一种低刺激性多肽和寡肽的制备和在化妆品领域的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种酶解基因重组胶原蛋白制备寡肽的方法。本方法是利用二步酶解胶原蛋白，即碱性蛋白酶和中性蛋白酶先后连续水解胶原蛋白，反应后5000-8000rpm冷冻离心15-30min，再用截留分子量为5KDa、4KDa、3KDa、2KDa、1KDa逐级进行分离纯化，之后再通过截留分子量为500Da的纳滤膜，得到分子量更小的寡肽。得到的寡肽经透皮吸收，促使人体真皮层胶原蛋白的合成，因其来源是基因重组人胶原蛋白，主要功能结构与人胶原蛋白非常接近，在抚平皱纹，改善肌肤弹性的同时，可最大程度的降低其对人体的敏感性和刺激性，使其更安全，可广泛应用于化妆品领域。
【专利说明】一种低刺激性多肽和寡肽的制备和在化妆品领域的应用
【技术领域】[0001]本发明属于生物酶催化领域。具体为利用酶催化水解基因重组胶原蛋白，发明了一种两种酶分步连续催化水解基因重组胶原蛋白制备小分子肽的方法。
【背景技术】
[0002]胶原蛋白是存在于动物结缔组织中的主要成分，是动物体内含量最多的蛋白质，在动物的皮肤组织、骨骼等部位含量丰富。当今市场上，胶原蛋白的来源主要有鱼源胶原蛋白，包括鱼皮和鱼鳞的；猪皮来源的，微生物来源的，还有基因工程菌来源的。胶原蛋白小分子肽是胶原蛋白水解后的产物，具有较高的消化吸收性，对促进皮肤组织真皮层胶原蛋白的合成作用显著，对祛除皮肤皱纹，改善皮肤弹性效果明显。近年来，国内外的诸多研究表明，胶原蛋白小分子肽除了具有很高的营养特性外，依其结构、分子量及氨基酸种类的不同还具有一些特殊的生理功能，如保护胃黏膜和抗溃疡作用，抗过敏作用，抑制血压上升作用，促进骨骼形成、促进皮肤胶原新陈代谢等作用。除此之外，胶原蛋白小分子肽还有良好的加工特性和保湿性。故在制药行业、食品行业、保健品行业、生物医疗器械行业、化妆品行业有着广阔的应用空间。胶原蛋白多肽和寡肽应用在化妆品中有如下功效:
[0003](I)保湿，胶原蛋白多肽及寡肽链中含有大量的亲水基团(氨基、羟基、羧基等)，处于分子立体结构的表面，能吸收大量的水分，在皮肤表面形成皮膜，对皮肤具有良好的保湿性，而且其保湿作用不受环境(温度、湿度等)变化的影响。
[0004](2)营养，皮肤的渗透性强，可透过角质层与皮肤上皮细胞结合，参与和改善皮肤细胞的代谢，使皮肤中的胶原蛋白活性加强，保持角质层水分及纤维结构的完整性，改善皮肤细胞生存环境和促进皮肤组织的新陈代谢，增强血液循环，达到滋润皮肤的目的。
[0005](3)抗衰除皱，胶原蛋白寡肽可直接渗透到肌肤真皮中补充流失的胶原质，重整肌肤纤维组织结构，促进细胞新陈代谢，延缓细胞衰老。
[0006](4)美白，胶原蛋白多肽可抑制酪氨酸酶的活性，减少黑色素的生成，在美白肌肤、修复嫩肤等方面有很好的效果。
[0007](5)修复，直接渗入肌肤底层，可协助细胞制造胶原蛋白的成胶原细胞，促使皮肤细胞正常成长，还具有消炎和更新肌肤的作用。
[0008](6)抗刺激，基因重组胶原蛋白寡肽与皮肤具有良好的相容性，增强皮肤的抗刺激能力。
[0009]目前，国内胶原蛋白小分子肽来源主要是鱼皮、鱼鳞、猪皮等，由于鱼源、猪皮、微生物来源的胶原蛋白基因结构与人的胶原蛋白基因结构相差较大，故利用以上来源的胶原蛋白制备的小分子肽在氨基酸数量、排列顺序及结构上存在差异，在应用于人体的过程中较易引起过敏或不适反应，对人体的刺激性较大。因此，基因重组胶原蛋白作为胶原蛋白小分子肽的蛋白来源在根源上解决了这个问题。
[0010]国内外制备胶原蛋白小分子肽主要采用酶法，酶法反应条件温和，生产成本较低。酶法应用较多的有单酶水解、复合酶水解等,单酶水解存在水解率低,水解效果不好,分离提取困难等不利因素；复合酶水解存在水解效率较低，反应条件不能兼顾等缺点。在生产工艺上存在如下缺点:(I)酶解前处理工艺繁琐，如常需要碱液浸泡等；(2)能耗大，环境污染严重，产物提纯难；(3)采用水/有机溶剂双相催化体系的工艺中常会有有机溶剂残留，影响产品质量。因此，研究开发基因重组胶原蛋白小分子肽的制备新工艺，对胶原蛋白小分子肽在医药、保健、食品、化妆品等各行业广泛应用具有十分重要的现实意义。
