基于半氟化烷烃的稳定蛋白质组合物的制作方法
【专利摘要】本发明提供了具有改善的稳定性和保质期的生物活性多肽和蛋白质的新的组合物。该组合物是基于选自半氟化烷烃的液体赋形剂。这些赋形剂对保护多肽和蛋白质免受降解和/或聚合的影响显著有效。该组合物对例如给药到眼睛中、或通过例如经由皮下或肌内途径等肠外注射的局部给药是有用的。
【专利说明】基于半氟化烷烃的稳定蛋白质组合物
【技术领域】
[0001] 本发明属于肽和蛋白质组合物的领域，特别是对治疗或诊断用途有用的作为多肽 或蛋白质的药物制剂的组合物。
【背景技术】
[0002] 由于生物【技术领域】中已经出现的许多新进步和新进展的缘故，最近几年已经出现 了将不可治疗的疾病或疑难杂症作为目标的基于肽和蛋白质的新类型的治疗性的生物药 剂学。
[0003] 然而，由于它们的口服生物利用度低和在体内的总的半衰期短，许多迄今开发的 蛋白质和多肽疗法的给药方法已主要被限制在肠外途径。目前获准的人类单克隆抗体（快 速发展的靶向治疗剂类）都需要通过注射给药。例如，首先标明用于治疗类风湿性关节炎 的人类单克隆抗体阿达木单抗（Humira?，由Abbott销售）存在于预填充注射器中。只有 少数口服、粘膜或吸入治疗性组合物是目前市售的，其中许多仅包含相对较低分子量的多 肽制剂。通过吸入途径给药的较高分子量的蛋白质治疗剂的一个例子是标明为治疗囊肿性 纤维化的重组人类脱氧核糖核酸酶I的溶液阿法链道酶（Pulmozyme?，由Roche分销）。
[0004] 蛋白质和多肽的绝对分子大小和复杂性，以及它们的通过破坏它们的结构完整性 相对容易损失的活性，对加工、配制和输送这些类型的治疗剂提出了挑战。
[0005] 蛋白质的生物活性是由其独一无二的三维结构；其二级结构和三级结构决定。围 绕蛋白质的肽链成分之间的诸如氢键、静电作用、范德华力、疏水作用，以及共价键等内部 相互作用的特定的和平衡的组合导致了天然状态的折叠的蛋白质的最终结构。这些相互作 用的边际变化可以潜在地对蛋白质的结构完整性有很大的影响。蛋白质的精确的生物功能 是基于其与其它相关的大分子和/或小分子的特异性相互作用。因此，如果以任何方式破 坏必要的三维特征，则蛋白质将失去特异性并因此失去治疗效果。
[0006] 可以通过许多降解途径使天然蛋白质的结构发生损伤。可以通过诸如天然蛋白 质单体的自缔合、或部分未折叠的蛋白质缔合成非天然寡聚体之类的非共价键合作用发生 聚合。也可以通过诸如交联二硫键的形成和/或交换、肽键水解、脱酰胺、或氧化之类的共 价的、不可逆的化学作用发生蛋白质的变质和聚合。这些现象的发生率不仅取决于蛋白质 的固有特征，还取决于诸如包括类似冻融周期的相关的应力条件的温度、pH、蛋白质浓度、 离子强度、去稳定的化学添加剂的存在、诸如空穴作用或切应力之类的干燥和机械应力因 素等一些物理化学环境条件，所有这些因素都可以对天然折叠结构的蛋白质产生不利的影 响。
[0007] 蛋白质缔合成这种的通常是高分子量形式的寡聚体，给蛋白质或多肽疗法制剂 (therapeutics)的制备、运输和长期储存方面造成了严重问题。聚合可能导致活性蛋白质 药物的损失，从而导致不可靠的和无效的配药。在液体制剂中，可能是不溶性的聚合体可以 沉淀并形成可阻碍流动的大颗粒，这将对肠外施用极为不利。此外，蛋白质聚合体可以表现 出毒性并能触发不希望有的免疫原性反应（Rosenberg, A. S.，AAPS J，2006, 8, E501)。因此， 选择用于蛋白质或多肽的液体制剂的介质的特性可对制剂的实用性和寿命产生重大影响。
[0008] 已知水性环境在大多数情况下对蛋白质的结构和生物活性的维持是重要的，即水 分子可以是折叠所必不可少的或者甚至是折叠的驱动力和/或可以在酶的活性中发挥直 接作用。另一方面，取决于水相的组合物的性质以及诸如pH和离子强度之类的各种参数， 水性介质也可能有不良作用。水可以充当增塑剂或者可以用作反应介质以及可以例如在酰 胺键水解断裂中直接作为反应成分。因此，在制定蛋白质疗法制剂的领域中已广泛使用的 方法是将蛋白质冷冻干燥（冻-干）或喷雾干燥成固态粉末的形式。在这种情况下，水的 去除限制了蛋白质大分子与其它物质相互作用的构象的灵活性和扩散的移动性，从而减少 聚合的可能性。因此，与许多水基制剂相比，干燥状态下的蛋白质的较长期储存基本上是可 行的。
