盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用的制作方法与工艺

本发明涉及生物医药领域，具体涉及盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防或治疗溃疡性结肠炎药物中的应用。

背景技术：
溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis，UC)是常见肠道疾病之一，病变主要侵及结肠黏膜及黏膜下层，具有连续性、弥漫性和迁延不愈等特点，随患者不同，病情轻重差异很大，其难治性在国际上被广泛认可。溃疡性结肠炎若不及时治疗会导致病情反复发作，由轻变重，久治不愈，形成慢性结肠炎。慢性结肠炎容易引起多重并发症，如大量出便血，会导致患者因失血过多而休克，肠炎感染会导致肠狭窄。肠溃疡任意发作，极易造成肠穿孔，其死亡率高达41％，更有5％的结肠炎患者最终变为肠癌。UC在西方国家比较常见，近期有资料显示，在美国患病率高达千分之二。每年UC在治疗上的花费约为1至1.5亿美元左右。在我国，近十年经济呈现飞速发展的同时，国民的饮食习惯发生了很大的变化，对于蔬菜的摄入量越来越少，取而代之的使越来越多的加工后的西式食物。最近一次调查显示UC的患病率和蔬菜的摄入量呈负相关，而ω-6脂肪酸，总脂肪，肉类的摄入量与其呈正相关。截止到2012年为止，UC患者的总数是2000年的2.5倍，且患者复发率达到了72％，患病人群越来越趋于年轻化。目前国内外防治溃疡性结肠炎的有效药物如氨基水杨酸类药物(柳氮磺胺砒啶，美沙拉嗪)，免疫抑制剂(强的松，硫唑嘌呤等)等均有病情缓解后易复发，药物副作用多等不良因素。因此，研发安全有效的治疗溃疡性结肠炎药物已成为当前药物研究的热点领域之一。盐酸去亚甲基小檗碱，又名去亚甲基小檗碱盐酸盐或脱亚甲基小檗碱盐酸盐，如式(I)所示。盐酸去亚甲基小檗碱(式I)的英文名为DemethyleneberberineHydrochloride或DemethyleneberberineChloride。本发明专利将它简称为DMB。式(I)中的骨架结构为去亚甲基小檗碱，它是盐酸去亚甲基小檗碱的活性成份。国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)将式(I)中的有机结构部分去亚甲基小檗碱命名9，10-dimethoxy-5，6-dihydroisoquinolino[2，1-b]isoquinolin-7-ium-2，3-diol，其中文名为9，10-二甲氧基-5，6-二氢异喹啉[2，1-b]异喹啉-7-鎓-2，3-二羟基。它的分子式：C19H18NO4+，分子量为：324.35。化学文摘号(CAS)为：25459-91-0。去亚甲基小檗碱可以与无机酸或有机酸形成多种盐，如氯化盐、硫酸盐、磷酸盐、溴化盐、碘化盐、枸橼酸盐、延胡索酸盐、马来酸盐、苹果酸盐和琥珀酸盐等分子形式存在。去亚甲基小檗碱存在于天然药用植物芸香科植物黄柏(CortexPhellodendriChinensis)中，由于含量较低，相关活性研究很少。有报道认为它在体外对多种革兰阳性及阴性菌均具有抑菌作用。近年来人们对小檗碱研究非常活跃，发现小檗碱除抗菌活性外，还具有降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒和抗肿瘤等药理作用。人们在研究小檗碱体内代谢过程中，发现小檗碱在体内经肝脏代谢亦可产生去亚甲基小檗碱，但对盐酸去亚甲基小檗碱在溃疡性结肠炎防治作用与机制研究未见报道。迄今为止，现有技术中没有关于盐酸去亚甲基小檗碱或去亚甲基小檗碱对溃疡性结肠炎预防和/或治疗作用的记载和报道。

技术实现要素：
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种预防或治疗溃疡性结肠炎的化合物，特别是提供了如式(I)所示的盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)作为预防或治疗溃疡性结肠炎药物的应用。在体外实验中，本发明通过通过细胞培养，采用RT-PCR、ROS探针法和荧光显微镜等方法分析去亚甲基小檗碱抗炎以及对ROS的清除作用。研究结果表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)在细胞水平上能显著抑制促炎因子的基因表达，对ROS有很强的清除作用。溃疡性结肠炎属于一种非特异性炎症性疾病，因此，本发明首次发现盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)具有体外的抗炎和抗氧化活性，这为开展DMB治疗溃疡性结肠炎的药物研究奠定了重要的理论基础。葡聚糖硫酸钠(dextransulphatesodium，DSS)诱导的结肠炎模型可很好地模拟人类溃疡性结肠炎，组织学特点、发病部位、临床表现以及细胞因子增殖情况都与人类的渍疡性结肠炎极为相似，是经典的人类结肠炎模型。因此本项目通过让小鼠自由饮用DSS水成功地制备小鼠溃疡性结肠炎症模型，考察盐酸去亚甲基小檗碱对溃疡性结肠炎的预防与治疗作用并探讨其作用机理。研究结果表明，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对DSS诱导的溃疡性结肠炎具有很好的预防保护和治疗作用。