一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗。该疫苗株通过抗菌素与A因子血清相结合的驯化和筛选技术，筛选出一株粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343。该粗糙型弱毒株的安全性显著提高，但仍保留了对布鲁氏菌病良好的免疫效果。利用该弱毒株制备成布鲁氏菌病疫苗，将改变布鲁氏菌疫苗免疫动物与野毒株感染动物难以区分的现状，并有效提高现有疫苗的安全性。
【专利说明】一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗
[0001]【技术领域】本发明涉及一株布鲁氏菌弱毒株及其疫苗。该疫苗为牛、羊和猪对布鲁氏菌病的预防用活疫苗，属兽用生物制品领域。
技术背景
[0002]布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌或称布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。
[0003]根据布鲁氏菌表型的差异，可将布鲁氏菌分为光滑型(S)和粗糙型(R)两类，目前在我国使用的布病活疫苗均为光滑型菌株，其免疫带来的主要问题是使用后无法区分疫苗免疫与自然感染的动物，这在很大程度上限制了布鲁氏菌疫苗的使用和推广，也给布病的有效防治和清除带来了一定的难度。
[0004]虽然布鲁氏菌存在两种不同的表型，在凝集类抗体水平上无交叉反应，但却具有良好的交叉保护性，并且不同种来源的布鲁氏菌相互之间同样存在交叉保护能力。如果用粗糙型布鲁氏菌疫苗免疫的动物，其血清只与粗糙型抗原发生凝集反应，而与光滑型血清不反应，以此可以区分疫苗生产用菌株和野毒株。基于上述原因，人们对粗糙型布鲁氏菌疫苗株的研发从未间断过。到目前为止，成功开发出具有良好免疫原性的粗糙型布鲁氏菌疫苗株却鲜有报道。
[0005]最早使用过的粗糙型布鲁氏菌疫苗是用45/20菌株制备的，但该菌株极不稳定，经常会出现从R型到S型的变异，造成毒力返强，因而该疫苗已基本不再使用。90年代美国科学家通过利福平诱变获得了粗糙型布鲁氏菌RB51菌株，该菌株具有良好的免疫力，已在美国和拉美的多个国家广泛使用。但其安全性仍有争议。
[0006]已有的研究证实布鲁氏菌细胞壁脂多糖(LPS)中的O链组成决定了其光滑型或粗糙型的表型，O链的某些成分缺失，会导致菌株由光滑型变成粗糙型。现已发现多个与布鲁氏菌光滑型表型相关的基因，包括gmd、per、pgm、wbkA、lpx、wa、wbkC、wz和wbkC。但到目前为止，国内外尚无转基因获得的重组布鲁氏菌弱毒株及其疫苗被批准和应用。
【发明内容】
[0007] 2007—2012年间，本实验室陆续从我国不同省份和地区牛、羊、犬和鹿等动物体内分离到牛种布鲁氏菌41株，羊种布鲁氏菌74株，犬种布鲁氏菌9株。研究过程中，我们初步发现了一株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)分离株，其毒力介于强毒和疫苗毒之间，专利 申请人:已对其进行了全面的生化检定，并分别用小鼠和豚鼠测定了其毒力。结果发现其毒力介于强毒和弱毒之间，测定为中等毒力布鲁氏菌，命名为AbortUS343。本发明本发明采用低浓度氯霉素(lug/ml)与光滑型牛种布鲁氏菌抗血清(A因子血清)相结合的诱导方法，筛选获得了一株遗传稳定的粗糙型布鲁氏菌命名为RA343。RA343株安全性高，免疫效果好，用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分。
[0008]本发明的技术方案
[0009]1.一株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)弱毒菌株RA343,其特征在于采用氯霉素与A因子血清相结合的筛选方法，筛选获得了一株不干扰布病临床诊断的粗糙型牛种布鲁氏菌，用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，牛种布鲁氏菌(Brucella abortus)RA343菌株已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为:CGMCC N0.8886。
[0010]2.一种布鲁氏菌活疫苗的生产方法，其特征在于用胰大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCC N0.8886株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的按1%~2%接入布鲁氏菌CGMCCN0.8886株种子菌液，37°C ，按常规方法发酵培养28~38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型RA343株牛种布鲁氏菌病疫苗。
