抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR单区抗体及其制备方法

抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶Sj TGR单区抗体及其制备方法
【专利摘要】抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR单区抗体及其制备方法，属于生物技术的分子生物学、免疫学及药学【技术领域】。本发明提供了一种展示抗SjTGR蛋白的单区抗体的重组噬菌体展示库、抗SjTGR蛋白的单区抗体及其制备方法，所述的抗SjTGR单区抗体能与SjTGR蛋白特异性结合，和/或具有抑制SjTGR酶活性，可用于制备治疗血吸虫病的新药或治疗用药物的靶向载体。本发明为开发新的血吸虫病治疗药物及新的治疗方法奠定了良好的基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。
【专利说明】抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶Sj TGR单区抗 体及其制备方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及采用免疫学技术及噬菌体展示技术构建能展示抗Sj TGR蛋白单区抗 体的重组噬菌体展示库，并从中筛选能展示能与Sj TGR蛋白结合的重组噬菌体，采用基因 工程技术制备和纯化重组抗S j TGR蛋白的单区抗体，该抗体可与S j TGR蛋白结合和/或抑 制Sj TGR酶活性，可破坏血吸虫生理代谢过程中的氧化还原平衡，导致血吸虫死亡。该抗体 还可作为Sj TGR酶活性化学抑制剂的靶向载体，适用于新的血吸虫病治疗药物及靶向治疗 方法的开发研究，属于生物技术的分子生物学、免疫学及药学等【技术领域】。

【背景技术】
[0002] 血吸虫病是一种严重危害人类健康的人畜共患病，全球有76个国家有血吸虫病 流行，有约6亿人口受到血吸虫感染的威胁，有血吸虫病人2000多万。经过60年不懈努力， 我国仍有约2. 4亿人口受血吸虫感染威胁，有血吸虫病人20余万人，血吸虫病流行的自然 条件依然存在。由于没有预防血吸虫感染的疫苗，血吸虫病的防治目前主要依靠药物治疗。 吡喹酮是当前唯一的血吸虫病治疗药物，由于长期大规模的反复使用，曼氏血吸虫、埃及血 吸虫已出现了抗吡喹酮的耐药株，而在我国流行的日本血吸虫亦出现了对吡喹酮敏感性下 降的现象，给未来血吸虫病防治工作带来了严重的挑战。因此，开发新血吸虫病治疗药物及 治疗方法是当前紧迫的科研任务。
[0003] 生命过程是由一系列的生化代谢过程所组成，在这个过程中，体内许多蛋白分子 被氧化，并产生大量的毒性氧分子。被氧化的物质必须经过还原才能恢复其生物学功能，毒 性氧分子必须被分解才能去除毒性，这样生物体内的氧化还原重新达到平衡，生命活动过 程才能得以延续。一旦这种平衡被破坏就会导致生物死亡。因此，干扰血吸虫生命过程中 一些重要蛋白分子的功能，使其失去活性，则可能破坏血吸虫的某一重要生化代谢过程，导 致血吸虫死亡，达到治疗血吸虫病的目的，是新药开发的有效策略。生命过程中的这些重要 蛋白分子(亦称为生命过程必须的蛋白分子，essential molecules)是新药开发重要的潜在 革巴标分子。
[0004] 已有的研究成果显示血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶（TGR)是血吸虫氧化还原 平衡代谢过程中的一个必须蛋白分子，抑制血吸虫TGR的表达或功能，可导致虫体死亡，是 一个非常有潜力的抗血吸虫感染新药开发靶标，开发抗血吸虫TGR分子酶活性的抑制剂已 成为血吸虫病治疗新药研究的热点。
