用于治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具有改善特性的rna调节性寡核苷酸的制作方法
【专利摘要】本发明提供改善的寡核苷酸和其用于治疗、缓解、预防和/或延迟DMD或BMD的应用。
【专利说明】用于治疗杜兴型肌营养不良症和贝克型肌营养不良症的具 有改善特性的RNA调节性寡核苷酸
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人类遗传学的领域，更具体地，涉及神经肌肉病症（disorder)。具体 地，本发明涉及具有增强如本文进一步限定的临床适用性的改善的特性的寡核苷酸的应 用。
【背景技术】
[0002] 神经肌肉疾病的特征是由于肌肉或神经病理学（肌肉疾病（myopathy)和神经病 变（neuropathy))导致的受损的肌肉机能（functioning)。肌肉疾病包含特征是骨豁、心 脏和/或平滑肌的渐进无力和变性（退化，degeneration)的遗传性肌营养不良症（肌肉 萎缩症，muscular dystrophy)。杜兴型肌营养不良（DMD)和贝克型肌营养不良（BMD)是 肌营养不良的最常见的儿童形式。DMD是严重的、致命的神经肌肉病症，导致在12岁的年 龄之前依赖于轮椅支撑，并且由于呼吸衰竭或心脏衰竭，患者经常在十三岁的年龄之前死 亡。其由导致缺乏功能性肌养蛋白（dystrophin)的阅读框-移码缺失（删除，deletion) (?67%)或一个或更多个外显子的重复（?7%)或由2. 24Mb DMD基因中的点突变（? 25% )引起。BMD也是由DMD基因中的突变引起的，但是这些保持开放阅读框，产生半功能性 (semi-functional)的肌养蛋白，并且导致典型地更加温和的显型和更长的寿命。在过去十 年期间，出现了为了修复被破坏的转录本的阅读框的剪接的特异性修饰作为用于DMD的有 希望的治疗（van Ommen 等人，2008 ;Yokota 等人，2007 ;van Deutekom 等人，2007 ;Goemans 等人,2011 ;Cirak等人,2011)。用结合至侧接（flanking)突变或含有突变的外显子并且干 扰它的剪接信号的高度序列特异性的反义寡核苷酸（Α0Ν)，可在DMD前体mRNA(pre-mRNA) 的加工期间诱导那个外显子的跳读（跳跃、略读，skipping)。尽管产生了截短的转录本， 但是修复了开放阅读框和引入了类似于在BMD患者中发现的那些的蛋白质。Α0Ν诱导的外 显子跳读为DMD患者提供突变特异性的、并因此是个性化的治疗方法。如在W002/024906、 W02004/083446、W02006/112705、W02007/135105、W02009/139630、W0 2010/050801 或 W0 2010/050802中描述的，目前正在开发用于跳读肌养蛋白前体mRNA的大部分相关的外显子 (如外显子 2、8、9、17、29、43、44、45、46、47、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60-63、 71-78)的几种寡核苷酸。
[0003] 因为大多数突变簇在外显子45至55附近，一个具体的外显子的跳读可以是具有 不同的突变的很多患者的治疗剂。外显子51的跳读适用于最大的患者子集（?13% )，包 括具有外显子45至50、48至50、50或52的缺失的那些。所使用的Α0Ν被化学地修饰以 抵抗核酸内切酶、核酸外切酶和RNA酶H(RNaseH)并促进RNA结合和双链稳定性。目前正 在开发用于DMD中的外显子51跳读的两种不同的Α0Ν化学品：2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA A0N(2' -0-methyl phosphorothioate RNA AONs) (20MePS，GSK2402968/PR0051)和磷酰二 胺吗琳代寡聚物（phosphorodiamidate morpholino oligomers) (PM0，AVI_4658) (Goemans 等人，2011 ;Cirak等人，2011)。在两个独立的I期/II期研究中，显示两者均特异性地诱 导外显子51跳读并且在全身给予之后至少部分地修复肌纤维细胞膜上的肌养蛋白表达。 尽管典型地，健康的肌纤维不能很好的吸收AON，但DMD中的肌养蛋白缺乏、导致受损伤的 并因此更加可渗透的纤维细胞膜，这事实上促进了摄取。在肌养蛋白缺陷型mdx小鼠模型 的研究中，当与野生型小鼠中的摄取相比较时，证明了 2'-0-甲基硫代磷酸酯RNA寡核苷酸 在不同的肌肉群组中最高达10倍的更高的摄取（Heemskerk等人，2010)。尽管在DMD患者 中，具有2'-0-甲基硫代磷酸酯RNA和磷酰二胺吗啉代AON的近期I/II期结果证实营养不 良的肌肉中的这种增强的摄取，但是不同的化学修饰似乎导致通过肌肉的差别的摄取和分 布。在处理3月之后，在两个研究中的新的肌养蛋白的水平是有希望的，但是，仍然是温和 的和挑战研究下一代寡核苷酸化学的领域。