本发明以小鼠为动物试验模型，通过预防性给药治疗，首先考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对DSS诱导的溃疡性结肠炎的预防性治疗作用。预防性治疗方案是饮用3％DSS水造模前及造模期间，通过口服灌胃小鼠DMB，每天一次，共14天，给药组分别设置了75mg/kg(IG)，150mg/kg(IG)和300mg/kg(IG)三个剂量组。给药第八天，小鼠连续自由饮用3％DSS水七天后，自由饮水三天，使小鼠产生急性溃疡性结肠炎，处死小鼠。实验结果分析表明，DMB给药组中剂量组和高剂量组，均能显著改善小鼠结肠炎引起的结肠增重、萎缩、充血病症，显示出DMB对DSS诱导的结肠炎具有明显的保护作用。此外，与模型组相比，DMB中剂量和高剂量组的MPO明显降低，该研究结果表明DMB具有降低结肠部位中性粒细胞的浸润，起到抗炎的作用。结肠病理学研究结果表明：模型组各例结肠组织结构紊乱，隐窝及腺体缺失，炎症累及黏膜层和黏膜下层，而盐酸去亚甲基小檗碱预防给药组高剂量，结肠病变范围和程度较模型组明显减轻，给药组中剂量也能部分改善。这些实验结果充分地说明了盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)能有效地预防性治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎。本发明在预防性治疗成功的基础上，开展治疗性实验研究，考察盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)对DSS诱导的溃疡性结肠炎的直接治疗作用。此方案是在结肠损伤前，并不预先给予DMB作预防，通过使小鼠自由饮用3％DSS水，制备DSS诱导的小鼠急性结肠炎模型，造模共七天。DMB设置了150mg/kg(IG)和300mg/kg(IG)两个剂量组，从造模第四天每天灌胃给药一次；造模结束后第四天，处死小鼠。从裸眼看，模型鼠的结肠明显肿大，萎缩，以及部分充血；而盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)组无论低剂量或是高剂量，小鼠结肠组织炎症浸润、萎缩，肠壁增厚均得到改善。这些实验结果说明：无论是预防性治疗还是直接治疗，盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)均能有效地预防和/或治疗溃疡性结肠炎。本发明所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)产品采用常规化学制备与分离纯化法制得。本实验室采用高效液相色谱(HPLC)分析检测，其纯度达98％以上，并经化学法、红外色谱法、质谱(MS)法和核磁共振(1H-NMR)法分析鉴定，表明本研究所用盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)产品化学结构正确。此项研究表明盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)其纯度和化学结构符合开展体内、外生物学活性和药理作用研究要求。根据本发明还涉及含有作为活性成份的盐酸去亚甲基小檗碱和常规药物赋形剂或辅剂的药物组合物。通常本发明药物组合物含有0.1～95％重量的盐酸去亚甲基小檗碱。在单元剂型中本发明化合物一般含量为0.1～100mg。本发明化合物的药物组合物可根据本领域公知的方法制备。用于此目的时，如果需要，可将本发明化合物与一种或多种固体或液体药物赋形剂和/或辅剂结合，制成可作为人药或兽药使用的适当的施用形式或剂量形式。本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、口腔粘膜、皮肤、腹膜或直肠等。本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和穴位注射等。给药剂型可以是液体剂型、固体剂型。如液体剂型可以是真溶液类、胶体类、微粒剂型、乳剂剂型、混悬剂型。其他剂型例如片剂、胶囊、滴丸、气雾剂、丸剂、粉剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、栓剂、冻干粉针剂等。本发明化合物可以制成普通制剂、也可以是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。例如为了将单位给药剂型制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、碳酸钙、白陶土、微晶纤维素、硅酸铝等；湿润剂与粘合剂，如水、甘油、聚乙二醇、乙醇、丙醇、淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、紫胶、甲基纤维素、磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，例如干燥淀粉、海藻酸盐、琼脂粉、褐藻淀粉、碳酸氢钠与枸橼酸、碳酸钙、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等；崩解抑制剂，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氢化油等；吸收促进剂，例如季铵盐、十二烷基硫酸钠等；润滑剂，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇等。