[0009] 然而，应该指出的是，在冷冻干燥过程本身期间可能很容易发生蛋白质的降解和 聚合，并因此为了减少这些作用的发生率，用于开发冷冻干燥过程的时间投入和成本必然 很高。也经常添加用作补偿水的氢键合作用的损失的诸如糖类、多元醇等的附加的稳定剂 到预冷冻干燥组合物中。尽管这样的赋形剂在冷冻干燥过程中是有用的，但是在干燥状态 下随着时间的推移例如经由结晶通过相分离可能对蛋白质的稳定性是有害的。为了得到蛋 白质的较长的保质期，也可以根据需要包括其它的冷冻干燥后的稳定赋形剂，从而增加必 定要存在于最终制剂中的组分的数量。
[0010] 另外，尽管除去了水，但是干燥状态下的蛋白质组合物也不能避免例如温度、以及 诸如脱酰胺或氧化反应之类的其中水不是关键试剂的化学降解反应等外部环境因素的影 响。温度升高导致流动性增加并且因此有较大的可能性发生蛋白质内部的反应，因此许多 经冷冻干燥的蛋白质仍然需要始终在冷藏条件下储存。另外，为使制剂的pH和等渗更适合 于冷冻干燥过程而添加的赋形剂可以不是作为最终干燥状态的蛋白质的稳定剂。水分的 引入可能会是一个问题，而且还必须特别注意干燥固体状态的蛋白质的储存装置（以及材 料）。
[0011] 此外，之前，水性介质中的经冷冻干燥的蛋白质的重组作为实际施用之前的额外 的步骤是必要的，并且有不当处理/剂量和污染的风险。如果水性介质的pH值、或温度不 是最佳的或者适当的再水合的时间太短，则重组步骤本身可能触发蛋白质聚合。因此，也可 能需要考虑和适当地研发合适的重组介质的配方。总体而言，从经济角度来看，与液体制剂 相比，经冷冻干燥的蛋白质的工艺和配方研发涉及大量的时间、精力和成本（Wang, W.，Int. J. Pharm. , 2000, 203, 1) 〇
[0012] 制定蛋白质疗法制剂的另一种选择是使用有机溶剂作为载体介质。然而，应当 注意的是，这些溶剂可能不总是对蛋白质的结构有稳定作用，在某些情况下，反而有相 反作用。例如，较高浓度的诸如DMS0或DMF等强极性溶剂和诸如甲醇或乙醇之类的醇 类通常通过与内酰胺氢键竞争可以充当变性剂，该竞争会导致三级结构的丧失；甚至可 以导致二级结构的比率改变，可能导致得到非天然结构（Stevenson, C. L.，Curr. Pharm. Biotech.，2000, 1，165)。因此，这些溶剂可能对蛋白质疗法制剂的长期贮存不理想。类似 地，这些类型的溶剂的生理耐受性可能较低，并且需要考虑有关蛋白质的释放和吸收（还 取决于其在这样的溶剂体系中的溶解性的状态）的其它因素。
[0013] 在水性介质中的溶液形式的蛋白质治疗制剂往往简单易得。另一方面，使用有机 溶剂的制剂需要进一步考虑，因为蛋白质在这样的介质中的总的非溶解性或部分溶解性， 具体取决于溶剂的极性和蛋白质的物理性质。疏水性的有机溶剂和无水的（经冷冻干燥 的）蛋白质的组合通常会产生分散体或悬浮体。在这种情况下，在制剂的研发期间，除了 蛋白质本身的长期稳定性之外，悬浮体的长期物理稳定性也是重要的考虑因素。虽然已 有报道为了肠外应用而使用诸如油和脂类之类的非极性溶剂作为蛋白质或多肽的悬浮载 体，但是这些载体在生理温度下在延长的时间期间的稳定性已受到质疑（Knepp，V. M. et al, Pharm. Res. 1998, 15, 1090)。此外，这些化合物可能会引起如注射部位疼痛之类的副作 用。此外，油和脂类往往强烈地使治疗剂的释放变缓。这可能是实现较长期的持续释放或 仓库型注射制剂的有用的特征，但如果期望得到更迅速和即时的生物利用性，则不是有用 的特征。
[0014] 已描述了基于聚合物的组合物，例如，已经报道包含作为聚合物成分的聚乙烯基 吡咯烷酮以及作为溶剂的乳酸月桂酯（或月桂醇）的适合与可植入装置结合使用的蛋白质 或肽试剂的粘性非水悬浮制剂（US7258869和EP1152749)。这样的组合物被认为适合于这 样的治疗剂的持续释放。
