虎杖苷在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于中药材的活性成份在临床中的应用领域，尤其是中药材虎杖的提取物虎杖苷在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。本发明的主题为中药材虎杖的提取物虎杖苷在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。虎杖苷是白藜芦醇与葡萄糖结合的产物，均属于虎杖成分中的芪类化合物，即羟基二苯乙烯类化合物。现有的治疗动脉粥样硬化药物有他汀类、贝特类、烟酸类、不饱和脂肪酸、以及阿司匹林等，都具有明显的副作用用。如他汀类的消化系统反应、头昏、皮疹，阿司匹林的胃粘膜损伤、血小板和白细胞减少、消化道刺激和诱发哮喘等。本发明的虎杖苷通过提高机体SOD水平、降低氧化型的低密度脂蛋白的含量等作用机制有效地抑制动脉粥样硬化，具有高效安全的有益效果。
【专利说明】虎杖苷在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于中药材的活性成份在临床中的应用领域，尤其是中药材虎杖的提取物虎杖苷在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
【背景技术】
[0002]虎杖(学名:Polygonum cuspidatum),产于东亚地区，分布在日本北海道西部以南的地区、朝鲜半岛、台湾及中国的江苏、江西、山东、四川等地。味微苦，性微寒，含虎杖甙，黄酮等。虎杖具有活血定痛、利湿退黄、治湿热黄疸、清热解毒、化痰止咳的功效，多用于治血瘀经闭，风湿痹痛，跌打损伤、淋浊带下、水火烫伤，疮痈肿毒，毒蛇咬伤、肺热咳嗽等疾
串
【发明内容】
[0003]发明解决的技术问题
发明要解决的技术问题为在众多的治疗动脉粥样硬化药物中选取一种高效、价格低廉、安全的中药。
[0004]发明采用的技术方案
选取中药材虎杖，使用从虎杖中提取的虎杖苷来制备治疗动脉粥样硬化药物。
[0005]发明的有益效果
现有的治疗动脉粥样硬化药物有他汀类、贝特类、烟酸类、不饱和脂肪酸、以及阿司匹林等，都具有明显的副作用用。如他汀类的消化系统反应、头昏、皮疹，阿司匹林的胃粘膜损伤、血小板和白细胞减少、消化道刺激和诱发哮喘等。本发明的虎杖苷通过提高机体SOD水平、降低氧化型的低密度脂蛋白的含量等作用机制有效地抑制动脉粥样硬化，具有高效安全的有益效果。
【专利附图】
【附图说明】
[0006]图1虎杖苷给药后小鼠体重的变化情况
图2虎杖苷给药后小鼠血清中高密度脂蛋白的变化状况
图3虎杖苷给药后小鼠血清中总胆固醇的变化状况
图4虎杖苷给药后小鼠血清中氧化型低密度脂蛋白变化状况
图5虎杖苷给药后小鼠血清中总自由基的变化状况
图6虎杖苷给药后小鼠血清中总抗氧化水平的变化状况
图7虎杖苷给药后小鼠冠状动脉(C A)和腹主动脉(A A)的病理改变状况
图8虎杖苷给药后小鼠外周血中Treg细胞比例的变化状况
图9虎杖苷给药后小鼠外周血中TH17细胞比例的变化状况
【具体实施方式】实施例
材料与方法1.1实验动物=ApoE (-/-)小鼠，32只，鼠龄8周龄，全雄，体重18-20g(品系C57BL/6J，购自美国Jackson实验室)，由南京大学模式实验动物中心提供。同遗传背景C57BL/6J小鼠12只，鼠龄8周龄 ，全雄，体重18-20g。动物生产许可证号:SCXK (苏)2002-0001。
[0007]药品及试剂:虎杖苷购买于中国药品生物制品定检所，胆固醇(成都科龙化工公司)，脂肪酸(市售猪油熬制)，LTB4酶联免疫试剂盒购自R&D公司，LTD4酶联免疫试剂盒购自BD公司。RT-PCR试剂盒购自宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa)。WesternBlot试剂盒购自碧云天生物技术研究所。伊红，苏木素染色购买自南京建成生物工程研究所。高密度脂蛋白检测试剂盒，氧化型低密度脂蛋白试剂盒，总胆固醇检测试剂盒购买自美国Mercodia公司。TH17, Treg流式检测试剂盒购买自美国eBioscience公司。总自由基检测试剂盒，SOD试剂盒购买自南京生兴生物科技有限公司。