还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。例如为了将给药单元制成丸剂，可以广泛使用本领域公知的各种载体。关于载体的例子是，例如稀释剂与吸收剂，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可脂、氢化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、单硬脂酸甘油脂、高岭土、滑石粉等；粘合剂，如阿拉伯胶、黄蓍胶、明胶、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解剂如琼脂粉、干燥粉、海藻酸盐、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素等。例如为了将给药单元制成胶囊，将有效成份本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱与上述的各种载体混合，并将由此得到的混合物置于硬的明胶胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物制成微囊剂，混悬于水性介质中形成混悬剂，亦可装入硬胶囊中或制成注射剂应用。例如，将本发明化合物盐酸去亚甲基小檗碱制成注射用制剂，如溶液剂、混悬剂溶液剂、乳剂、冻干粉针剂，这种制剂可以是含水或非水的，可含一种和/或多种药效学上可接受的载体、稀释剂、粘合剂、润滑剂、防腐剂、表面活性剂、分散剂、渗透压调节剂、增溶剂和pH调节剂。如稀释可选用水、乙醇、聚乙二醇、1，3-丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、多氧化的异硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂、脂肪酸酯等。渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、甘油、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等；增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基β-环糊精等；pH调节剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等。如制备冻干粉针剂，还可以加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂、甜味剂或香料等。这些辅料是本领域常用的。本发明所用的无菌介质都可以通过本领域技术人员众所周知的标准技术制得。可将它们灭菌，例如通过经由细菌过虑器过滤、通过向组合物中加入灭菌剂、通过将组合物放射处理、或通过将组合物加热灭菌。还可以在临用前将它们制成无菌可注射介质。为了达到用药目的，增加治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。当然用于实施本发明化合物的给药途径取决于疾病和需要治疗的部位。因为本发明化合物的药动学和药效学特征会有某种程度的不同，因此在组织中获得治疗浓度的最优选方法是逐渐增加剂量并监测临床效果。对于这样的逐渐增加治疗剂量，初始剂量将取决于给药途径。对于任何特定患者，本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、性格及个体反应，给药途径、给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化。根据所治疗患者的病症，可能必须对剂量作出某些改变，并且在任何情况下，都由医师决定个体患者的合适剂量。给药剂量是指不包括载体重量在内(当使用载体时)的化合物的重量。一般来讲，本发明中药学成分的使用剂量是本领域技术人员公知的。可以根据本发明化合物组合物中最后的制剂中所含有的实际药物数量，加以适当的调整，以达到其治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。可以是单一剂量形式给药或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药；这受限于给药医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用并调整剂量。去亚甲基小檗碱既是药用植物芸香科植物黄柏中存在的天然产物，又是小檗碱在体内肝脏中的代谢产物，天然环保，无毒高效。本发明提供了盐酸去亚甲基小檗碱在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎药物中的作用和用途。