[0004] 选择的化学品的具体的特征至少部分影响AON至靶标转录本的递送：给予途径、 生物稳定性、生物分布、组织内分布以及细胞摄取和运输。此外，构思寡核苷酸化学的进一 步的优化以增强结合亲和力和稳定性、增强活性、改进安全性和/或通过减少长度或改进 合成和/或纯化程序减少成本。对于研究群体，多种化学修饰已经普遍和/或商业可获得 (如2' -0-甲基RNA和5-取代的嘧啶以及2, 6-二氨基嘌呤），然而，大部分其他的仍然重 要的合成努力来获得。已经用含有在此处所确认的嘧啶和嘌呤碱基上的修饰的2'-0_甲基 硫代磷酸酯RNA获得了特别预备的鼓舞人心的结果。
[0005] 总之，为了增强用于DMD的AON的治疗适用性，需要具有改善的特性的AON。
【发明内容】
[0006] 宴核苷酸
[0007] 在第一方面中，本发明提供包含2' -0-甲基RNA单体和硫代磷酸酯骨架或由通过 硫代磷酸酯骨架连接的2' -0-甲基RNA单体组成、且包含5-甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基 嘌呤碱基的、优选地用作用于治疗杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良的药物的寡核苷 酸。
[0008] 因此，本发明提供包含2' -0-甲基RNA单体、硫代磷酸酯骨架和5-甲基嘧啶和/ 或2, 6-二氨基嘌呤碱基的、优选地用作用于治疗杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良 的药物的寡核苷酸。
[0009] 因此，本发明也提供由2' -0-甲基RNA单体和硫代磷酸酯骨架组成的并且包含 5_甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤碱基的、优选地用作用于治疗杜兴型肌营养不良或贝克 型肌营养不良的药物的寡核苷酸。
[0010] 对于技术人员清楚的是在本发明的寡核苷酸中出现的"RNA单体"也可以被认为是 "RNA核苷酸残基"。在整个本申请中可交换地使用两个术语。
[0011] 在本发明的背景中，每一个下列表达中的"一个（a)"意味着"至少一个"：一个 2' -0-甲基RNA单体、一个2' -0-甲基RNA核苷酸残基、一个2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA 单体、一个5-甲基嘧啶碱基、一个2, 6-二氨基嘌呤碱基。
[0012] 在本发明的背景中，对于技术人员清楚的是，"包含2'-0-甲基RNA单体、硫代磷酸 酯骨架的寡核苷酸"可以被"包含由硫代磷酸酯骨架连接的2' -0-甲基RNA单体的寡核苷 酸"代替。同样适用的是"由2' -0-甲基RNA单体和硫代磷酸酯骨架组成的寡核苷酸"可 以被"由硫代磷酸酯骨架连接的2' -0-甲基RNA单体的寡核苷酸"代替。
[0013] 在本发明的背景中，表述"用作用于治疗杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良 的药物"可被表述"用于杜兴型肌营养不良或贝克型肌营养不良的治疗"取代。
[0014] 优选地，寡核苷酸是具有不超过34个核苷酸的寡核苷酸。所述寡核苷酸可以具有 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32 或 33 个核 苷酸。也可认为这样的寡核苷酸是具有10至33个核苷酸的寡核苷酸。
[0015] 因此，本发明的寡核苷酸包含2' -0-甲基RNA单体和硫代磷酸酯骨架并且包含不 超过 34 个核苷酸（S卩，它包含 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、 27、 28、29、30、31、32 或 33 个核苷酸）。
[0016] 因此，本发明的寡核苷酸由通过硫代磷酸酯骨架连接2' -0-甲基RNA单体组成并 且包含不超过 34 个核苷酸（S卩，它包含 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32 或 33 个核苷酸）。