[0005] 蛋白酶抑制剂包括了化学抑制剂，多肽抑制剂和抗体抑制剂。TGR是存在于细胞 内的蛋白分子，因此，药物必须先进入细胞内才能与TGR分子结合而发挥药效作用。如果通 过能进入细胞内的靶向载体将药物定向传递给细胞内的靶分子，将能有效提高药物的治疗 效果，减少药物用量以及药物的副作用。靶向治疗由于其作用效果的高度特异性和选择性， 已在抗病原感染和抗肿瘤治疗中获得广泛的应用。根据治疗靶标的结构特征，可以选择能 与靶分子特异性结合的抗体分子或配体分子作为靶向载体，而特异性抗体是靶向治疗中使 用最多的靶向载体。利用各种技术制备的抗体已广泛应用于疾病诊断、治疗、免疫干预、科 学研究及工业化生产等领域，显示出巨大的发展前景。在脊椎动物体内，抗体是保护器官免 受病原、恶性细胞和有毒分子侵犯的天然分子，它对靶标分子具有高度的特异性与亲和力。 因此，选择抗体作为治疗药物或治疗药物的靶向载体是非常合理的选择。然而，常规的鼠源 性单克隆抗体在临床治疗中会出现严重的人抗鼠抗体反应（HAMA)，并且存在分子量大、免 疫原性强、穿透力弱和稳定性差等缺点，导致抗体作为治疗药物及靶向载体的应用受到限 制。单区抗体（Single domain antibody),是来源于胳5它、羊5它和S鱼血清中的一种天然缺 失轻链的功能性重链抗体IgG (Heavy chain antibodies，HCAb)的可变区（variable domain of the heavy chain of HCAb, VHH)，又称纳米抗体（Nanobody)。与传统的抗体相比，单区抗 体的特点是：分子量小，大约只有普通抗体的1/10,约15kDa，组织穿透力强，可以进入细胞 内；单区抗体与传统抗体的VH区相似，但其结构和序列均有独特之处，单区抗体的CDR3较 传统IgG的VH CDR3长，可以形成特殊的大型凸环结构，使它更容易结合到酶活性中心所在 的裂隙，或凹穴中，是天然的酶活性抑制剂；此外，它还具有水溶性好、易于在原核生物中进 行表达与生产，性质稳定、能耐高温及酸碱环境、免疫原性低、不易引起排异反应等优点。因 此，单区抗体具备了作为新一代治疗性抗体和靶向载体的潜能。
[0006] 如果制备抗SjTGR蛋白的特异性单区抗体，则该抗体将具备抑制Sj TGR活性的功 能，并能进入细胞内杀灭血吸虫。从理论上讲，抗SjTGR的特异性单区抗体具有治疗血吸虫 病的药学及靶向的双重功能。若以抗Sj TGR单区抗体为载体，将抗Sj TGR的化学抑制剂递 送进入血吸虫的细胞内，则可达到双重杀虫效果，同时还可以降低化学抑制剂的治疗剂量， 从而减轻化学药物的副作用。因此，制备抗Sj TGR的特异性单区抗体，对发展新的抗血吸虫 感染药物及治疗手段具有重要的应用价值。
[0007] 噬菌体展示单区抗体库是将一组编码单区抗体的基因片段插入到与噬菌体M13 的外壳蛋白g III基因的启始信号序列与其琥珀终止密码子之间，由于宿主菌TG1能产生一 种抑制型的tRNA，抑制噬菌体上插入外源性基因和gene3蛋白基因序列之间的琥珀终止密 码子，使插入外源性基因与gene3蛋白基因之间在转译时可以进行通读，从而使插入外源 性蛋白与噬菌体的gill蛋白之间发生融合表达，并一同展示在噬菌体表面。如果将SjTGR 免疫骆驼的全部重链抗体基因插入到噬粒pCANTab5E中，便可构建成一个可能展示免疫骆 驼体内全部的抗SjTGR重链抗体可变区的噬菌体展示库，又称之为抗SjTGR纳米抗体噬菌 体展示库。