[0008]主要设备ZEISS显微镜，Excelsion脱水机，Shandon包埋机，RM2235切片机，美国Thermo公司；电子天平，德国Sartorius公司；2400型PCR扩增仪，美国AppliedBiosystems 公司；
2实验方法
2.1高脂饲料配制方法高脂饲料配方为:1.25%胆固醇、15%猪油、83.75%普通饲料。饲料粉经充分混合后由由饲料厂加工而成颗粒饲料。
[0009]小鼠冠状动脉粥样硬化建立将32只ApoE (-/-)小鼠适应性喂养一周后给予高脂饲料，连续喂养12周。同时选取相同遗传背景的8周龄正常C57BL/6J小鼠12只，全雄，饲喂普通饲料，作为正常对照组。
[0010]给药方法和剂量将连续喂养12周的高脂饲料ApoE (-/-)小鼠解剖2只和2只饲喂普通饲料C57BL/6J小鼠取其腹主动脉做病理，看其是否已经形成动脉粥样硬化。将已经形成动脉粥样硬化ApoE (-/_)小鼠分为模型对照组，虎杖苷剂量组，阳性药(辛伐他汀)对照组，每组10只。阳性药(辛伐他汀)以0.05g/ / (kg ?(!)灌胃，虎杖苷含生药200mg / (kg*d)灌胃，空白对照组及模型对照组分别给予同体积的蒸馏水，共计4周。除正常对照组给予的正常饲料喂食；其余各组继续每天给予高脂饲料。16周后，小鼠在最有一次给药后禁食不禁水过夜，将每组小鼠经10%水合氯醛腹腔注射麻醉，心脏取全血用于酶联免疫测定。取冠状动脉根部0.3cm用于病理学分析，取其腹主动脉和颈部动脉用mRNA分析。
[0011]冠状动脉粥样硬化的病理检测将小鼠冠状动脉常规脱水后石蜡包埋，自冠状动脉横断面连续切片30张，每隔5张取I张进行HE染色，每只小鼠血管取6张连续切片的平均值进行分析。应用ZEISS显微镜观察切片并拍照后，用Image-J图像分析软件分析算出平均值进行分析，测量斑块面积(PA)、血管管腔面积(LA)，计算校正斑块面积(PA/LA)，并用百分比(%)表示。
[0012]及LTD4的ELISA检测将小鼠血液室温静置30 min，2000 r/min离心15 min后取血清。按试剂盒说明书进行检测，应用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值[D(450)].以[D(450)]作为横坐标，以标准品的浓度值作为纵坐标，从而绘制出标准曲线。在坐标上根据样品[D(450)]测出相应浓度值。
[0013]血脂测定将小鼠处死，心脏采集小鼠所有血液，一部分采取抗凝处理，一部分不采取抗凝处理。不抗凝部分，静置后离心，3000转，10分钟，提取上清，采用酶标法测定:血清总胆固醇，高密度脂蛋白，氧化型低密度脂蛋白的含量。测定方法完全遵从试剂盒的操作步骤,试剂盒采用Mercodia公司产品 。
[0014]流式检测如上所述处死小鼠，心脏采血，进行肝素抗凝处理，进行细胞计数，按照2X IO6个细胞/200ul体系进行处理和抗体标记，按照Treg和TH17试剂盒的步骤，进行血液中Treg和TH17比例的检测，试剂盒采用eBioscience公司产品。Treg采用⑶4+，⑶25+，F0XP3+的阳性细胞进行分群筛选，TH17细胞则通过⑶4+和IL-17+的阳性细胞进行分群筛选。
[0015]抗氧化水平检测如上所述处死小鼠，心脏采血，不抗凝，静置后离心，3000转，10分钟，提取上清，采用酶标法测定:总自由基水平，SOD抗氧化水平。按试剂盒说明书进行检测，应用酶标仪在450nm波长下测定吸光度值[D (450)].以[D (450)]作为横坐标，以标准品的浓度值作为纵坐标，从而绘制出标准曲线。在坐标上根据样品[D(450)]测出相应浓度值。