【发明内容】
[0011]本发明是为了解决上述现有工艺中存在的不足和技术上的缺陷，开发出一种工艺简单、水解效率高、生产成本低、环保、产物易分离，二步连续酶水解制备胶原蛋白小分子肽的新工艺；同时由于利用基因重组胶原蛋白来水解制备小分子肽，解决了由于鱼皮、鱼鳞、猪皮等来源的胶原蛋白小分子肽较易引起的人体不适的问题。
[0012]一种二步水解基因重组胶原蛋白制备小分子肽的方法:将基因重组胶原蛋白溶解于生理盐水中，使其质量分数为2% -10%、最佳5% _8%，采用两步连续水解的方法。充分搅拌溶解后，置于50-60°C，最佳55 1:的水浴中，搅拌状态下，用lmol/L的氢氧化钠调节pH值至9.5-10.5、最佳10.0，按3000-8000U/g、最佳5000 U/g的添加量加入碱性蛋白酶，常压下恒温搅拌反应3-6h、最佳4h，搅拌桨采用具有呈45°角固定平面桨叶的斜叶搅拌桨，剪切力较低且可实现底物和酶充分混合，搅拌转速控制在50-200rpm，第一步反应后pH值维持在6.5-8.0之间。
[0013]将第一步反应液置于85°C -95°C水浴中，搅拌保温5-10min灭酶。再将其置于45-55°C、最佳50°C的水浴中，搅拌状态下(搅拌桨和转速同上)用0.lmol/L氢氧化钠或
0.lmol/L的盐酸微调pH值至7.0-8.0、最佳7.5，按2000_5000U/g、最佳3000 U/g的添加量加入中性蛋白酶，常压下恒温搅拌反应2-4h、最佳2h。反应完成后置于85°C _95°C水浴中，搅拌保温5-10min灭酶。
`[0014]反应物经过5000-8000rpm冷冻离心15_30min，去除未反应的基因重组胶原蛋白和酶蛋白，所得的上清液用不同截留分子量的超滤膜和纳滤膜进行浓缩、分离，可得到不同分子量的基因重组胶原蛋白小分子肽。
[0015]将上清液通过截留分子量为5KDa的超滤膜，进出口压差不超过0.3MPa，循环过滤，收集未透过液，真空冷冻干燥得到分子量大于5KDa的多肽；透过液收集后以同样的压差通过截留分子量为4KDa的超滤膜，循环过滤，收集未透过液，真空冷冻干燥得到4KDa<分子量< 5KDa的多肽，依次即可得到3KDa <分子量< 4KDa、2KDa <分子量< 3KDa、lKDa<分子量< 2KDa的多肽。超滤后的透过液再进行纳滤，截留分子量500Da，即可得到分子量500 Da-1K Da 的寡肽。
[0016]与现有技术相比较，本发明具有以下优点:
[0017](I)采用二步连续水解法，第一步水解之后，立即进行第二步水解，每一步水解都可满足酶反应的最适条件，使得酶与底物充分反应，水解效果大大提高。
[0018](2)比现有的工艺所用的水解时间大大缩短，节能降耗，降低单位生产成本，使产品更具市场竞争力。
[0019](3)由于胶原蛋白是基因重组胶原蛋白，与人胶原蛋白无限接近，所以水解所得的小分子肽更适合人类使用，最大限度的避免了过敏、刺激和不适症状。[0020](4)寡肽的分离和纯化是用物理方法-超滤和纳滤，分离效果好，效率高，操作简单，可完全自动化，更重要的是对产品没有任何的损害，更不会有化学试剂的残留，不影响产品质量，进一步降低了引起刺激性的可能性。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1是基因重组胶原蛋白二步酶解制备小分子肽工艺流程图。
【具体实施方式】
下面结合图1通过实施例进一步作出说明。
[0022]实施例:
[0023]准确称量8.0Og基因重组胶原蛋白并将其溶解于装有92g生理盐水的容器中，置于50-60°C、最佳55°C的水浴中，开启搅拌至100-250rpm，用滴管滴加lmol/L的氢氧化钠，通过pH计检测pH值为9.50-10.50 ;称取2.5g碱性蛋白酶(标示活力200000U/g)，加生理盐水至25g配制成10%的酶溶液，然后将25g、10%的酶溶液加入蛋白溶液中，使反应体系中酶浓度达到3000-8000U/g、最佳5000 U/g，恒温搅拌状态下反应4h。反应后，立即放入85-950C的水浴中，恒温保持5-10min，灭酶。