[0015] 全氟化合物也已被用作蛋白质、多肽和其它生物活性剂的非水的液体载体。例如， 在US6458376中描述了建议用于眼科应用（如局部应用的眼药水）的组合物，其中包括寡 肽和蛋白生长因子的治疗/诊断化合物悬浮于全氟化碳并且存在至少一种表面活性剂。然 而，它对能够适于在含有蛋白质或肽治疗化合物的组合物中使用的特定的表面活性剂的选 择的问题保持沉默，并且没有讨论随着时间的推移，这样的特定的化合物在这些制剂中的 长期的化学稳定性和物理稳定性。
[0016] EP0939655(和US6730328)公开了一些热稳定制剂，在这些热稳定制剂中，诸如矿 物油、全氟萘烷、甲氧氟烷（methoxyfluorane)、全氟三丁胺或十四烷之类的非水性的、疏水 性的、非反应性的赋形剂中用于含有蛋白质、蛋白质化合物与核酸的悬浮组合物。提出了这 些制剂的肠外给药方法、透皮给药方法、粘膜给药方法、口服给药方法和经肠给药方法，以 及提出了它们经由可植入装置长期连续给药和输送的用途。然而，没有公开在长时间之后 这些悬浮体组合物保持物理稳定的能力，即均匀地分散或再分散的能力。也尚未证实这些 类型的组合物的实际的组织兼容性。
[0017] US2010/0008996中提到作为输送活性物质到患者的肺膜/肺部区域的载体的 SFAs的吸入或滴注使用。更具体地说，该文献教导在SFAs中表现出的足够的溶解性以及 其具有1?0. lnm范围内的分子尺寸的活性物质的胶束胶体溶液，以便促进穿过肺膜运输 至血流。它公开了被描述为对吸入或滴注有用的小分子药物的基于SFA的组合物：布洛芬、 α -生育酚、视黄醇棕榈酸酯、5-氟尿嘧啶、溴己新、奥司他韦、和氨溴索。与此相反，它并 没有公开诸如蛋白质之类的为较大分子的活性物质的任何具体组合物，也没有公开不溶于 SFAs的活性物质的任何具体组合物。
[0018] W02011/073134类似地公开了包括环孢素（一种在半氟化烷烃中分子量为 1202.61的环状多肽）的任选地在诸如乙醇之类的共溶剂的存在下的溶液。同时也提到悬 浮体和乳液作为任选的替代物，但是没有具体公开这种类型的组合物。
[0019] Kociok等（Graefe，s Arch Clin Exp 0phthalmol2005, 243, 345-358)探讨了巨噬 细胞的穿过细胞膜附着物的活性是否可由一定水泡尺寸的乳化液滴填塞支撑。为此目的， 他们通过挤压半氟化烷烃使其穿过聚碳酸酯过滤膜进入PBS溶液中制备在水连续相中的 F6H8的乳化液滴（称为单层水泡）。为了确定人血清白蛋白（HSA)是否对血嗜中性粒细胞 的活化有影响，通过将HSA包含到水性的PBS溶液中使一些液滴包被有HSA。
[0020] 本发明的目的是引入克服与目前已知的制剂相关的局限性和缺点的新的蛋白质 或多肽组合物。
【发明内容】
[0021] 在第一方面中，本发明提供了在包含式RFRH的半氟化烷烃的液体赋形剂中的生 物活性多肽或蛋白质的新的组合物，其中RF是具有4至12个碳原子的直链全氟烃段，并且 其中RH是具有4至8个碳原子的直链烷基。
[0022] 生物活性多肽或蛋白质优选具有至少约l，500Da的分子量，特别是具有至少约 2000Da的分子量，并且被掺入到组合物中，以形成分散体或悬浮体。多肽或蛋白质优选是治 疗剂或诊断剂或疫苗。
[0023] 生物活性化合物优选是对降解和/或聚合敏感的多肽或蛋白质。本发明人已经发 现相比于其它有机溶剂，使用半氟化烷烃提供了诸如胰岛素之类的蛋白质的更稳定的分散 体或悬浮体。结合起来，也已确定，半氟化烷烃对这种化合物具有显著的稳定作用，并且诸 如胰岛素之类的敏感的蛋白质甚至可以经受显著升高的温度而不会通过聚合和/或降解 损失生物活性。
[0024] 特别有用的半氟化烷烃是选自根据如本文下面所定义的F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、 F6H6、F6H8和F6H10。这些半氟化烷烃有良好的组织耐受性，能够溶解在药物组合物中可能 需要的大范围的其它赋形剂，并且可能由于它们固有的两亲性而与多肽和蛋白质形成药学 有利的分散体或悬浮体。