[0016]统计学方法数据以
表示，应用t检验进行组间差异性分析，应用Pearson相关分析进行血清LTB4及LTD4水平与动脉粥样硬化斑块相对面积的相关性分析，由SPSS 17.0统计软件完成。
[0017]结果
3.1虎杖苷给药后小鼠体重的变化情况
如图可以看出，模型组小鼠平均体重较其他组别小鼠呈现出升高的态势，显示出经高脂喂养后，可以明显的增加APOE-/-小鼠的体重。经过虎杖苷及阳性药物治疗后，均可以降低小鼠的平均体重，其中显示出药物的低剂量组体重降低尤为明显，其他组别小鼠的体重均在32g左右，没有统计学上的显著性差异。
[0018]3.2虎杖苷给药后小鼠血清中高密度脂蛋白的变化状况
如图分析，经过我们的统计分析，经过虎杖苷药物治疗后，血液中的高密度脂蛋白的含量较模型组出现约12%的升高，阳性药物组均出现不同程度的升高，显示出药物治疗具有一定的作用(P〈0.5)，可以提升血液中高密度脂蛋白的含量进而达到对血管的保护作用。
[0019]3.3虎杖苷给药后小鼠血清中总胆固醇的变化状况
如图分析，经过我们的统计分析，总胆固醇在各组统计中没有出现统计学上的差异，显示出药物可能不能直接降低血液中的总胆固醇含量。
[0020]虎杖苷给药后小鼠血清中氧化型低密度脂蛋白变化状况
氧化型的低密度脂蛋白的含量显示出被氧化的脂质的含量，它是脂质过氧化的指标，是动脉粥样硬化发病严重程度的指标之一。如图，我们可以看到经过药物治疗后，虎杖苷组出现脂质过氧化的水平明显的下降(P〈0.5)，显示出虎杖苷的抗氧化特性，虎杖苷在治疗动脉粥样硬化中，效果较模型组下降幅度较大，显示出虎杖苷具有较好的抗氧化效果，防治脂质的过度氧化进而达到对动脉粥样硬化的防治。
[0021]3.5虎杖苷给药后小鼠血清中总自由基的变化状况
如图所示，较正常对照组相比，经过高脂饲养的各组小鼠的血清中自由基的水平都比较高，经过虎杖苷治疗后，血液中的自由基水平出现一定的下降，其中虎杖苷药物治疗组下降幅度最大，大约下降30%左右(p〈0.5)。而阳性药物组自由基水平较模型组没有明显的下降，提示阳性药物不能显著的降低血液中的自由基水平。[0022]虎杖苷给药后小鼠血清中总抗氧化水平的变化状况
如图所示，我们检测了血液中的SOD水平，经过分析发现，而经过虎杖苷治疗后，血液中的SOD水平大幅度升高，显示出虎杖苷具有较好的的抗氧化效果(p〈0.5)。而阳性药物组和模型组相比，没有显著性差异，提示阳性药并非通过抗氧化途径来发挥药物的作用。
[0023]虎杖苷给药后小鼠冠状动脉(C A)和腹主动脉(A A)的病理改变状况 如图所示，在冠状动脉H&E染色中，可以很明显的看到模型组的血管中出现了大量的脂质沉积，并且形成结晶，血管壁增厚，并出现大量的炎症细胞的浸润，发病严重。而经过虎杖苷用药治疗后，粥样斑块面积呈现出缩小的趋势，并且随着剂量的增加，粥样斑块的面积逐渐缩小。阳性药泼尼松是公认的降脂药物，经过给药治疗后，我们发现尽管在血管中出现了脂质的结晶，但是血管依旧畅通，显示出泼尼松具有一定的治疗作用。经过虎杖苷给药治疗后，粥样斑块面积显著缩小，尽管斑块尚未完全消失，但是没有出现结晶，显示出虎杖苷作为抗氧化药物具有较好的治疗作用，并且经过虎杖苷给药治疗后，血管壁光滑，增生减缓，炎症细胞的浸润较轻。
[0024]虎杖苷给药后小鼠外周血中Treg细胞比例的变化状况
如图所示，经过流式细胞计数对Treg细胞的分析可以看出，虎杖苷药物治疗组与模型组相比，没有显著性差异，显示出虎杖苷没有明显的提升Treg细胞比例的作用。
[0025]虎杖苷给药后小鼠外周血中TH17细胞比例的变化状况
如图所示，经过流式细胞计数对TH17细胞的分析可以看出，虎杖苷组，阳性药物治疗组均较正常对照组相比均无显著性差异(P>0.05)，推测虎杖苷不能影响机体的TH17细胞水平。
