壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种壁衣提取物的新用途，该新用途是壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用。所述壁衣提取物是按如下方法制备的：以壁衣为原料，提取挥发油，并采用大孔吸附树脂纯化技术分别得到壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C，按一定比例混合，即为壁衣提取物。本发明所提供的壁衣提取物对制备抗肝癌药物具有重要意义。
【专利说明】壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物医药领域，涉及一种中药材提取物在制备抗肝癌药物中的应用，具体是涉及壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用。
【背景技术】
[0002]据2010年2月卫生部统计资料，每年全球癌症死亡人数达1000万。目前全球四分之一人口死亡的原因是癌症所致，并预测按目前的趋势发展下去，到2050年将有二分之一的死亡者是由于患了癌症。我国恶性癌发病率以每年2.5-5%速度增长，已成为严重危害人类生命的兀凶。在各种类型的癌症当中以肝癌等发病率较闻。 [0003]肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。原发性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一，根据最新统计，全世界每年新发肝癌患者约六十万，居恶性肿瘤的第五位。原发性肝癌按细胞分型可分为肝细胞型肝癌、胆管细胞型肝癌及混合型肝癌。按肿瘤的形态可分为结节型、巨块型和弥漫型。原发性肝癌在我国属于高发病，一般男性多于女性。中国是乙肝大国，我国的肝癌多在乙肝肝硬化的基础上发展而来，丙肝病人也在逐渐增加，乙肝后也会发展为肝癌。目前我国发病人数约占全球的半数以上，占全球肝癌病人的55%，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手，其危险性不容小视。肝癌可发生于任何年龄，但以31~50岁为多，男女之比约为8:1。90%以上在确诊时属中、晚期，手术机会多已错过，所以采用现代综合治疗方法常因放、化疗和免疫治疗而受到一定限制；而放、化疗对本病的治疗毒副反应极大，适应证则减少，疗效也差；介入疗法虽有一定疗效，但需要相当高的条件和设备，花费也较大。故中医药治疗已成为本病的主要治疗手段之一。中医药还与放、化疗配合应用，能起到较好的“减毒增效”作用。
[0004]肝癌的中药治疗肝癌的病因，西医认为主要与慢性肝脏疾病、黄曲霉毒素、寄生虫、酗酒、遗传因素有关。在我国，与肝癌发病率关系最大的因素为乙肝病毒，特别是HBsAg阳性者。因此，HBsAg阳性者以及慢性肝病患者被列为肝癌的高危人群。有研究认为，HBsAg有直接致癌的可能，且不一定通过慢性肝病这一中间阶段。
[0005]中医认为本病主要由脏腑气血虚亏，脾虚湿聚，痰凝血瘀；六淫邪毒入侵，邪凝毒结，七情内伤，情志抑郁等，可使气、血、湿、热、瘀、毒互结而成肝癌。本病病位在肝，与脾、胆、胃密切相关，主要病机是正虚于内，邪毒蕴结。治疗上，按辨证论治，主要分以下四型:肝癌的中药治疗肝气郁结，方药选用柴胡疏肝散加减；气滞血瘀，选用复元活血汤化裁；湿热聚毒，茵陈蒿汤加减；肝阴亏虚，方药选用一贯煎合犀角地黄汤化裁。
[0006]壁衣为地衣类黄枝衣科植物壁衣Theloschestes f lavicans (Sw.) Norm的干燥叶状体。采集后，除去泥土，晒干。收载于《中华人民共和国卫生部药品标准藏药(第一册)》，标准编号:WS3-BC-0125-95。性凉，味苦。具有除热，解毒之功效。用于肺热，肝热，脉热，毒热。为我国藏蒙等少数民族地区的常用药物。但有关壁衣的基础研究尚十分有限，使该药材的后续推广和应用受到限制。有关壁衣化学成分及药理作用研究未见报道。[0007]国内专利检索结果，未见壁衣相关专利。
[0008]上述文献及专利等，尚未见壁衣或壁衣提取物用于制备抗肝癌药物的报道。
【发明内容】
[0009]本发明的目的在于提供壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用。
[0010]本发明是通过如下技术方案实现的:
本发明所用壁衣为为地衣类黄枝衣科植物壁衣Theloschestes flavicans (Sw.)Norm的干燥叶状体。
[0011]本发明壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用，所述壁衣提取物的制备方法为:
(1)壁衣，加8-15倍水，浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ；
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为壁衣重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得壁衣提取物B;
(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.10-1.20，通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度50%-70%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；
(4)上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C，其中一种或两种或三种按一定比例混匀，即得本发明的壁衣提取物。
[0012]壁衣提取物的制备方法为:
(1)壁衣，加8-15倍水，浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ；
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为壁衣重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得壁衣提取物B;
(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.10-1.20，通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度50%-70%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；
(4 )将上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混匀，即得本发明的壁衣提取物。
[0013]优选的壁衣提取物的制备方法为:
(1)壁衣，加12倍水，浸泡8小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ;