[0011]本发明是通过以下步骤实现的:
[0012]1.筛选中等毒力布鲁氏菌分离株从41株牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)田间分离株中，通过有限稀释法和菌落结晶紫染色获得10株形态稳定的候选株。再参照《兽用生物制品规程》(中华人民共和国农业部编.中华人民共和国兽用生物制品规程.2000年版，化学工业出版社，2001)中布鲁氏菌病活疫苗种毒毒力测定方法，采用豚鼠脾脏含菌量测定10株候选菌株的毒力，筛选毒力适中的布鲁氏菌(A343株)作为诱导的候选株。
[0013]2.对候选分离株进行诱导和驯化首先将A343在含低浓度氯霉素(I μ g/ml)的TSA培养基上传代，共传了 35代，其结果是菌落结晶紫染色的阳性率由A343 (FO)低于1%到A343(F40)6%左右。然后用光滑型牛种布鲁氏菌抗血清(A因子血清)进一步驯化，将不与A因子血清发生凝集的细菌反复传代，待该细菌的粗糙型菌落比例达90%左右时，改用双倍效价的A因子血清(牛种布鲁氏菌特异性血清，本实验室制备和保存)继续诱导。最终将获得的遗传稳定的粗糙型布鲁氏菌，命名为RA343株。
[0014]3.对粗糙型布鲁氏菌RA343进行详细的菌种检定包括形态和生化特性，血清学和PCR反应特异性，以及对豚鼠的毒力。
[0015]4.制备疫苗按布病疫苗的经典方法制备粗糙型布鲁氏菌病活疫苗，用于预防动物布鲁氏菌病。
[0016]发明的详细描述
[0017]1.中等毒力布鲁氏菌分离株的筛选
[0018](I)根据形态和稳定性初步筛选将本实验室自2007年-2012年从田间分离的牛种布鲁氏菌41株，通过有限稀释法培养单个菌落，挑选菌落大小均匀，结晶紫染色菌落阳性率低于1%的候选布鲁氏菌10株，用于豚鼠测毒。
[0019](2)通过对测定豚鼠毒力再次筛选参照《兽医生物制品规程》中布鲁氏菌疫苗种毒毒力测定方法，采用豚鼠脾脏含菌量测定10株候选菌株的毒力，将10株布鲁氏菌分别在TSA平板上增殖培养后，收集菌体，用无菌生理盐水将各细菌浓度调节到lX109CFU/ml。取350~400g雌性豚鼠50只，分为10组，5只/组，对应10株候选菌。将候选菌株分别以Iml/只腹股沟皮下注射各试验组豚鼠，14日后观察脏器病变情况，同时取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根据细菌生长数量计算每I克脾脏含菌量。结果只有I株(A343)分离株毒力最低，为1.2父10\^/^，其余9株均在6父10\^/^以上。本发明中选取A343作为本发明中诱导的原始菌种，标注为A343(F0)。
[0020]2.A343株的诱导和驯化
[0021](I)氯霉素的诱导将筛选出的A343株在含氯霉素(I μ g/ml)的TSA培养基上传代，在往下一代传代时，采用有限稀释法进行，并同时对平板上的菌落进行结晶紫染色。选取结晶紫染色着色程度最明显的菌落继续传代，如果未出现结晶紫染色阳性的菌落，则随机挑取。以此方法共传了 35代，其结果是菌落结晶紫染色的阳性率由A343 (FO)低于1%到A343(F40)6% 左右。
[0022](2)光滑型牛种布鲁氏菌抗血清(A因子血清)的驯化挑取单个A343(F40)菌落接种到TSB液体培养基中培养48h，用无菌生理盐水调节菌液浓度约20~30亿CFU/ml (此时0D600 = 0.1)。取0.5ml菌液加入0.5ml A因子血清(无菌过滤，含2个凝集单位/ml)，充分混匀后，37°C静置孵育2h，再转移到4°C冰箱静置12h。轻吸上层未凝集的菌液20 μ 1，转移接种到新鲜TSB培养基中，继续培养，如此反复诱导筛选30代。每5代通过有限稀释法获得单个菌落，并进行菌落结晶紫染色，挑取结晶紫着色的单菌落继续传代。到第30代，即A343(F35+30)，A343结晶紫染色能着色的菌落比例约90%。将A因子血清效价调整为4个凝集单位/ml，按上述方法继续诱导。对第6代(总传代为第71代)菌落进行结晶紫染色，此时所有菌落全能着色。在此基础上仍用4个凝集单位/ml的A因子血清继续诱导6代(总传代为第77代)，将获得的遗传稳定的粗糙型布鲁氏菌命名为牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)RA343 株。 [0023]3.粗糙型布鲁氏菌RA343株菌种检定
[0024](I)形态和生化特性RA343株菌菌落边缘整齐、圆润，露滴状，斜光照射，逆光观察微带蓝色乳光。染色形态为球杆菌，单个散在，不形成芽孢和荚膜。菌体大小在0.3~
0.6μπι之间。革兰氏染色为阴性。该菌的生长不依赖于CO2，能在含硫瑾和碱性复红的培养基上生长，H2S试验强阳性。