[0017] 因此，本发明的寡核苷酸包含2' -0-甲基RNA单体、硫代磷酸酯骨架，包含不超过 34 个核苷酸（SP，它包含 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、 28、 29、30、31、32或33个核苷酸）和5-甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤碱基。
[0018] 因此，本发明的寡核苷酸由通过硫代磷酸酯骨架连接的2'-0-甲基RNA单体组成， 并且包含不超过 34 个核苷酸（S卩，它包含 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32或33个核苷酸）和5-甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤碱 基。
[0019] 这些寡核苷酸中的每一个用作或可以用作用于治疗杜兴型肌营养不良或贝克型 肌营养不良的药物。
[0020] 本发明的寡核苷酸包含2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA单体或由2' -0-甲基硫代磷 酸酯RNA单体组成。这样的寡核苷酸包含通过或由硫代磷酸酯骨架连接的2'-0_甲基RNA 单体，或由2'-0_甲基硫代磷酸酯RNA组成。优选地，这样的寡核苷酸由2'-0_甲基硫代磷 酸酯RNA组成。技术人员已知这样的化学品。遍及申请，包含2'-0-甲基RNA单体和硫代 磷酸酯骨架的寡核苷酸可被包含2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA的寡核苷酸代替。遍及申请， 由通过或由硫代磷酸酯骨架连接的2' -0-甲基RNA单体组成的寡核苷酸可被由2' -0-甲 基硫代磷酸酯RNA组成的寡核苷酸代替。
[0021] 在本发明的背景下，"骨架"被用于确定两个糖单元或糖单元或部分的修饰的 变体之间的连接，如此后稍后限定的（即，核苷间键（核苷间连接，internucleoside linkage))。遍及说明书，可交换地使用单词"骨架"、"核苷间键"和"连接"。因此，具有10 个核苷酸的寡核苷酸具有9个骨架，将如本文稍后限定的10个糖单元或糖单元或部分的修 饰的变体连接在一起。根据本发明的寡核苷酸的至少一个骨架由硫代磷酸酯部分组成，将 如本文稍后限定的两个糖单元或糖单元或部分的修饰的变体连接在一起。因此，由硫代磷 酸酯部分取代RNA中存在的至少一个磷酸二酯骨架。天然存在的核苷间键或骨架是3'至 5'憐酸_醋键。
[0022] 另外，本发明的寡核苷酸可包含碱基修饰，其增加与靶标链的结合亲和力、增加所 述寡核苷酸与它的祀标链的产生的双链体的解链温度（melting temperature)、和/或减 少免疫刺激影响、和/或增加生物稳定性、和/或改善生物分布和/或组织内分布、和/或细 胞摄取和运输。在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含5-甲基嘧啶和/或2, 6-二 氨基嘌呤碱基。5-甲基嘧啶碱基选自5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或胸腺嘧 啶，其中胸腺嘧啶与5-甲基尿嘧啶相同。
[0023] 因此，在本发明的修饰的寡核苷酸的背景中，表述"包含5-甲基胞嘧啶和/或 5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤碱基"可以被"包含选自由5-甲基胞嘧陡、5-甲基 尿嘧啶和2, 6-二氨基嘌呤碱基组成的组的碱基修饰"代替。
[0024] 当本发明的寡核苷酸具有两个或更多这样的碱基修饰时，所述碱基修饰可以是相 同的，例如，寡核苷酸中的所有的这样的修饰的碱基是5-甲基胞嘧啶，或所述碱基修饰可 以是不同的碱基修饰的组合，例如，寡核苷酸可具有一个或更多个5-甲基胞嘧啶和一个或 更多个5-甲基尿嘧啶。
[0025] 遍及文件，可以相互交换"胸腺嘧啶"和"5-甲基尿嘧啶"。类推地，2,6_二氨基嘌 呤与2-氨基腺嘌呤相同，和遍及文件可以相互交换这些术语。在US 7, 745, 42的另外的背 景中公开了 2, 6-二氨基嘌呤的应用。