(2)将步骤(1)得到药渣A用70%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为壁衣重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得壁衣提取物B ；
(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.15，通过DlOl大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；(4 )将上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混匀，即得本发明的壁衣提取物。
[0014]本发明的壁衣提取物的制备方法，其特征在于:所采用的大孔吸附树脂为DlOl大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂、DM130大孔吸附树脂。
[0015]本发明的壁衣提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。
[0016]本发明的壁衣提取物以及壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C在制备抗肝癌药物中的应用。
[0017]本发明的壁衣提取物与化学药或中药或天然药物组成抗肝癌药物。
[0018]本发明的壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C与化学药或中药或天然药物组成抗肝癌药物。
[0019]本发明首次对壁衣采用大孔吸附树脂纯化技术，制备具有抗肝癌活性的提取物，制备工艺操作简便，生产成本低，适于工业化大生产。
[0020]本发明首次探索研究以地衣类黄枝衣科植物壁衣Theloschestes flavicans(Sw.) Norm的干燥叶状体为原料提取制备抗肝癌提取物。药理试验结果表明，壁衣提取物各组与模型组相比肿瘤体积缩小，用药两周壁衣提取物各治疗组瘤组织P53表达显著下降；巨噬细胞CD68检测结果示:壁衣提取物组与模型对照组比较，具有极其显著性差异(Ρ〈0.01)。
【具体实施方式】
[0021]下面通过具体实验例和实施例对壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用做进一步说明，但不限于本发明。
[0022]实施例1:壁衣提取物的制备
(1)壁衣25kg，加12倍水，浸泡8小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ；
(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度70%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为壁衣重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得壁衣提取物B ；
(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.15，通过DlOl大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；
(4)将上述壁衣提取物A、壁衣提取物B和壁衣提取物C混匀，即得本发明的壁衣提取物。
[0023]实施例2:壁衣提取物的制备
(I)壁衣，加15倍水，浸泡4小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间4小时，提取次数I次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ;(2)将步骤(1)得到药渣A用50%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为I次，每次提取时间为I小时，每次溶剂用量为壁衣重量的8倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得壁衣提取物B ；
(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.20，通过HPD600大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度70%的乙醇溶液洗脱，收集70%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；
(4 )将上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混匀，即得本发明的壁衣提取物。
[0024]实施例3:壁衣提取物的制备
(1)壁衣，加8倍水，浸泡12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间I小时，提取次数3次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ;
(2)将步骤(1)得到药渣A用95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为3次，每次提取时间为3小时，每次溶剂用量为壁衣重量的15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得壁衣提取物B ；
(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.10，通过DM130大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度50%的乙醇溶液洗脱，收集50%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；
(4)将上述壁衣提取物A、壁衣提取物B和壁衣提取物C混匀，即得本发明的壁衣提取物。
[0025]实施例4:壁衣提取物片剂的制备
取实施例2壁衣提取物335g，加入淀粉110g，混匀，制粒，干燥，过筛，加微晶纤维素48g，硬脂酸镁4.5g，混匀，压制成1000片，即得壁衣提取物片剂。
[0026]实施例5:壁衣提取物颗粒剂的制备
取实施例2壁衣提取物240g，加入糊精150g，混匀，制粒，干燥，整粒，即得壁衣提取物颗粒剂。
[0027]实施例6:壁衣提取物胶囊的制备
取实施例3壁衣提取物305g，加入淀粉85g，混匀，制粒，干燥，过筛，加入硬脂酸镁4g，混匀，装胶囊1000粒，即得壁衣提取物胶囊。
[0028]实验例1:壁衣提取物抗肝癌试验
1.1材料
实验动物:健康ICR小鼠70只，雄性，体重20±2 g(西安交通大学医学院实验动物中心提供)，28~30d。许可证号:SCXK(陕)2011-001。
[0029]实验瘤株:小鼠肝细胞癌瘤株(H22)均由第四军医大学大学动物实验中心所提供。