如果将SjTGR蛋白固定在固相介质(如酶标板）上，使之与噬菌体展示库的全部 噬菌体反应，那么噬菌体库展示抗SjTGR特异性纳米抗体的重组噬菌体便可与固定在固相 介质上的SjTGR蛋白相结合，通过洗涤去除未结合的或结合力弱的噬菌体，便可以获得展 示抗Sj TGR蛋白特异性纳米抗体的重组噬菌体，既而获得编码抗Sj TGR蛋白特异性纳米抗 体的基因，从而可以在体外采用基因工程技术大量生产、制备特异性抗Sj TGR蛋白的纳米 抗体，并使纳米抗体象单克隆抗体一样永生化，可为随后的应用提供源源不断的抗体来源。 噬菌体展示技术将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合起来，实现了由 基因型到表型的转换，是抗体药物开发的一项革命性新技术。
[0008] 目前关于抗SjTGR单区抗体的研究在国内、外均尚未见有报道。本发明以纯化重 组Sj TGR蛋白免疫新疆双峰驼，收集免疫驼白细胞，制备白细胞的cDNA，采用单区抗体基因 特异性引物，通过PCR方法，扩增出编码骆驼抗体可变区(单区抗体)的基因片段。将此基因 片段插入到噬粒载体中，构建重组噬粒库，通过噬菌体拯救，最终形成SjTGR免疫骆驼重链 抗体可变区噬菌体展示库(又称单区抗体噬菌体展示库)。利用纯化的SjTGR蛋白筛选噬菌 体展示库，获得展示抗Sj TGR特异性单区抗体的重组噬菌体，最后通过原核表达的方式制 备纯化的抗Sj TGR单区抗体，为进一步发展基于抗Sj TGR单区抗体的血吸虫病治疗新药与 治疗措施奠定了基础。


【发明内容】

[0009] 本发明目的是构建了一个展示抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR 单区抗体的噬菌体展示库，筛选抗SjTGR蛋白特异性单区抗体，这些单区抗体能与SjTGR蛋 白特异性结合，和/或抑制SjTGR酶活性的功能，可用于血吸虫病治疗新药和治疗药物靶向 载体的研究。
[0010] 本发明的技术方案：一种单区抗体的噬菌体展示库，其含有SjTGR免疫新疆双峰 驼全部的编码单区抗体的基因，可用于筛选和制备抗Sj TGR蛋白单区抗体，以及抗任何其 它抗原分子或表位的特异性单区抗体的筛选和制备。
[0011] 用所述单区抗体的噬菌体展示库筛选和制备的三株抗SjTGR的单区抗体 JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3,其可用于血吸虫病治疗新药的开发和血吸虫病靶 向治疗载体、方法或其它基于此三株单区抗体的免疫检测、免疫干预和免疫治疗的免疫学 应用。
[0012] 抗日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘肽还原酶SjTGR单区抗体的噬菌体展示库，是由 一组含有编码Sj TGR免疫新疆双峰驼全部单区抗体基因的重组噬菌体组成，其中的每一个 重组噬菌体均能在其表面表达一种抗体SjTGR的单区抗体。
[0013] 所述的编码抗SjTGR单区抗体基因来源于采用重组Sj TGR免疫的新疆双峰驼，新 疆双峰驼的免疫系统受到外来Sj TGR刺激后形成产生编码抗SjTGR单区抗体mRNA的血白 细胞。编码抗Sj TGR单区抗体基因 DNA片段在将SjTGR免疫双峰驼血白细胞mRNA反转录 为cDNA后，通过聚合酶链反应扩增而获得。
[0014] 所述的抗SjTGR单区抗体噬菌体展示库是将Sj TGR免疫新疆双峰驼血白细胞中 编码单区抗体的全部基因通过基因重组技术插入到噬粒载体pCANTab5E中，构建重组噬粒 库，该重组噬粒库包涵有编码抗Sj TGR单区抗体的全部基因。然后，将此重组噬粒群转化到 大肠杆菌TG1中，在辅助噬菌体M13K07的协助下包装成完整的噬菌体，形成一个能在表面 展示抗SjTGR全部单区抗体的噬菌体展示库。
