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2006年12月28日 优先权日:2005年12月29日
【发明者】迈克尔.B.鲁夫, 菲利普.韦恩.海斯, 马克.艾科迈耶, 格雷格.尼采尔, 梅里尔.谢弗 申请人:贝林格尔.英格海姆维特梅迪卡有限公司