术语COX-2：环加氧合酶-2CyclophilinA(PeptidylprolylIsomeraseA)：肽酰脯氨酰异构酶A(亲环素A)DAI：疾病活动指数DMB：盐酸去亚甲基小檗碱DSS：硫酸葡聚糖钠IG：灌胃iNOS：诱导型一氧化氮合酶IL-1β：白细胞介素-1βMPO：髓过氧化物酶NLRP3：NOD样受体3UC：溃疡性结肠炎附图说明图1DMB抑制RAW264.7细胞中由LPS和ATP诱导产生的ROS图2DMB抑制RAW264.7细胞中由LPS和ATP诱导产生的促炎基因IL-1β、iNOS、COX-2和NLPR3的表达图3DMB预防性治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织形态图图4DMB预防性治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织微结构图A：正常小鼠结肠组织HE染色图(×200)；B：急性结肠炎模型小鼠结肠组织HE染色图(×200)；C：L-DMB，75mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)；D：M-DMB，150mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)；E：H-DMB，300mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)；图5DMB治疗DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠治疗模型结肠形态图图6DMB治疗DSS诱导的溃疡性小鼠结肠组织微结构图A：正常小鼠结肠组织HE染色图(×200)；B：急性结肠炎模型小鼠结肠组织HE染色图(×200)；C：M-DMB，150mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)；D：H-DMB，300mg/kg组小鼠肝组织HE染色图(×200)具体实施方式下面的实施例可以帮助本领域的技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。一、生物活性试验实施例1.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)细胞水平的抗氧化活性方法：通常机体在生理状态下拥有一套完整的抗氧化防御系统，但是当抗氧化系统消弱或ROS形成过量，ROS可以引起机体的一系列损伤。大量的研究显示，在溃疡性结肠炎患者的胃肠道炎症中渗透大量炎症细胞，包括巨噬细胞和中性粒细胞等，通过产生反应性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)而将炎症肠道暴露于氧化应激中。RAW264.7细胞为小鼠腹腔单核巨噬细胞白血病细胞，保留腹腔巨噬细胞的分泌炎症因子的作用特性，加LPS和ATP刺激后可产生大量的ROS，而过度的ROS能诱导炎症的级联反应，所以能很好模拟体外水平药物对结肠炎症因子抑制作用。本实验用ROS探针法，细胞水平检测盐酸去亚甲基小檗碱对ROS的清除作用。脂多糖LPS(100ng/ml)刺激巨噬细胞株(RAW264.7)6h后，即可产生大量ROS(ReactiveOxygenSpecies)损伤细胞。细胞培养液中给予盐酸去亚甲基小檗碱(20μM，80μM)预处理2h，利用荧光探针DCFH-DA(50uM)与ROS结合产生荧光的性质，荧光显微镜下观察盐酸去亚甲基小檗碱对ROS的清除作用。结果：荧光显微镜分析法显示20μM，80μMDMB能显著性抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞中产生的ROS，如图1所示。盐酸去亚甲基小檗碱抗氧化活性为开展对溃疡性结肠炎的研究提供了药理作用基础。实施例2.盐酸去亚甲基小檗碱(DMB)细胞水平的抗炎活性方法：溃疡性结肠炎为一病因未明的慢性结肠炎炎症病变，临床以慢性反复发作或持续性下腹痛、腹泻、粘液和脓血便为主要表现。有研究提示：UC患者的肠上皮细胞和黏膜固有层的单核巨噬细胞分泌大量炎性细胞因子。这些细胞因子在UC患者结肠黏膜中的表达变化跟其在血清中的表达变化基本吻合。体外研究盐酸去亚甲基小檗碱抗炎活性，将为开展DMB治疗UC提供了理论基础。本实施例中，以RAW264.7为研究对象，用RT-PCR法，从细胞水平检测盐酸去亚甲基小檗碱抗炎作用。脂多糖LPS(100ng/ml)刺激巨噬细胞株(RAW264.7)3h，5mMATP刺激30min后，即可增加促炎症因子如诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、白介素1β(IL-18)、环加氧合酶(COX-2)和NOD样受体3(NLRP3)。细胞培养液中给予盐酸去亚甲基小檗碱(40μM)预处理2h，利用RT-PCR法，研究盐酸去亚甲基小檗碱对促炎因子的抑制作用。结果：RT-PCR法显示，40μMDMB能显著性抑制脂多糖在RAW264.7细胞中产生的促炎因子，结果如图2所示(图中，*是都与模型组比，测量值的单位是以CyclophilinA为内参基因的相对表达量)。二、药理实验实施例3.DMB预防性治疗降低DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠死亡率方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为五组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，75mg/kg，IG)、中剂量给药组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。