[0025] 在一个方面中，本发明的蛋白质或多肽组合物在室温下，甚至在高温（例如，约 37°C，或生理温度）下是化学稳定和物理稳定的，因此保留了蛋白质或肽试剂的生物活性 以及有微不足道的治疗剂的聚合。在进一步的方面，本发明中的蛋白质或多肽悬浮体组合 物在高温（例如，约37°C，或生理温度）保存后也保持单分散和/或可以很容易再分散。
[0026] 此外，本发明提供了这种组合物的医疗用途以及稳定对降解和/或聚合敏感的多 肽或蛋白质的方法，该方法包括将多肽或蛋白质掺入包括如上所定义的半氟化烷烃的液体 赋形剂中。
【具体实施方式】
[0027] 在第一方面中，本发明提供了包含生物活性化合物和液体赋形剂的组合物。生物 活性化合物选自属于多肽和蛋白质的治疗剂或诊断剂或疫苗。优选地，多肽或蛋白质具有 至少约1，500Da的分子量，特别是具有至少约2000Da的分子量。液体赋形剂包括式RFRH 的半氟化烷烃，其中RF是具有4至12个碳原子的直链全氟烃段，并且其中RH是具有4至8 个碳原子的直链烷基。此外，将生物活性化合物掺入组合物中以形成分散体或悬浮体；即， 生物活性化合物分散或悬浮在液体赋形剂中。
[0028] 从医药角度来看，半氟化烷烃是非常有利的赋形剂：首先，它们基本上是无毒的， 艮P，各种类型的人体和动物组织在局部给药或注射后的良好的耐受性。其次，它们是化学惰 性的，并且没有表现出与药物制剂中活性成分或非活性成分之间的有害的相互作用。第三， 可能由于它们固有的两亲性的程度，它们能溶解大范围的化合物，例如小分子的活性成分 或许多常见的在药物制剂中有用的赋形剂。第四，当掺入不溶于或只是很少溶于半氟化烷 烃（如许多多肽和蛋白质）的化合物时，它们形成具有非常有用的物理或药学性质的分散 体或悬浮体，即，很少或往往不形成固体的、非分散的沉积物。
[0029] 本发明人发现，在半氟化烷烃中的蛋白质分散体和悬浮体令人惊奇地稳定。它们 保持良好的分散性和均匀性，并且如果发生浮动或沉积时，它通常会缓慢地发生，留下足够 的时间使患者或护理人员在摇晃容纳该制剂的容器（例如小瓶）之后撤回剂量。没有观察 到大的很难再分散的聚合体的形成，并且在浮动或沉积之后，通过轻轻摇晃很容易使蛋白 质颗粒再分散而无显著的损失，并且似乎在很大程度上保留其原始颗粒尺寸分布。
[0030] 与此形成鲜明对比的是诸如全氟化碳之类的其它化学惰性液体赋形剂，全氟化碳 在US5, 518, 731和US6, 458, 376中已被提议作为药物的赋形剂。本发明人已经发现，当诸如 全氟辛烷或全氟萘烷之类的全氟化合物或如辛烷等其它有机溶剂被用作液体赋形剂时，悬 浮体往往显著地更不稳定，即它们通过分散相的浮动或通过它的沉积非常迅速地分离，具 体取决于分散相与连续相的相对密度。这伴随着颗粒聚合体的快速形成，该颗粒聚合体可 能是致密的并且很难再分散。即使快速浮动或沉积没有使得精确和可重复的剂量给药变得 不可能，也会使得其非常具有挑战性。例如，如果可注射或眼用悬浮体在振摇后沉淀很快， 则满装容器（例如，小瓶）中的首次剂量给药在振摇时没有立即撤回的情况下将含有数量 比预期数量少的药物颗粒，除非保持容器倒置，这这种情况下，将分配数量比预期数量多的 药物颗粒。如果每单位体积撤回的药物剂量在开始时是低的，则当相同的容器几乎是空的 并且分配最后的剂量时，每单位体积撤回的药物剂量将会太高，并且反之亦然。
[0031 ] 此外，在全氟化载体或类似辛烷等其它有机溶剂中的蛋白质的大的和很难再分散 的聚合体的形成可能导致诸如那些用于皮下注射的细注射针头的堵塞。大颗粒有引起体内 不良反应的危险，特别是炎症性突起（inflammation processes)。
[0032] 还观察到，悬浮在全氟化合物或辛烷中的颗粒往往粘附到用于撤回剂量的玻璃小 瓶容器和/或针头注射器的壁上。这也将导致干扰剂量的精确。
[0033] 基于SFA的悬浮体的有利性质导致优秀的药品质量和性能特点。对患者和/或健 康护理提供者的便利水平大大提高。更重要的是，相比于其它类型的药物悬浮体，大大提高 了剂量给药的准确性（即给药的精度和再现性）。这将带来更可靠的治疗效果并且减少了 由过量给药带来的不良反应的风险。