[0026] 如此处确定的术语"碱基修饰"或"修饰的碱基"指的是，现有的碱基（即，嘧啶或 嘌呤碱基）的修饰或指的是，碱基的从头合成。与现有的碱基相比，这种从头合成的碱基可 适合作"修饰的"。包含5-甲基胞嘧啶和/或5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤碱基 的本发明的寡核苷酸分别地意味着，通过用甲基对嘧啶环的5-位置上的质子的取代，已经 修饰了所述寡核苷酸的至少一个胞嘧啶核酸碱基，即，5-取代的胞嘧啶，和/或通过用甲基 对嘧啶环的5-位置上的质子的取代，已经修饰了所述寡核苷酸的至少一个尿嘧啶核酸碱 基（即，5-甲基尿嘧啶），和/或通过用氨基对2-位置上的质子的取代，已经修饰了所述寡 核苷酸的至少一个腺嘌呤核酸碱基（即，2, 6-二氨基嘌呤）。在本发明的背景内，表述"在 嘧啶环的位置5中用甲基取代质子"可被表述"用5-甲基嘧啶取代嘧啶"代替，嘧啶仅指 尿嘧啶、仅指胞嘧啶或指两者。同样地，在本发明的背景内，表述"在腺嘌呤的位置2中用 氨基取代质子"可被表述"用2, 6-二氨基嘌呤取代腺嘌呤"代替。如果所述寡核苷酸包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤，分别地这样修饰至少一个、2、 3、4、5、6、7、8、9或更多个胞嘧啶、尿嘧啶和/或腺嘌呤。优选地，以这样的方式或分别地通 过5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤取代，已经修饰了所有的胞嘧啶、 尿嘧啶和/或腺嘌呤。不必说，本发明的这个方面只可使应用于在它们的序列中分别地包 含至少一个胞嘧啶、尿嘧啶或腺嘌呤的寡核苷酸。通过参考不包含5-甲基胞嘧啶、不包含 5_甲基尿啼陡和不包含2, 6-二氨基噪呤的它的未修饰的配对物（counterpart)，包含至少 一个5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤的寡核苷酸可被称为修饰的寡 核苷酸。未修饰的配对物也可被认为是包含未修饰的胞嘧啶、未修饰的尿嘧啶和未修饰的 腺嘌呤的寡核苷酸。由包含SEQIDN0:91、SEQIDN0:93-SEQIDN0:170的或由SEQID N0 :91、SEQIDN0:93-SEQIDN0:170组成的下列碱基或核苷酸序列中的一个表示优选的 未修饰的序列。
[0027] 发明人发现，本发明的寡核苷酸中的5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-二 氨基嘌呤的存在对所述寡核苷酸的至少一个参数具有积极的效果。在这个背景中，参数可 以包括：如下面解释的，结合亲和力和/或动力学、外显子跳读活性、生物稳定性、（组织内） 分布、细胞摄取和/或运输和/或所述寡核苷酸的免疫原性。所述积极的效果可以与包含 的碱基修饰的数量或百分数相关。对于外显子跳读活性的参数，发明人发现对于某些寡核 苷酸，本身不需要核酸碱基的修饰来获得相对高的外显子跳读水平。这可与在它的剪接过 程中，外显子内的特异性的靶向序列的特异性的任务（和长度）相关。
[0028] 结合亲和力和动力学取决于AON的热力学性质。至少部分地通过所述寡核苷酸的 解链温度（Tm ;例如，对于单链RNA，使用基础Tm和最近邻的模型，用寡核苷酸性质计算器 (http://www.unc. edu/ ~ cail/biotool/oligo/index.html 或 http://eu. idtdna. com/ analyzer/Applications/OligoAnalyzer/)计算的），和/或寡核苷酸-祀外显子复合体的 自由能（使用RNA structure版本4. 5或RNA mfold版本3. 5)确定这些。如果Tm增加， 外显子跳读活性显著地增加，但是当Tm太高时，预计AON变成序列特异性较低。可接受的 Tm和自由能取决于寡核苷酸的序列。因此，难以给出这些参数的每一个的优选的范围。
[0029] 优选地，使用与描述的祀向外显子侧接的DMD基因-特异性引物（Aartsma-Rus 等人，2003)，通过逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR)，通过分析从AON-处理的肌肉细胞培 养物或肌肉组织分离的总RNA测量外显子跳读活性。在1-2%琼脂糖凝胶上或用Agilent 2100生物分析仪（荷兰，安捷伦科技公司）分析RT-PCR产物。评估表示其中靶外显子被跳 读的转录本的较短的转录本片段与总的转录本产物的比率（计算为由Α0Ν诱导的外显子跳 读的百分数）。也可对较短的片段测序以确定靶向外显子跳读的正确性和特异性。