给药组灌胃给药DMB，每天一次，共14天，其余各组给予同体积的赋形剂。给药第八天除正常对照组外，模型组和给药组自由饮用3％DSS水造模七天，造模结束后第四天，处死，记录实验期间小鼠的死亡数目。结果：模型组小鼠造模期间至实验结束，死亡率高达37.5％，给药组除低剂量外，中剂量组和高剂量组均无小鼠死亡，如表1所示。表1DMB预防性治疗对小鼠死亡率的影响实施例4.DMB预防性治疗可减缓DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重下降方法：溃疡性结肠炎患者，由于病情反复发作，病程长，体重下降明显。本实验观察盐酸去亚甲基小檗碱对通过DSS造模小鼠的体重下降有无减缓或抑制作用，从表观水平评价药物是否有效。雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为五组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，75mg/kg，IG)、中剂量给药组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。给药组灌胃给药DMB，每天一次，共14天，其余各组给予同体积的赋形剂。给药第八天除正常对照组外，模型组和给药组自由饮用3％DSS水造模七天，造模结束后第四天，处死，每天记录体重。结果：模型组小鼠体重(从造模结束后第一天开始)明显下降，给药组高剂量能明显减缓肠炎所造成的小鼠体重下降，基本维持正常水平，中剂量对小鼠的体重也有一定的保护作用，但低剂量效果并不明显，如表2所示。表2DMB预防性治疗对结肠炎小鼠体重(克)的保护作用(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例5.DMB预防性治疗能降低DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠活动指数方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为五组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，75mg/kg，IG)、中剂量给药组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。给药组灌胃给药DMB，每天一次，共14天，其余各组给予同体积的赋形剂。给药第八天除正常对照组外，模型组和给药组自由饮用3％DSS水造模七天，造模结束后第四天，处死。DAI(diseaseactivityindex)，即疾病活动指数。实验期间，每日观察小鼠的体重、大便性状和隐血情况，将体重下降、大便性状和隐血情况的评分相加，得出每只小鼠的DAI，以评估疾病活动情况。结果：如表3所示，模型组小鼠体重从造模第5天疾病活动指数开始明显上升，给药组各剂量组能明显减小疾病活动指数。表3DMB预防性治疗对结肠炎小鼠DAI指数的影响(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，**/p＜0.001vsmodel)实施例6.DMB预防性治疗对DSS诱导的溃疡性结肠炎结肠肠壁的保护作用方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为五组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，75mg/kg，IG)、中剂量给药组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。给药组灌胃给药DMB，每天一次，共14天，其余各组给予同体积的赋形剂。给药第八天除正常对照组外，模型组和给药组自由饮用3％DSS水造模七天，造模结束后第四天，摘眼球放血，处死，取结肠组织，称量结肠重量，测量结肠长度。结果：如表4所示，模型组结肠组织萎缩，肠壁增厚，而DMB给药组，除低剂量组(L-DMB，75mg/kg，IG)外，中剂量组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量(H-DMB，300mg/kg，IG)组，均能显著降低结肠炎引起的结肠组织萎缩，肠壁增厚。由此可见，DMB具有明显的抗急性结肠炎的作用。表4DMB预防性治疗对结肠炎小鼠结肠的保护作用(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例7.DMB预防性治疗对DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠胸腺的保护作用方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为五组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，75mg/kg，IG)、中剂量给药组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。给药组灌胃给药DMB，每天一次，共14天，其余各组给予同体积的赋形剂。