[0034] 同时，半氟化烷烃对多肽和蛋白质有显著的稳定作用。它们基本上防止或抑制蛋 白质聚合并且显著地减少化学降解。事实上，已发现，一些敏感的蛋白质稳定到当掺入到半 氟化烷烃中时可以将它们暴露在诸如50°C的高温下而无生物活性的损失的程度。本发明的 主要优点是由用作液体赋形剂的半氟化烷烃存在于组合物中所带来的。半氟化烷烃是氢原 子的一些已被氟取代的直链或支链烷烃。在本发明中使用的半氟化烷烃（SFA's)中，存在 一个线性非氟化的烃段和一个线性全氟化烃段。因此，这些化合物遵循通式F (CF2) n (CH2) mH。根据本发明，η选自4至12的范围，以及m选自4至8的范围。
[0035] 经常用于SFA的命名法将全氟化烃段命名为RF并且将非氟化段命名为RH。替代 地，该化合物可以分别地被称为FnHm和FnHm，其中F表示全氟化烃段，Η表示非氟化段。再 次，m定义各个段的碳原子的数目。例如，F3H3用于全氟丙基丙烷。此外，这种类型的命名 法通常用于具有直链段的化合物。因此，除非另有说明，否则应当认为F3H3是指1-全氟丙 基丙烷，而不是指2-全氟丙基丙烷、1-全氟异丙基丙烷、2-全氟异丙基丙烷。
[0036] 在本发明的背景中有用的SFA也在EP-A965334、EP-A965329和EP-A2110126中有 描述，该文件的公开内容并入本文。
[0037] 优选的 SFA 特别包括化合物 F4H5、F4H6、F4H8、F6H4、F6H6、F6H8 和 F6H10。实施 本发明特别优选的是F4H5、F4H6、F6H6和F6H8。在另一个特别优选的实施方式中，本发明 的组合物包含F6H8。
[0038] 任选地，组合物可以包含一个以上的SFA。例如，为了实现诸如一定的密度或粘度 之类的特定的目标性能，组合SFA可能是有用的。如果使用SFA的混合物，则该混合物进一 步优选包含F4H5、F4H6、F6H4、F6H6、F6H8和F6H10中的至少一种，以及特别是包含F4H5、 F4H6、F6H6和F6H8中的一种。在另一个实施方式中，所述混合物包含选自F4H5、F4H6、F6H4、 F6H6、F6H8和F6H10中的至少两个成员，以及特别是选自F4H5、F6H6和F6H8中的至少两个 成员。
[0039] 液体SFA在化学上和生理上是惰性的、无色的和稳定的。它们通常的密度范围为 1. 1至1. 7g/cm3,以及它们的表面张力可以低至19mN/m。RFRH类型的SFA是不溶于水但也 有些两亲性，亲脂性的增加与非氟化段的尺寸增大相关联。
[0040] RFRH类型的液体SFA商业上用于展开和重新应用视网膜，用于作为玻璃体替代物 的长期填塞物（H.Meinert et al·，European Journal of Ophthalmology, Vol. 10(3)，ρρ· 189-197, 2000)，和用作玻璃体视网膜手术后残余硅油的洗出溶液。在实验上，它们也被用 作血液替代物（H. Meinert et al. , Biomaterials, Artificial Cells, and Immobilization Biotechnology, Vol. 21 (5)，pp. 583-95, 1993)。这些应用已经证实了 SFA为生理耐受性良 好的化合物。在另一方面，截至今日SFA没有被用作已批准的药品中的赋形剂。
[0041] 本发明的组合物包含选自多肽或蛋白质的生物活性化合物。多肽和蛋白质代表通 过肽键相互连接的氨基酸单元的聚合物。由于通常用于区分多肽和蛋白质的大小边界有些 随意，这些分子的两种表达方式（本发明的上下文中）不应被理解为相互排斥的：多肽也可 以称为蛋白质，反之亦然。通常，术语"多肽"仅指单个聚合物链，而表达方式"蛋白质"还 可以指通过非共价键彼此连接的两个或多个多肽链。优选地，根据本发明的生物活性化合 物应该具有至少约1，500Da的分子量，特别是具有至少约2000Da的分子量。