与它的 未修饰的配对物相比（即，包含2' -0-甲基RNA单体、硫代磷酸酯骨架和不包含任何5-甲 基嘧啶和任何2, 6-二氨基嘌呤碱基的寡核苷酸），对本发明的修饰的寡核苷酸（即，包含 2'-0_甲基RNA单体、硫代磷酸酯骨架和5-甲基嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤碱基的寡核苷 酸））可以检测到外显子跳读的百分数增加。优选地，所述增加是如上述解释的使用RT-PCR 评估的可检测的增加。优选地，所述增加是至少5 %、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、 70 % ,80 % ,90 % U00 % > 110 % > 120 % U30 % U40 % U50 %, 160 % U70 % U80 %, 190 %, 200%、210%、300%、400%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%的增加，或至少2、3、 4、5、6、7、8、9 或 10 倍更高，或甚至 11、12、13、14、15、16、17、18、19、20 倍更高或更多。
[0030] 优选地，至少部分地通过改编自Yu等人，2002的验证的杂交连接分析确定生物 分布和生物稳定性。在一个实施方式中，用特异性捕获寡核苷酸探针孵育血浆或均质化 的组织样品。在分离之后，将DIG标记的寡核苷酸连接至复合体，并且之后是用抗DIG抗 体连接的过氧化物酶的检测。使用WINN0NLIN软件包（模型200,版本5. 2, Pharsight， Mountainview，CA)进行非房室（non-compartmental)药代动力学分析。随着时间监测 AON (ug) /mL血楽或AON (ug) /mg组织的水平以评估曲线下面积（AUC)、最大浓度（Cmax)、至最 大浓度的时间（Tmax)、终点半衰期和吸收延迟时间（t lag)。在实验部分中公开了这样优选的 分析。
[0031] Α0Ν可通过激活Toll-样受体（TLR)(包括TLR9和TLR7)刺激先天性免疫应答 (Krieg等人，1995)。典型地，由于存在于寡脱氧核糖核苷酸（0DN)中非甲基化的CG序列的 存在，通过模仿细菌DNA，其通过TLR9-介导的细胞因子释放激活先天免疫系统，发生TLR9 的激活。然而，表明2'-0_甲基修饰显著地减少这样的可能的影响。已经描述了 TLR7识别 RNA中的尿嘧啶重复（Diebold等人，2006)。
[0032] TLR9和TLR7的激活导致一组协同的免疫应答，其包括先天免疫（巨噬细胞、树突 状细胞（DC)和NK细胞）（Krieg等人，1995 ;Krieg，2000)。在这个过程中牵连到几个化学因 子和细胞因子，如 IP_l〇、TNFa、IL-6、MCP-1 和 IFNa (Wagner，1999 ;Popovic 等人，2006)。 炎症性细胞因子从血液吸引另外的防御性细胞，如T和B细胞。可通过体外试验研究这些 细胞因子的水平。总之，用渐增的AON浓度孵育人全血，在这之后，通过标准的市售ELISA 试剂盒确定细胞因子的水平。在试验部分中描述了这样的优选的实验。与用不具有5-甲 基胞嘧啶的相应的寡核苷酸处理的细胞相比，在用包含至少一个5-甲基胞嘧啶的寡核苷 酸处理的细胞中，在分析中，通过比较相应的细胞因子的浓度，优选地，免疫原性的减少对 应于上述提到的至少一种细胞因子的浓度的可检测的减少。
[0033] 因此，通过与由2' -0-甲基硫代磷酸酯RNA组成的、不具有5-甲基胞嘧啶、5-甲 基尿嘧啶和2, 6-二氨基嘌呤的相应的寡核苷酸（即，所谓的未修饰的寡核苷酸）相比，本 发明的优选的寡核苷酸具有改善的参数，如可接受的或减少的免疫原性和/或较好的生物 分布和/或可接受的或改善的RNA结合动力学和/或热力学性质。也可认为所述未修饰的 寡核苷酸是包含未修饰的胞嘧啶、未修饰的尿嘧啶和未修饰的腺嘌呤的寡核苷酸。可用技 术人员已知的或优选地此处公开的实验评估这些参数中的每一个。
[0034] 下面限定本发明的寡核苷酸的其他化学成分（chemistries)和修饰。这些另外的 化学成分和修饰可存在于对于所述寡核苷酸已经限定的化学成分中，即，存在5-甲基胞嘧 啶、5-甲基尿嘧啶和/或2, 6-氨基嘌呤，以及包含2'-0-甲基硫代磷酸酯RNA或由2'-0-甲 基硫代磷酸酯RNA组成的寡核苷酸。