[0030]药物:按本发明实施例1方法制备壁衣提取物、壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物 C (批号分别为:20111011、20111012、20111013、20111014)。替加氟片(FT-207)，上海医药集团有限公司华联制药厂，国药准字:H31021668批号:110905。
[0031]主要试剂:P53蛋白BA0133多抗，免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物技术有限公司提供。兔抗小鼠巨噬细胞多克隆抗体(SnataCurz，USA) AD68免疫组化染色试剂盒，武汉博士德生物技术有限公司提供。生物活化素羊抗鼠IgG BA0523,DAB显色剂，免疫组化试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司；0.02%台盼蓝、PBS液0.0 Im构椽酸盐缓冲液、95 %乙醇、甲醛、二甲苯、双氧水、纯水均由陕西中医学院病理教研室提供。
[0032]主要实验仪器:超净工作台(苏州净化设备厂)，轮转式组织切片机(2135型德国)，光学显微镜(重庆光学仪器厂)，电子天平(上海第二分析仪器厂)，水平离心机(LD-42型，北京医用离心机厂)，电热恒温培养箱(上海医疗器械厂，HH.Bll.42)，低温冰箱一台(青岛海尔冰箱厂)，载玻片、盖玻片(上海亚荣化生仪器)，真彩色病理图像分析系统(厦门麦克奥迪公司)，CXD照相机，江苏捷达形态学分析软件(EJDAS0ID)，微波炉一台(LG电器有限公司)，离心管，湿盒等。
[0033]1.2实验方法
动物模型的制作:随机抽取10只小鼠做正常对照组外，其余40只造摸，小鼠肝癌H22肝癌瘤瘤株，无菌条件下抽取瘤液，离心(1500r/minX2min)，调整细胞浓度至每毫升悬液不少2X IOm2瘤细胞，然后用0.25mL注射器以0.2mL/只，小鼠右腋部皮下接种，本实验造摸的成功率为100%。实验分组及给药:造模后24h除正常空白对照组以外，将小鼠随机分为4组，分组当天开始灌胃给药，各组均连续给药14d:正常对照组:用生理盐水0.2mL/只/d ;模型对照组:用生理盐水0.2mL/只/d ;替加氟组:给予0.2mL/只/d ;10倍(含替加氟
4.0mg/mL)成人临床用量的替加氟片制成的水溶液；壁衣提取物、壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C，均灌胃，0.2mL/只，I次/d。
[0034]2实验结果
2.1抑瘤作用见表1。
[0035]表1 H22肝癌小鼠瘤重及抑瘤率的影响
【权利要求】
1.壁衣提取物在制备抗肝癌药物中的应用，所述壁衣提取物的制备方法为:(1)壁衣，加8-15倍水，浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ；(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为壁衣重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得壁衣提取物B;(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.10-1.20，通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度50%-70%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；(4)上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C，其中一种或两种或三种按一定比例混匀，即得本发明的壁衣提取物。
2.根据权利要求1所述的壁衣提取物的制备方法为:(1)壁衣，加8-15倍水，浸泡4-12小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间1-4小时，提取次数1-3次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ；(2)将步骤(1)得到药渣A用浓度50%-95%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为1-3次，每次提取时间为1-3小时，每次溶剂用量为壁衣重量的8-15倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得 壁衣提取物B;(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.10-1.20，通过大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度50%-70%的乙醇溶液洗脱，收集不同浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；(4 )将上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混匀，即得本发明的壁衣提取物。
3.根据权利要求1所述的壁衣提取物的制备方法为:(1)壁衣，加12倍水，浸泡8小时，采用水蒸气蒸馏法提取挥发油，提取时间2小时，提取次数2次，收集挥发油，即得壁衣提取物A ;将壁衣水提取液滤过，分别得到提取液A和药渣A ;(2)将步骤(1)得到药渣A用70%乙醇为溶剂，加热回流提取，提取次数为2次，每次提取时间为2小时，每次溶剂用量为壁衣重量的12倍，滤过，提取液回收乙醇，浓缩，干燥，即得壁衣提取物B ；(3)将步骤(1)得到的提取液A，浓缩至相对密度d=l.15，通过DlOl大孔吸附树脂柱，先用水洗脱，再用浓度60%的乙醇溶液洗脱，收集60%浓度乙醇洗脱液，浓缩干燥，即得壁衣提取物C ；(4 )将上述壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C混匀，即得本发明的壁衣提取物。
4.根据权利要求1、权利要求2所述的壁衣提取物的制备方法，其特征在于:所采用的大孔吸附树脂为DlOl大孔吸附树脂、HPD600大孔吸附树脂、DM130大孔吸附树脂。
5.根据权利要求1、权利要求2、权利要求3所述的壁衣提取物，通过加入药剂学允许的各种辅料，制成药剂学上的片剂、颗粒剂、胶囊等口服剂型。
6.根据权利要求1所述的壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C，在制备抗肝癌药物中的应用。
7.根据权利要求1所述的壁衣提取物A、壁衣提取物B、壁衣提取物C与化学药或中药或天然药物组成抗肝癌药物。
8.根据权利要求1所述的壁衣提取物与化学药或中药或天然药物组成抗肝癌药物。
【文档编号】A61P35/00GK103585190SQ201310525674
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月31日 优先权日:2013年10月31日
【发明者】孔倩倩 申请人:济南星懿医药技术有限公司