给药第八天除正常对照组外，模型组和给药组自由饮用3％DSS水造模七天，造模结束后第四天，摘眼球放血，处死，取出小鼠的脾脏和胸腺，称重。结果：如表5所示，模型组胸腺组织出现萎缩，脏器体重比下降，而DMB给药组，除低剂量组(L-DMB，75mg/kg，IG)外，中剂量组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量(H-DMB，300mg/kg，IG)组，能显著改善结肠炎引起的胸腺组织萎缩的现象。表5DMB预防性治疗对结肠炎小鼠胸腺与体重的比值(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例8.DMB预防性治疗可降低DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠结肠MPO水平方法：髓过氧化物酶(MPO)一般作为评价肠炎症程度的重要指标，是每升10％结肠匀浆液在37C的反应体系中H2O2被分解1μmol为1个活力单位。在DSS诱导的急性溃疡性结肠炎模型中，其活性反映中性粒细胞的浸润。本研究采用雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为五组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，75mg/kg，IG)、中剂量给药组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。给药组灌胃给药DMB，每天一次，共14天，其余各组给予同体积的赋形剂。给药第八天除正常对照组外，模型组和给药组自由饮用3％DSS水造模七天，造模结束后第四天，摘眼球放血，处死，不同小鼠取同一部位结肠组织，于冰浴上以生理盐水制成10％的结肠匀浆液，离心后取上清，按照南京建成试剂盒说明，测定肝组织中髓过氧化物酶MPO水平。结果：与对照组相比，模型组小鼠的髓过氧化物酶MPO升高46.7％。而DMB给药组，无论是低剂量组(L-DMB，75mg/kg，IG)、中剂量组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量(H-DMB，300mg/kg，IG)组，均能显著降低MPO并恢复至正常水平。研究结果表明DMB具有降低髓过氧化物酶MPO水平，起到抗炎的作用，如表6所示。表6DMB预防性治疗对结肠炎小鼠结肠部位MPO生成的影响(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例9.DMB预防性治疗可保护DSS诱导溃疡性结肠炎结肠病理组织损伤方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为五组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，75mg/kg，IG)、中剂量给药组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。给药组灌胃给药DMB，每天一次，共14天，其余各组给予同体积的赋形剂。给药第八天除正常对照组外，模型组和给药组自由饮用3％DSS水造模七天，造模结束后第四天，摘眼球放血，处死，不同小鼠取同一部位结肠组织，以10％的中性福尔马林液固定，HE染色进行病理学检查。所有形态改变根据组织学损伤评分标准进行评分，组织学损伤程度用炎症、病变深度、隐窝破坏评分与病变范围计分的和表示，算出均分。结果：结肠病理学研究表明，模型组各例结肠组织结构紊乱，隐窝及腺体缺失，炎症累及黏膜层和黏膜下层，而盐酸去亚甲基小檗碱预防给药组高剂量，结肠病变范围和程度较模型组明显减轻，给药组中剂量也能部分改善，结肠组织形态和HE染色图分别见图3和图4所示，相关病理评分如表7所示。表7DMB预防性治疗小鼠结肠炎组织病理学评分(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例10.DMB治疗可减缓DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠体重下降方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为四组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。自由饮用3％DSS水造模七天，给药组灌胃给药DMB，给药从造模第四天至造模结束后第三天结束，共七天，其余各组给予同体积的赋形剂。实验第十一天，摘眼球放血，处死，每天记录小鼠体重的变化。结果：如表8所示，模型组小鼠体重从造模结束后第一天开始明显下降，给药组高剂量能明显减缓肠炎所造成的小鼠体重下降，但低剂量效果并不明显。表8DMB治疗对结肠炎小鼠体重(克)的影响(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例11.DMB治疗能减小DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠疾病活动指数方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为四组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。