[0025](2)特异性
[0026]I)血清学特异性以RA343株菌的培养物制成抗原，与光滑型布鲁氏菌阳性血清(中监所，201101批)应不出现凝集，与粗糙型血清(本实验室制备)应出现凝集。
[0027]2)PCR特异性合成如下4条引物(序列1、序列2、序列3和序列4)，将其配成引物混合储存液，各引物浓度均为25 μ M0
[0028]Fer1:5， -GCGCCGCGAAGAACTTATCAA-3’
[0029]Rer1:5，-CGCCATGTTAGCGGCGGTGA-3，
[0030]Fabortus: 5，-GACGAACGGAATTTTTCCAATCCC-3，
[0031 ] R15711:5 ’ -TGCCGATCACTTAAGGGCCTTCAT-3 ’
[0032]模板:以RA343株菌的培养菌落或试剂盒提取RA343株菌的基因组DNA。
[0033]PCR反应体系:50μ L的反应体系中，含5 μ L10XBuffer，8 μ L2.5mMdNTPs，混合引物储存液2 μ L，Taq酶2U，模板DNAl μ L (或挑取菌落少许)。
[0034]PCR 反应程序:95V 5min 后，按 94°C Imin、60。。1.5min、72°C 1.5min 进行 28 个循环，最后 72°C IOmin0
[0035]结果:扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，应出现2条特异性PCR条带，大小分别为178bp和494bp (见图1)。
[0036](3)毒力用无菌生理盐水将在固体培养基上培养48_72h的RA343株菌培养物洗下，稀释成每毫升含活菌10亿CFU的悬液，腹股沟皮下注射体重350~400g的豚鼠(Hartley品系)5只，Iml/只。经14~15日后剖杀，取脾脏，混合称重，制成乳剂，接种TSA平板，根据其生长的菌落数，计算每克脾脏的含菌量，结果脾脏含菌为8.9 X IO3CFU,不超过20万CFU (强毒株的判断标)。
[0037](4)粗糙型特性热凝集试验、吖啶黄凝集试验、菌落结晶紫染色试验结果符合粗糙型布鲁氏菌的特点，即热凝集试验阳性，吖啶黄凝集试验阳性，能被结晶紫染色。
[0038](5)安全检验将RA343活菌用生理盐水稀释成Iml含活菌10亿CFU，皮下注射体重18~20g的小白鼠5只，每只0.1ml,观察6日，均全部健活。
[0039](6)免疫原性用生理盐水将RA343稀释成每毫升含50亿CFU菌的悬液，皮下注射体重350~400g的豚鼠10只，每只0.1mlo 30日后,用3个最小感染量的强毒牛种布鲁氏菌2308株菌(即为CVCC788株，由中国兽医微生物菌种保藏管理中心保藏和供应)约30个CFU接种攻毒，攻毒后30天剖杀，取脾脏捣碎作布鲁氏菌分离培养，80%以上的豚鼠均未分离到细菌。
[0040](7)遗传稳定性RA343在TSA培养基上传30代，每5代对其形态和生化特性、培养特性、粗糙型特性、毒力、PCR特异性、安全性及免疫原性进行检验，结果均未发生改变(表I)。
[0041]表1布鲁氏菌RA343株遗传稳定性测定结果
[0042]
【权利要求】
1.一株牛种布鲁氏菌弱毒菌株RA343，其特征在于采用氯霉素与A因子血清相结合的筛选方法，筛选获得了一株不干扰布病临床诊断的粗糙型牛种布鲁氏菌，用该菌制备的疫苗免疫动物后，其血清可用常规的凝集试验与自然感染相区分，牛种布鲁氏菌(Brucellaabortus)RA343菌株已于2014年05月20日送交北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物保藏委员会普通微生物保藏中心，保藏号为=CGMCCN0.8886。
2.—种布鲁氏菌活疫苗的生产方法,其特征在于用胰大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCCN0.8886株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的按I %~2%接入布鲁氏菌CGMCCN0.8886株种子菌液，37°C，按常规方法发酵培养28~38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，充分混匀、 分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为粗糙型RA343株牛种布鲁氏菌病疫苗。
【文档编号】A61P31/04GK103981139SQ201410240895
【公开日】2014年8月13日 申请日期:2014年6月3日 优先权日:2014年6月3日
【发明者】丁家波, 朱良全, 王芳, 冯忠武, 蒋卉, 毛开荣, 陈光华, 王楠, 宁宜宝, 李慧娇, 王忠田, 张广川, 程君生 申请人:中国兽医药品监察所