[0015] 所述的用于构建噬菌体展不库的优选噬粒载体是pCANTab5E，包括但不限于载体 pCANTab5E。
[0016] 所述的抗SjTGR单区抗体噬菌体的展示库的应用，包括但不局限于用于筛选展示 抗Sj TGR特异性单区抗体的噬菌体，亦可以用于抗其它抗原、配体分子的特异性单区抗体 的筛选。所述的其它抗原、配体分子包括但不局限于大分子的有机化合物、无机化合物及其 结合物。
[0017] 所述的三株抗Sj TGR蛋白特异性单区抗体的名称分别为JiroYYNA-l、JIPDYYNA-2 及 JIPDYYNA-3。
[0018] 所述的单区抗体JiroYYNA-Ι分子的氨基酸序列与SEQ ID NO. 1保持有至少90%的 同源性。
[0019] 所述的单区抗体JiroYYNA-1分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID NO :4。
[0020] 所述的单区抗体JIH)YYNA-2分子的氨基酸序列与SEQ ID NO. 2保持有至少90%的 同源性。
[0021] 所述的单区抗体JIH)YYNA-2分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID N0 :5。
[0022] 所述的单区抗体JIH)YYNA-3分子的氨基酸序列与SEQ ID NO. 3保持有至少90%的 同源性。
[0023] 所述的单区抗体JITOYYNA-3分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID N0 :6。
[0024] 所述的抗SjTGR的单区抗体包括但不局限于由本发明三株单区抗体JiroYYNA-1、 JiroYYNA-2及JiroYYNA-3的氨基酸序列演变而产生的其它的具有与SjTGR结合，和/或抑 制Sj TGR活性的单区抗体。
[0025] 本发明用于筛选上述三株单区抗体的蛋白为重组日本血吸虫硫氧还蛋白谷胱甘 肽还原酶（SjTGR)硒蛋白。
[0026] 所述的SjTGR蛋白分子的氨基酸序列SEQ ID N0 :7,保持有至少90%的同源性。
[0027] 所述的SjTGR蛋白分子，其基因核苷酸序列编码为SEQ ID N0 :8。
[0028] 本发明提供一种筛选展示抗Sj TGR特异性单区抗体的噬菌体展示方法。具体地， 以纯化的重组SjTGR包被酶标板，再与本发明构建的单区抗体噬菌体展示库的重组噬菌体 进行结合，用洗涤液洗出未结合或结合弱的噬菌体，再用〇. 1M甘氨酸溶液（pH2. 2)洗脱与 重组SjTGR特异性结合的噬菌体。将洗脱噬菌体感染大肠杆菌TG1，在辅助噬菌体的协助下 扩增洗脱的噬菌体。以同样的方法重新进行筛选，如此重复筛选三次，最后获得能表达与重 组Sj TGR蛋白特异性结合的单区抗体的重组噬菌体。
[0029] 本发明还提供一种鉴定重组噬菌体中编码抗Sj TGR蛋白特异性单链抗体的外源 性基因 DNA序列，及单区抗体氨基酸序列的鉴定方法。
[0030] 具体地，制备能与重组Sj TGR蛋白特异性结合噬菌体DNA，通过DNA序列分析确定 噬菌体中编码单区抗体的外源性基因序列，再演绎成肽氨基酸序列。通过与Genbank中已 经存在的蛋白质或多肽的氨基酸序列进行比对，确定该噬菌体表达的单区抗体的性质。
[0031] 本发明提供一种原核表达单区抗体JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2及JIPDYYNA-3的表 达质粒构建方法及工程菌构建方法。