[0026]讨论
我国是心脑血管病高发国。每年死于心脑血管病的患者达300余万人，已占我国每年总死亡人数的50%以上。1996年2006年间，我国急性冠心病发病率以男性年均2.3%，女性年均1.6%的速度递增，其中男性45岁年龄组急性冠心病增加了 50%，35岁年龄组急性脑卒中男女发病率则分别增加了 136%和220%。动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是缺血性心脑血管病共同的发病基础。积极进行防治AS，是减少心、脑、肾和外周血管等靶器官损害的重要方法。
[0027]人类对AS这一严重危害健康的疾病的研究已有一个半世纪，但是其确切的病因和发病机制至今仍未完全阐明。先后提出的致病假说，如“脂肪浸润学说”、“血小板聚集和血栓形成学说”、“平滑肌克隆学说”、“血管内皮损伤反应学说”等，这些学说相互联系、互相补充。其中，Ross在1993年提出的损伤一反应假说(response-to-1njury hypothesis)
[2]已被大多数学者所接受，1999Ross又在损伤反应学说基础上进一步提出了 “动脉粥样硬化是一种慢性炎症学说”。目前，动脉粥样硬化是一种慢性炎症反应已得到医学界的广泛认同，炎症反应机制是目前研究的热点。动脉粥样硬化的发病机制相当复杂，目前认为炎症反应是动脉硬化的关键性致病机制之一。研究认为，炎症可促进主动脉脂质的异常积聚，导致动脉粥样硬化形成。炎症反应促进了粥样斑块进展和不稳定斑块的形成与破裂，是导致心脑血管事件发生的重要原因。
[0028]近年来越来越多的研究表明，炎性及免疫反应在AS的发生和发展中起着不可忽视的作用。感染，免疫和炎症促进AS的发生和发展这一观点的提出为AS的防治提供了新思路。一部分心血管药物已经被证实能够调节炎性细胞或细胞因子网络，包括临床上常用的、血管紧张素转换酶抑制剂/血管紧张素II受体阻滞剂、B受体阻滞剂、他汀类药物等，因此，免疫干预有可能成为预防和治疗动脉粥样硬化相关性疾病的新靶标。
[0029]随着对动脉粥样硬化认识的加深，人们发现免疫反应具有两面性，既可促进也可延缓动脉粥样硬化及其并发症的发生。研究表明，免疫反应同时也有抗动脉粥样硬化作用，而且也成为当前免疫应答与AS关系的研究热点。CD4+CD25+调节性细胞(Treg细胞)的抗动脉粥样硬化作用。研究表明急性冠脉综合征患者的循环Tregs不仅数量减少而且功能下降。有证据表明Treg细胞抑制动脉粥样硬化是通过TGF — ^作用与抑制效应性T细胞来完成的。目前一般认为Treg细胞的作用机制有以下3种:①体外通过细胞间接触依赖机制发挥作用。Treg细胞可通CTLA-4、TGF-0及GITR等与靶细胞上的相应受体结合，并抑制靶细胞上IL-2Ra链的表达，降低靶细胞对IL-2的反应性从而抑制效应T细胞的增殖。②体内调节功能主要依靠抑制性细胞因子，如IL-1O、IL-4及TGF-P受机体免疫应答强度大小、调节位点(如细胞因子环境)不同等因素的影响，Treg细胞分泌的抑制性细胞因子在不同的疾病中呈现出不同的特性，作用机制更为复杂。③Treg细胞还可通过与抗原提呈细胞的作用来调节机体免疫。
[0030]虎杖苷是白藜芦醇(Resveratrol，Res)与葡萄糖结合的产物，它们均属于虎杖成分中的芪类化合物，即羟基二苯乙烯类化合物，化学名为3，4’，5—三羟基芪一 3 — B— D一葡萄糖苷(3,4，，5 — trihydrox.ystibene 一 3 一 p—mono—D—glucoside),结构有JI顷反式两种Mr390。鉴于分子中含有3个酚羟基，推测它可能是一种氧自由基清除剂，通过抗氧化效应而实现其保护作用。目前，虎杖苷先后在葡萄科(爬山虎属、山葡萄属、蛇葡萄属)、百合科(藜芦属、菝葜属)、寥科(寥属、大黄属)、豆科(槐属、花生属、决明属、三叶草属、羊蹄甲属、冬青属)、姚金娘科(桉属)等12科31属72种植物中发现 本实验通过高脂饮食饲养ApoE-/-基因敲除小鼠建立动脉粥样硬化模型，模型组小鼠平均体重较其他组别小鼠呈现出升高的态势，显示出经高脂喂养后，可以明显的增加APOE-/-小鼠的体重。经过虎杖苷及阳性药物治疗后，均可以降低小鼠的平均体重，其中显示出药物的低剂量组体重降低尤为明显，其他组别小鼠的体重均在32g左右，没有统计学上的显著性差异。