[0042] 如上面更详细描述的，多肽和蛋白质的生物活性不仅依赖于它们的主要化学结 构，即它们的氨基酸序列，而且还依赖于其二级和三级结构，也常常依赖于它们的四级结 构。通常，多肽或蛋白质对降解的敏感性还涉及到它的二级结构、三级结构或甚至四级结 构。将会从本发明获益的多肽和蛋白质都包括化学性质不稳定的化合物，如容易水解的化 合物，以及具有迅速失去其二级或更高的结构和/或变性的倾向的化合物。特别是，组合物 包含对降解和/或聚合敏感的多肽或蛋白质。
[0043] 这种敏感性通常意味着相应的化合物不能在常见的水性介质中被配制成液体制 剂（例如，准备通过注射使用），即使在掺入稳定赋形剂（例如缓冲剂等）的情况下也如此， 以及不能在正常条件下储存。因此，为了得到可接受的保质期（通常为至少2年），敏感的 化合物的药物制剂在储存期间或者必须被冷藏，或者它们必须以干燥形式提供，在使用前 从它们的干燥形式重新配制。特别是，"敏感"意味着相应的化合物当被配制在优化的水性 赋形剂中时，于正常条件下在少于1年的储存时间内就失去至少约5%的生物活性。
[0044] 在优选的实施方式中，多肽或蛋白质是治疗性或诊断性化合物或疫苗。如本文所 用，治疗性化合物是对防止疾病或病症、减轻疾病或病症的任何症状、改善任何疾病或病 症、推迟疾病或病症的发展或类似的情况有用的化合物。诊断性化合物是对确定生物体的 状态有用的或者对诊断疾病、病症、症状或患者的表型有用的。治疗性化合物必须对患者施 用，而诊断剂则根据具体情况可在体内或体外使用。为免生疑问，将治疗性化合物或诊断性 化合物并入治疗或诊断有效量的本发明的组合物中。
[0045] 本发明人还发现，半氟化烷烃对化学或生物活性的稳定效果是非常显著的，前提 为生物活性化合物是在这类治疗剂和诊断剂的分子大小的低至中档范围内的多肽或蛋白 质。在一个具体的实施方式中，生物活性剂的分子量范围为从约2, 000至约100, OOODa。在 进一步的实施方式中，该分子量范围为从约1，〇〇〇至约60, OOODa。在进一步的实施方式中， 该分子量范围分别为从约2, 000至约60, 000Da，或从约5, 000至约50, 000Da。另一方面， 使用诸如血清白蛋白（大约67kDa)，或甚至超过10万Da的蛋白质之类的相对大的分子大 小的多肽和蛋白质也容易获得分散体或悬浮体的物理稳定性和/或容易再分散的益处。在 另一个【具体实施方式】中，生物活性剂是单个结构域的蛋白质或两个结构域的蛋白质。这是 基于本发明人的发现，即半氟化烷烃的稳定效果在与这种仅有一个结构域的蛋白质或者有 两个结构域的蛋白质结合时也是非常显著的。如本文所用，蛋白质结构域是氨基酸序列的 部分，该部分形成能在某种程度上独立于蛋白质链的其余部分发展、发挥功能以及存在的 紧密的、三维的结构。然而，结构域在长度方面可能显著不同，在大多数情况下，它们包含的 氨基酸单体从约25个至约500个。
[0046] 任选地，生物活性剂可以是酶、激素、或生长因子或结构蛋白质。组合物可包括治 疗性荷尔蒙，其用于代替或补充患者体内缺乏的天然激素。组合物可以进一步任选地包括 一个以上的生物活性多肽或蛋白质。
[0047] 在进一步任选的实施方式中，生物活性剂可以是重组的蛋白质或者可以是来自天 然衍生的源的蛋白质或者是合成的肽。蛋白质还可以是天然和/或内源性蛋白质的蛋白质 缀合物或类似物。
[0048] 根据进一步的实施方式，组合物包括作为生物活性剂的胰岛素，特别是重组人胰 岛素。令人惊奇地发现，分散在半氟化烷烃中的胰岛素是极其稳定的，并且甚至当储存在例 如在约50°C之类的显著升高的温度时也不聚合。
[0049] 如所提到的，将多肽或蛋白质掺入组合物中以形成分散体或悬浮体。换句话说，多 肽或蛋白质分散或悬浮在液体载体中。在将蛋白质分散于液体载体中时是否悬浮液取决 于，例如，蛋白质的性质、蛋白质在载体中的浓度以及所选择的一种或多种SFA。
[0050] 如本文所用，可以将悬浮体定义为一种类型的分散体，即具有至少一个连续（或 连贯的）相和分散在连续相中的至少一个不连续（或内部的）相的系统。在悬浮体中，分 散相是固态。对实施本发明有用的悬浮体至少在生理温度下是液体，这意味着连续相是液 体。通常，悬浮体在室温下也是液体。除了悬浮体，术语分散体应理解为包括胶体系统，在 该胶体系统中，蛋白质和多肽均匀分散在液相中。在一些实施方式中，多肽或蛋白质也至少 部分是溶剂化的。