[0024]待温度降至45-55°C时，将其放入50°C的水浴中，用pH计检测体系pH值，若pH值超出中性蛋白酶最适范围，则在搅拌状态下，用0.lmol/L氢氧化钠或0.lmol/L的盐酸微调pH值至7.00-8.00 ;称取1.5g中性蛋白酶(标示活力200000U/g)，加生理盐水至15g配制成10%的酶溶液，然后将15g、10%的酶溶液加入反应体系中，使反应体系中酶浓度达到3000U/g,恒温搅拌 状态下反应3h。反应后，立即放入85-95°C的水浴中，恒温保持5_10min，灭酶。
[0025]5000-8000rpm 冷冻离心 15_30min,取上清。
[0026]准备超滤膜和纳滤膜，滤膜要用专用膜清洗剂循环清洗至少40_60min，之后消毒。开始过膜，将上清液通过截留分子量为5KDa的超滤膜，排除超滤体系内的空气，保持进出口压差在0.10-0.3MPa之间，循环过滤，收集截留液，真空冷冻干燥后即可得到该级多肽，透过液进入下一级超滤；再依序将透过液通过截留分子量为4KDa、3KDa、2KDa、lKDa的超滤膜，每一级循环过滤，分别收集截留液，真空冷冻干燥后得到各级多肽和寡肽；最后将透过液通过截留分子量为500 Da纳滤膜，收集截留液即可得到分子量为500Da-1000Da的胶原蛋白寡肽。
【权利要求】
1.一种酶解基因重组胶原蛋白制备低刺激性多肽和寡肽的方法，其特征是:将基因重组胶原蛋白溶解于生理盐水中，使其质量分数为2% -10% ;采用连续两步水解的方法，加酶前先用生理盐水将其配制成10% -20%的酶溶液。先用碱性蛋白酶进行水解,水解后850C -95°C保温5-10min进行灭酶，再用中性蛋白酶进行水解，水解后再次灭酶，冷却后，经离心、超滤、纳滤得到各级分子量的小分子肽。
2.如权利要求1所述，其特征为作为水解底物的胶原蛋白为基因重组胶原蛋白。
3.如权利要求1所述，其特征为所用的碱性蛋白酶和中性蛋白酶均为微生物来源的生物酶。
4.如权利要求1所述，碱性蛋白酶水解基因重组胶原蛋白的最佳反应条件组合是:底物浓度为2% -10%、最佳5% _8%，酶添加量为3000-8000U/g、最佳5000U/g，pH值为9.5-10.5、最佳10.0，温度为50-60°C、最佳55°C，反应时间为3_6h，最佳4h。
5.如权利要求1所述，中性蛋白酶水解基因重组胶原蛋白的最佳反应条件组合是:底物浓度为2% -10%、最佳5% _8%，酶添加量为2000-5000U/g、最佳3000U/g，pH值为7-8、最佳7.5，温度为45-55°C、最佳50°C，反应时间为2_4h、最佳3h。
6.如权利要求1所述，碱性蛋白酶和中性蛋白酶在加入酶底反应体系前要用生理盐水将其配制为I 0% -20%的酶溶液，以便于和底物较快充分混合，提高反应速率。
7.如权利要求1所述，胶原蛋白水解液经冷冻离心后，首先将上清液通过截留分子量为5KDa的超滤膜，分子量大于5KDa的多肽被截留，收集；再将透过液通过截留分子量为4KDa的超滤膜，4KDa <分子量< 5KDa的多肽被截留，收集；再将透过液通过截留分子量为3KDa的超滤膜，3KDa <分子量< 4KDa的多肽被截留，收集；依次将透过液通过截留分子量为2KDa、lKDa的超滤膜，分别得到2KDa <分子量< 3KDa和IKDa <分子量< 2KDa的寡肽。
8.如权利要求1所述，胶原蛋白肽经超滤后，分子量都小于lKDa，用纳滤继续分离纯化。将最后一级超滤透过液通过截留分子量为500Da的纳滤膜，分子量在500Da-lKDa的寡肽不能透过，收集；分子量低于500Da的氨基酸、盐类等其他小分子类物质均透过。
【文档编号】A61K8/65GK103695514SQ201310562913
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年11月14日 优先权日:2013年11月14日
【发明者】李想, 唐兴宇, 张卫红, 潘美玲 申请人:陕西东大生化科技有限责任公司