[0035] 本发明的优选的寡核苷酸包含RNA分子或修饰的RNA分子或由RNA分子或修饰的 RNA分子组成。在优选的实施方式中，寡核苷酸是单链的。技术人员将明白，然而，可能的 是，单链的寡核苷酸可形成内部双链结构。然而，在本发明的背景中，这种寡核苷酸仍然被 称为单链的寡核苷酸。
[0036] 除了上述描述的修饰之外，本发明的寡核苷酸可以包含进一步的修饰如下面描述 的不同类型的核酸单体或核苷酸。不同类型的核酸单体可用于形成本发明的寡核苷酸。与 以RNA为基础的寡核苷酸相比，所述寡核苷酸可具有至少一个骨架和/或糖修饰和/或至 少一个碱基修饰。
[0037] 碱基修饰包括天然的嘌呤和嘧啶碱基（例如，腺嘌呤、尿嘧啶、鸟嘌呤、胞嘧啶和 胸腺啼陡）的修饰的变体，如次黄噪呤、乳清酸、胍丁胺（agmatine)、赖西丁（lysidine)、 2-硫代嘧啶（例如，2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶）、G-形钳（G-c 1 amp)和它的衍生 物、5-取代的嘧啶（例如，5-卤代尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、5-丙炔基胞嘧啶、5-氨基甲 基尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、5-氨甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、Super T)、7-脱氮鸟嘌呤 (地查枸林，7-deazaguanine)、7_脱氮腺噪呤、7-氮杂-2, 6-二氨基噪呤、8-氮杂-7-脱 氮鸟嘌呤、8-氮杂-7-脱氮腺嘌呤、8-氮杂-7-脱氮-2, 6-二氨基嘌呤、Super G、Super A 和N4-乙基胞嘧啶或它的衍生物；N2-环戊基鸟嘌呤（cPent-G)、N2-环戊基-2-氨基嘌呤 (cPent-AP)和N 2-丙基-2-氨基嘌呤（Pr-AP)、假尿嘧啶或它的衍生物；和简并的（退化 的，degenerate)或通用的碱基，如2, 6-二氟甲苯或缺少的碱基类脱碱基位点（例如，1-脱 氧核糖、1，2-二脱氧核糖、1-脱氧-2-0-甲基核糖）；或其中以氮取代环中氧的批咯烧衍生 物（氮杂核糖））。在美国专利US 6,683，173(Epoch Biosciences)中可以发现Super A、 Super G和Super T的衍生物的实例，其全部内容通过引用结合于此。当包含在siRNA中 时，显不 cPent-G、cPent-AP 和 Pr_AP 减少免疫刺激影响（？63。〇〇1^!1.6丨31.]\4111.〇16111· Soc. 2011，133, 9200)。
[0038] 假尿嘧啶是尿嘧啶的自然地存在的异构化的变体，具有C_糖苷而不是如在尿嘧 啶中的普通的N-糖苷。与含有尿苷的mRNA相比，含有假尿苷的合成的mRNA可具有改善的 安全性曲线（W0 2009127230,其全部内容通过引用结合于此）。
[0039] 在一个实施方式中，本发明的寡核苷酸包含脱碱基位点或脱碱基单体。在本发明 的背景内，这样的单体可以被叫做脱碱基位点或脱碱基单体。与包含碱基的相应的单体相 t匕，脱碱基单体或脱碱基位点是缺少核碱基的单体或基础结构（构件，building block)。 因此，在本发明内，脱碱基单体是寡核苷酸的基础结构部分但是缺少核碱基。可存在这样的 脱碱基单体或可将其连接（键连，link)或附着（attach)或缀合（conjugate)至寡核苷酸 的游离端上。
[0040] 在更优选的实施方式中，本发明的寡核苷酸包含1-20个或更多脱碱基单体。因 此，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多脱碱基单体可存在于 本发明寡核苷酸中。
[0041] 脱碱基单体可以是技术人员已知的和可想象的任何类型的单体，下面描述非限制 性的实例：
[0042]
【权利要求】
1. 一种寡核苷酸，包含2' -ο-甲基RNA单体和硫代磷酸酯骨架并且包含5-甲基尿嘧 啶和/或5-甲基胞嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤碱基，用于治疗杜兴型肌营养不良症和贝 克型肌营养不良症。
2. 根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含5-甲基胞嘧啶和/或 5-甲基尿嘧啶碱基。
3. 根据权利要求1或2所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含2, 6-二氨基嘌呤碱 基。