[0051] 在一个【具体实施方式】中，组合物仅仅包含生物活性多肽或蛋白质和一种或多种 SFAs，即该组合物由如上所定义的生物活性多肽或蛋白质和一种或多种SFAs组成。
[0052] 与现有技术中已知的一些其它的悬浮体相比，本发明的制剂的物理稳定性不需要 表面活性剂，或仅需要少量的表面活性剂。这是显著的优点，因为表面活性剂特别是当通 过皮下或肌内注射或通过滴注到眼睛中给药时具有相当大的刺激性和局部毒性。根据优 选的实施方式之一，本发明的组合物基本上不含表面活性剂。在另一个实施方式中，如果 掺入一种或一种以上的表面活性剂，则表面活性剂或各种表面活性剂的总量分别不超过 约10wt.-%，特别是不超过约5wt.-%，或者优选地不超过约2wt.-%。在进一步优选的 实施方式中，表面活性剂或各种表面活性剂的总量分别不超过约lwt.-%，或者不超过约 0.5wt.-%。在此背景下，本文描述的SFA尽管由于它们的包括以不同程度的亲脂性为特征 的氟化和非氟化的烷基（或亚烷基）基团的化学结构而具有两亲性，但是不应被理解为落 入表面活性剂的范围内。
[0053] 不存在或仅少量存在的表面活性剂包括非离子型、阳离子型、阴离子型和两性离 子型表面活性剂，如在各种类型的药物组合物中常用作赋形剂，例如用作润湿剂、乳化剂、 分散剂、增溶剂及类似物的表面活性剂。被认为潜在有用的表面活性剂的实施例包括四丁 酌醒，诸如 Pluronic F68LF 或 Lutrol F68、Pluronic L-G2LF 和 Pluronic L62D 之类的泊 洛沙姆，诸如聚山梨酯20和聚山梨酯80之类的聚山梨醇酯，聚氧乙烯蓖麻油衍生物，脱水 山梨醇酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、卵磷脂、纯化的或合成的磷脂、及其两种或多种的混合物。
[0054] 例如，为了改变该液体赋形剂的诸如粘度之类的性质，本发明的组合物可以任选 地包括非氟化的有机液体。这样的其它液体可以是选自甘油酯油、液体蜡、和液体石蜡的 油，或者是表现出高度生物相容性的有机溶剂，或者是一种以上的液体赋形剂的混合物。
[0055] 可以与一种或多种SFA结合使用的可能有用的油性赋形剂的实施例包括甘油三 酯油（即，大豆油、橄榄油、芝麻油、棉子油、蓖麻油、甜杏仁油）、矿物油（即，凡士林和液体 石蜡）、中链甘油三酯（MCT)、油脂肪酸、肉豆蘧酸异丙酯、油脂肪醇、山梨糖醇脂肪酸酯类、 油性蔗糖酯、或任何眼睛生理上耐受的其它油性物质。
[0056] 可能有用的有机溶剂的实施例包括甘油、丙二醇、聚乙二醇和乙醇。共溶剂的浓度 相对于SFA或SFA混合物的浓度应优选为低浓度。如果使用诸如乙醇之类的有机溶剂，则 可推荐保持乙醇的含量低于约5wt. 。更优选地，乙醇的含量为从约0. 1至约2wt. -%， 以及最优选不超过约lwt.-%。
[0057] 当然，组合物根据需要或效用可以包含另外的药物赋形剂。可能有用的赋形剂包 括酸、碱、抗氧化剂、稳定剂、增效剂、着色剂、增稠剂、和在特定的情况下需要的防腐剂。然 而，一般来说，本发明提供了配制微生物学上稳定的非水性组合物的方法。这是缘于SFA通 常不容易产生微生物污染的事实。因此，可以配制不含防腐剂的将要填充在多用容器中的 组合物。许多患者对不含防腐剂的组合物具有较好的耐受性，并且使最终产品的成本降低。
[0058] 本发明的液体悬浮体可以通过常规的方法来制备。原则上，包含活性成分的固体 颗粒可以分散在含有SFA的液态赋形剂中。替代地，在受控条件下通过添加（通常是有机 的）活性成分的溶液（以及，任选地，一种或多种固体赋形剂）到基于SFA的赋形剂中可以 使颗粒原位沉淀。
[0059] 可以在颗粒与液体赋形剂结合之前或者之后调整分散相的粒径。在优选的实施方 式之一中，提供了已经具有适当所选粒径的活性成分的颗粒。可以通过晶体工程直接从相 应的化合物的合成来获得具有这种所选粒径的粉末，或者在合成后使用诸如球磨机、锤磨 机、辊磨机、胶体磨、喷射磨或类似磨机之类的标准设备通过常规的研磨或制粉获得具有这 种所选粒径的粉末。如果制备悬浮体后将要减小粒径，则可以使用超声以及各种类型的匀 浆器，诸如胶体磨、高压均化器等。