[0032] 具体地，首先设计合成用于扩增编码单区抗体JiroYYNA-1、JiroYYNA-2及 JiroYYNA-3的基因特异性引物，然后采用PCR方法从重组噬菌体基因组DNA中扩增出 编码单区抗体 JIPDYYNA-1、JIPDYYNA-2 及 JIPDYYNA-3 的 DNA 片段 SEQ ID N0 :4、5 及 6。然后将SEQ ID N0:4、5及6插入到一种表达载体pET-28a ( + )中形成重组表达质粒 JIPDYYNA-l-pET28a、JIPDYYNA-2-pET28a 及 JIPDYYNA-3-pET28a，然后将重组表达质粒 JIPDYYNA-l-pET28a、JIPDYYNA-2-pET28a 及 JIPDYYNA-3-pET28a 分别转化入一种宿主细胞 大肠杆菌BL21 (DE3)中表达重组单区抗体蛋白JIH)YYNA-1、JIPDYYNA-2及JIH)YYNA-3。
[0033] 本发明优选的表达质粒是pET28a ( + )(美国Novagen公司产品），适合在大肠杆 菌工程菌中表达。但是，本发明中的三株单区抗体JIH)YYNA-l、JIPDYYNA-2及JIH)YYNA-3 蛋白也可选择利用其它质粒来表达，这些表达质粒包括但是不局限于原核、真核表达系统 常用的质粒。
[0034] 具体地，该重组表达质粒含有适当的启动子，用以控制融合蛋白的表达。这些启动 子包括但是不局限于以下所述的tac启动子，优选的启动子为T7。
[0035] 所述的重组单区抗体JiroYYNA-1、JIPDYYNA-2及JiroYYNA-3蛋白的制备方法，包 括转录、翻译、蛋白分离和纯化，以及鉴定步骤。
[0036] 重组单区抗体的表达，可以通过一般的蛋白生化手段检测，包括但不局限于：酶学 分析，SDS-PAGE，Western Blotting 等。
[0037] 本发明提供一种纯化原核表达的重组单区抗体JiroYYNA-1、JITOYYNA-2及 JIH)YYNA-3蛋白的方法。
[0038] 具体地，在构建重组表达载体时将此三株单区抗体编码基因的5'端与表达载体 pET28a ( + )上编码6个组氨酸（6Xhis)的基因序列相融合，使表达得出来的单区抗体 JiroYYNA-l、JIPDYYNA-2及JIH)YYNA-3的氨基端均带有一个由6个组氨酸组成的标签，然 后利用此6个组氨酸标签能与金属离子结合的特点，采用镍离子亲和层析的方法纯化和制 备三株单区抗体。
[0039] 本发明提供一种原核表达单区抗体驼源性的鉴定方法。
[0040] 具体地，将单区抗体表达细菌裂解液点在硝酸纤维素膜上，再与HRP标记的抗驼 IgG二抗反应，用DAB显色，观察重组表达的单区抗体是否能被抗驼二抗所识别。
[0041] 本发明提供一种鉴定原核表达单区抗体与重组Sj TGR蛋白结合能力的方法。
[0042] 具体地，通过SDS-PAGE及电转移方法分别将重组表达单区抗体JiroYYNA-1、 JiroYYNA-2及JiroYYNA-3蛋白条带转移到硝酸纤维素（NC)膜上，再将含有单区抗体蛋白 条带的NC膜与纯化的Sj TGR蛋白反应，洗去未结合的Sj TGR蛋白后，再与鼠抗Sj TGR血 清反应，用HRP标记抗鼠 IgG二抗检测，经化学发光显色，观察重组表达的单区抗体与重组 Sj TGR蛋白的反应情况，以判断单区抗体与Sj TGR蛋白结合的能力。
[0043] 本发明提供一种测定重组单区抗体对Sj TGR蛋白的硫氧还蛋白还原酶活性抑制 效果的分析方法。