4. 根据权利要求1-3中任一项所述的寡核苷酸，其中，与包含2'-0_甲基RNA单体和硫 代磷酸酯骨架而不具有5-甲基胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶以及2, 6-二氨基嘌呤的相应的寡 核苷酸相比，所述寡核苷酸具有改善的参数，其中所述改善的参数是：结合亲和力、动力学、 外显子跳读活性、生物稳定性、（组织内）分布、细胞摄取、运输和/或免疫原性。
5. 根据权利要求1至4中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸的长度小于34 个核苷酸。
6. 根据权利要求1至5中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸反向互补于和/ 或结合至和/或靶向和/或杂交于肌养蛋白外显子和/或非外显子区域的至少部分。
7. 根据权利要求1至6中任一项所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸包含反向互补于 和/或结合至和/或靶向和/或杂交于与肌养蛋白前体mRNA外显子44至55的至少部分 的序列或由反向互补于和/或结合至和/或靶向和/或杂交于肌养蛋白前体mRNA外显子 44至55的至少部分的序列组成，所述寡核苷酸部分具有从10至33个核苷酸。
8. 根据权利要求7所述的寡核苷酸，其中， 所述寡核苷酸包含2' -0-甲基RNA单体和硫代磷酸酯骨架， 所述寡核苷酸由包含 SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:14-SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:53-SEQ IDN0:90中的一个或由SEQIDN0:52、SEQIDN0:14-SEQIDN0:51、SEQIDN0:53-SEQID N0:90中的一个组成的核苷酸或碱基序列，或由包含SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:14-SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:53-SEQ ID N0:90 中的一个的片段或由 SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:14-SEQ ID N0:51、SEQ ID N0:53-SEQ ID N0:90中的一个的片段组成的核苷酸序列表示，并且所述 寡核苷酸包含5-甲基尿嘧啶和/或5-甲基胞嘧啶和/或2, 6-二氨基嘌呤碱基。
9. 根据权利要求8所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸由包含SEQ ID NO: 52、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:57 中的一个或由 SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:57 中的一 个组成的核苷酸或碱基序列，或由包含SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:57 中的一个的片段或由 SEQ ID N0:52、SEQ ID N0:15、 SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:31、SEQ ID N0:40、SEQ ID N0:57 中的一个的片段组成的核苷酸 或碱基序列表示。
10. 根据权利要求8或9所述的寡核苷酸，其中，所述寡核苷酸由包含SEQ ID NO:92、 SEQ ID N0:171-SEQ ID N0:215、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:219 中的一个 或由 SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:171-SEQ ID N0:215、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:219中的一个组成的核苷酸或碱基序列，或由包含SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:171-SEQ ID N0:215、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:219 中的一个的片段或由 SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:171-SEQ ID N0:215、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:218、SEQ ID N0:219 中 的一个的片段组成的核苷酸或碱基序列表不。