[0031]经过虎杖苷药物治疗后，血液中的高密度脂蛋白的含量较模型组出现约12%的升高，阳性药物组均出现不同程度的升高，显示出药物治疗具有一定的作用，可以提升血液中高密度脂蛋白的含量进而达到对血管的保护作用。总胆固醇在各组统计中没有出现统计学上的差异，显示出药物可能不能直接降低血液中的总胆固醇含量。
[0032]氧化型的低密度脂蛋白的含量显示出被氧化的脂质的含量，它是脂质过氧化的指标，是动脉粥样硬化发病严重程度的指标之一。如图，我们可以看到经过药物治疗后，虎杖苷组出现脂质过氧化的水平明显的下降，显示出虎杖苷的抗氧化特性，虎杖苷在治疗动脉粥样硬化中，效果较模型组下降幅度较大，显示出虎杖苷具有较好的抗氧化效果，防治脂质的过度氧化进而达到对动脉粥样硬化的防治。
[0033]正常对照组相比，经过高脂饲养的各组小鼠的血清中自由基的水平都比较高，经过虎杖苷治疗后，血液中的自由基水平出现一定的下降，其中虎杖苷药物治疗组下降幅度最大，大约下降30%左右。而阳性药物组自由基水平较模型组没有明显的下降，提示阳性药物不能显著的降低血液中的自由基水平。
[0034]我们检测了血液中的SOD水平，经过分析发现，而经过虎杖苷治疗后，血液中的SOD水平大幅度升高，显示出虎杖苷具有较好的的抗氧化效果。而阳性药物组和模型组相比，没有显著性差异，提示阳性药并非通过抗氧化途径来发挥药物的作用。
[0035]在冠状动脉H&E染色中，可以很明显的看到模型组的血管中出现了大量的脂质沉积，并且形成结晶，血管壁增厚，并出现大量的炎症细胞的浸润，发病严重。而经过虎杖苷用药治疗后，粥样斑块面积呈现出缩小的趋势，并且随着剂量的增加，粥样斑块的面积逐渐缩小。阳性药泼尼松是公认的降脂药物，经过给药治疗后，我们发现尽管在血管中出现了脂质的结晶，但是血管依旧畅通，显示出泼尼松具有一定的治疗作用。经过虎杖苷给药治疗后，粥样斑块面积显著缩小，尽管斑块尚未完全消失，但是没有出现结晶，显示出虎杖苷作为抗氧化药物具有较好的治疗作用，并且经过虎杖苷给药治疗后，血管壁光滑，增生减缓，炎症细胞的浸润较轻。
[0036]经过流式细胞计数对Treg细胞的分析可以看出，虎杖苷药物治疗组与模型组相t匕，没有显著性差异，显示出虎杖苷没有明显的提升Treg细胞比例的作用。
[0037]经过流式细胞计数对TH17细胞的分析可以看出，虎杖苷组，阳性药物治疗组均较正常对照组相比均无显著性差异，推测虎杖苷不能影响机体的TH17细胞水平。
[0038]本实验采用虎杖苷对通过高脂饮食饲养ApoE-/-基因敲除小鼠建立动脉粥样硬化模型，来检测血清中高密度脂蛋白，氧化型的低密度脂蛋白，总胆固醇的含量；同时检测血清中总自由基水平，血清中总抗氧化水平。同时检测血液中Treg细胞，TH17细胞的变化水平，分析Treg细胞，TH17细胞在动脉粥样硬化中的作用。同时采用H&E染色对腹主动脉和冠状动脉进行染色，分析动脉粥样斑块的大小及血管的增厚状况，分析虎杖苷在动脉粥样硬化发生发展中的作用。`
【权利要求】
1.中药材虎杖的提取物虎杖苷在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。
【文档编号】A61K31/7034GK103638035SQ201310551556
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年11月8日 优先权日:2013年11月8日
【发明者】曹鹏, 胡春萍, 王大为, 庞中化 申请人:江苏省中医药研究院