自由饮用3％DSS水造模七天，给药组灌胃给药DMB，给药从造模第四天至造模结束后第三天结束，共七天，其余各组给予同体积的赋形剂。实验第十一天，摘眼球放血，处死。实验期间，每日观察小鼠的体重、大便性状和隐血情况，将体重下降、大便性状和隐血情况的评分相加，得出每只小鼠的DAI，以评估疾病活动情况。结果：模型组小鼠体重从造模第5天疾病活动指数开始明显上升，给药组各剂量组从第7天能明显减小疾病活动指数，如表9所示。表9DMB治疗对结肠炎小鼠DAI评分的影响(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例12.DMB治疗可保护DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为四组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。自由饮用3％DSS水造模七天，给药组灌胃给药DMB，给药从造模第四天至造模结束后第三天结束，共七天，其余各组给予同体积的赋形剂。实验第十一天，摘眼球放血，处死，取结肠组织，称量结肠重量，测量结肠长度。结果：模型组结肠组织均出现萎缩，结肠肠壁增厚，无论是低剂量组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量(H-DMB，300mg/kg，IG)组，均能显著改善结肠炎引起的结肠组织均出现萎缩，结肠肠壁增厚的现象，如表10所示。表10DMB治疗对结肠炎小鼠结肠长度和结肠重量的影响(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例13.DMB治疗可保护DSS诱导溃疡性结肠炎小鼠胸腺方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为四组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。自由饮用3％DSS水造模七天，给药组灌胃给药DMB，给药从造模第四天至造模结束后第三天结束，共七天，其余各组给予同体积的赋形剂。实验第十一天，摘眼球放血，处死，取脾脏和胸腺，称重，计算脏器体重比。结果：如表11所示，模型组胸腺组织出现萎缩，脏器体重比下降，无论是中剂量组(M-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量(H-DMB，300mg/kg，IG)组，能显著改善结肠炎引起的胸腺组织萎缩的现象。表11DMB治疗对结肠炎小鼠胸腺组织的影响(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例14.DMB治疗可降低DSS诱导溃疡性结肠炎结肠中MPO活性方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为四组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。自由饮用3％DSS水造模七天，给药组灌胃给药DMB，给药从造模第四天至造模结束后第三天结束，共七天，其余各组给予同体积的赋形剂。实验第十一天，摘眼球放血，处死，不同小鼠取同一部位结肠组织，于冰浴上以生理盐水制成10％的结肠匀浆液，离心后取上清，按照南京建成试剂盒说明，测定肝组织中髓过氧化物酶MPO水平。结果：与对照组相比，模型组小鼠的髓过氧化物酶MPO升高46.7％，而DMB给药组，无论是低剂量组(L-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量(H-DMB，300mg/kg，IG)组，均能显著降低MPO并接近正常水平。研究结果表明DMB能降低髓过氧化物酶MPO，起到抗炎的作用，如表12所示。表12DMB治疗对结肠炎小鼠结肠组织MPO的影响(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)实施例15.DMB治疗保护DSS诱导的结肠炎病理组织学改变方法：雌性C57BL/6小鼠，体重18-22克，随机分为四组，每组7只，分别为正常对照组(control)、DSS模型组(model)、DMB低剂量给药组(L-DMB，150mg/kg，IG)和高剂量给药组(H-DMB，300mg/kg，IG)。自由饮用3％DSS水造模七天，给药组灌胃给药DMB，给药从造模第四天至造模结束后第三天结束，共七天，其余各组给予同体积的赋形剂。实验第十一天，摘眼球放血，处死，不同小鼠取同一部位结肠组织，不同小鼠取同一部位结肠组织，以10％的中性福尔马林液固定，HE染色进行病理学检查。所有形态改变根据组织学损伤评分标准进行评分，组织学损伤程度用炎症、病变深度、隐窝破坏评分与病变范围计分的和表示，算出均分。结果：结肠病理学研究表明，模型组各例结肠组织结构紊乱，隐窝及腺体缺失，炎症累及黏膜层和黏膜下层，而盐酸去亚甲基小檗碱预防给药组高剂量，结肠病变范围和程度较模型组明显减轻，给药组中剂量也能部分改善，组织形态图和HE染色图见图5和图6所示，相关的病理评分如表13所示。表13DMB治疗对结肠炎小鼠结肠组织病理组织学评分的影响(n＝7，mean±variance.*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001vsmodel)