11. 根据权利要求10所述的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸由包含SEQ ID N0:92、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID N0:200、SEQ ID N0:206、 SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:217、SEQ ID N0:218 或 SEQ ID N0:219 中的一个或由 SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:171、SEQ ID N0:173、 SEQ ID N0:185, SEQ ID N0:187, SEQ ID N0:200, SEQ ID N0:206, SEQ ID N0:207, SEQ ID N0:208、SEQ ID N0:210、SEQ ID N0:213、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:218 或 SEQ ID NO:219中的一个组成的核苷酸或碱基序列，或由包含SEQ ID NO:92、SEQ ID NO: 171、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、 SEQ ID N0:208、SEQ ID N0:210、SEQ ID N0:213、SEQ ID N0:217、SEQ ID N0:218 或 SEQ ID N0:219 中的一个的片段或由 SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:171、SEQ ID N0:173、SEQ ID N0:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、 SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218 或 SEQ ID NO:219 中的 一个的片段组成的核苷酸或碱基序列表示，所述片段包含SEQ ID N0:92、SEQ ID NO: 171、 SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218 或SEQ ID N0:219的至少10个连续的核苷酸或碱基或由SEQ ID N0:92、SEQ ID N0:171、 SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:200、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218 或SEQ ID NO:219的至少10个连续的核苷酸或碱基组成，并且这样的片段具有10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32 或 33 个核苷酸的长 度。
12. -种组合物，包含在权利要求1至11中任一项中限定的寡核苷酸。
13. 根据权利要求12所述的组合物，其中，它包含至少一种赋形剂，所述赋形剂可以进 一步辅助增强所述组合物和/或所述寡核苷酸靶向组织和/或细胞和/或递送进入组织内 和/或细胞内。
14. 一种通过将在权利要求1至11中任一项中限定的寡核苷酸或在权利要求12或13 中限定的组合物给予需要其的受试者，用于预防、治疗和/或延迟杜兴型肌营养不良症或 贝克型肌营养不良症的方法。
【文档编号】A61K48/00GK104203289SQ201380018177
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2013年1月28日 优先权日:2012年1月27日
【发明者】彼得·克里斯蒂安·德菲瑟, 朱迪思·克里斯蒂娜·西奥多拉·范多伊特科姆 申请人:普罗森萨科技有限公司