[0060] 根据本发明的悬浮体的优秀的物理性质使得这些组合物对患者的眼睛、耳朵、鼻 子或肺部的局部给药或通过注射不经肠道的给药特别有用。优选的注射方式包括经皮、皮 下、肌内和局部注射。最优选的注射方式是皮下和肌肉给药途径。
[0061] 下面以本发明的一些主要方面说明的实施例将使进一步的实施方式变得明显。 实施例 实施例1 : α -胰凝乳蛋白酶原A的稳定
[0062] 从蛋白质的储备溶液制备30小瓶经冷冻干燥的α -胰凝乳蛋白酶原A(CHY)的等 分试样。向10个等分试样中的每一个加入2. 5mL磷酸钾缓冲液（PPB，50mM，pH8. 0)，向另 10个等份试样中的每一个加入2. 5mL F6H8。剩下的10小瓶作为对照。用氮气吹扫这些小 瓶，轻轻摇晃并于50°C下储存。在预定的间隔时间，取出这些小瓶，提取它们的内含物并通 过圆二色性和酶测定法进行分析。
[0063] 结果发现，储存在缓冲液中的样品的酶活性在1天的储存时间过后显著降低。可 以观察到聚合。与此相反，SFA样品在几个星期之后保留大量的酶活性。事实上，储存在 F6H8中的CHY的生物活性与对照小瓶中样品的生物活性是非常相似的。表1示出了每个测 试样品中测得的以单位/mL表示的酶活性。
[0064] 就圆二色性的结果来看，储存在F6H8中的CHY的样品总是与对照样品高度相似， 而储存在PPS中的CHY的样品显示出表明明显变性的显著变化。 表1
【权利要求】
1. 一种组合物，其包括生物活性化合物和液体赋形剂，其中所述液体赋形剂包括式 RFRH的半氟化烷烃，其中RF是具有4至12个碳原子的直链全氟烃段，并且其中RH是具有 4至8个碳原子的直链烷基；并且其中所述生物活性化合物是选自多肽和蛋白质的治疗剂 或诊断剂或疫苗并且被掺入所述组合物中以形成分散体或悬浮体。
2. 根据权利要求1所述的组合物，其中所述多肽或所述蛋白质具有至少约1，500Da的 分子量，以及特别是具有至少约2000Da的分子量。
3. 根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述生物活性化合物对降解和/或聚合敏 感。
4. 根据任何前述权利要求所述的组合物，其中所述生物活性化合物是单个结构域的蛋 白质或者两个结构域的蛋白质。
5. 根据任何前述权利要求所述的组合物，其中所述生物活性化合物是胰岛素。
6. 根据任何前述权利要求所述的组合物，其中所述半氟化烷烃选自F4H5、F4H6、F4H8、 F6H4、F6H6、F6H8 和 F6H10。
7. 根据任何前述权利要求所述的组合物，其基本上不含水。
8. 根据任何前述权利要求用作药物的所述的组合物。
9. 根据权利要求8用作药物的所述组合物，其中所述药物是通过皮下、真皮、肌内或局 部注射用于肠外给药的。
10. 根据权利要求8用作药物的所述组合物，其中所述药物是用于局部给药至患者的 眼睛、耳朵、肺部、皮肤或鼻子。
11. 一种制备包含选自多肽或蛋白质的生物活性治疗剂或诊断剂或疫苗的组合物的方 法，其包括将所述生物活性多肽或蛋白质掺入包含式RFRH的半氟化烷烃的液体赋形剂中 以形成分散体或悬浮体的步骤，其中RF是具有4至12个碳原子的直链全氟烃段，并且其中 RH是具有4至8个碳原子的直链烷基。
12. 根据权利要求11所述的方法，其中所述多肽或蛋白质具有至少约1，500Da的分子 量，以及特别是具有至少约2000Da的分子量。
13. 根据权利要求11或12所述的方法，其中所述生物活性多肽和蛋白质对降解和/或 聚合敏感。
14. 根据权利要求11至13中任何一项所述的方法，其中所述组合物是化学稳定的和/ 或是物理稳定的。
【文档编号】A61K47/06GK104066442SQ201380006417
【公开日】2014年9月24日 申请日期:2013年1月22日 优先权日:2012年1月23日
【发明者】伯恩哈德·金特, 巴斯蒂安·泰辛格, 索尼娅·泰辛格, 迪特尔·谢勒, 克莱夫·威尔逊, 安东尼·佩蒂格鲁, 安妮特·休蒂格 申请人:诺瓦利克有限责任公司