[0044] 具体地，硫氧还蛋白还原酶（TrxR)活性的测定方法是将5-联硫代-双-2-硝基苯 甲酸（DTNB)与还原型辅酶I (NADPH)混合，在有TGR存在的情况下，DTNB可被还原为5-巯 基-2-硝基苯甲酸（TNB)，通过测定反应体系中TNB在波长为412 nm处吸收值的增加值来 确定Sj TGR的TrxR的活性。在上述体系中加入一定数量的纯化单区抗体，观察其对SjTGR 蛋白硫氧还蛋白还原酶活性的抑制作用。
[0045] 本发明的有益效果：本发明构建的抗Sj TGR单区抗体噬菌体展示库包涵有新疆双 峰驼全部单区抗体的编码基因，可用于抗任何抗原分子的特异性单区抗体的筛选与制备。 筛选和制备的三株单区抗体能特异性地与日本血吸虫生存必须蛋白分子-硫氧还蛋白谷 胱甘肽还原酶（SjTGR)结合，其中单区抗体JIH)YYNA-3对Sj TGR的硫氧还蛋白还原酶具有 抑制作用，为开发新的血吸虫病治疗药物及血吸虫病治疗药物的靶向载体奠定了良好的 基础，对控制血吸虫病流行有重要的意义。

【专利附图】

【附图说明】
[0046] 图1纯化骆驼抗Sj TGR抗体IgG的SDS-PAGE分析，Μ蛋白分子量标志物；1健康 骆驼血清；2 40%饱和硫酸铵沉淀骆驼免疫球蛋白。
[0047] 图2 PCR扩增编码重链抗体IgG2、IgG3可变区基因，M、lkb标准DNA分子量标志 物；l、IgG2可变区基因的PCR产物；2、IgG3可变区基因的PCR产物。
[0048] 图3重组噬粒VHHn-pCANTab5E双酶切分析，M、lkb标准DNA分子量标志物；1-20、 20个重组噬粒的Sfil/Notl双酶切产物。
[0049] 图4抗Sj TGR纳米抗体噬菌体库筛选噬菌体淘洗回收率。
[0050] 图5第三轮淘洗洗脱噬菌体DNA的限制性酶切分析，Μ、1 kb标准DNA分子量标志 物；1-10、10个噬粒DNA的Sfil/Notl双酶切产物。
[0051] 图6三株纳米抗体的氨基酸序列比对 图7编码纳米抗体基因的扩增，M、100 bp DNA分子量标志物；1、JIH)YYNA-1扩增产物； 2、JIH)YYNA-2 扩增产物；3、JIH)YYNA-3 扩增产物。
[0052] 图 8 重组质粒 JIPDYYNA-l-pET28a，JIPDYYNA-2-pET28a，JIPDYYNA-3-pET28a 的 酶切分析，Μ、100 bp DNA分子量标志物； 1、 重组的JIPDYYNA-l-pET28a质粒经Ndel/Notl双酶切产物； 2、 重组的JIPDYYNA-2-pET28a质粒经Ndel/Notl双酶切产物； 3、 重组的JIPDYYNA-3-pET28a质粒经Ndel/Notl双酶切产物。
[0053] 图9重组纳米抗体表达产物的分析，A :M、蛋白分子量标准；1、不含质粒的 大肠杆菌BL21表达产物；2、含空质粒pET28a⑴的大肠杆菌BL21表达产物；3、含 JiroYYNA-l-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的全菌；4、含JiroYYNA-l-pET28a质粒 的大肠杆菌BL21表达产物的上清；5、含JiroYYNA-l-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产 物的沉淀；6、含JiroYYNA-2-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的全菌；7、含JITOYYNA -2-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的上清；8、含JiroYYNA-2-pET28a质粒的大肠杆 菌BL21表达产物的沉淀。
[0054] B :M蛋白分子量标准；1、不含质粒的大肠杆菌BL21表达产物；2、含空质粒 pET28a的大肠杆菌BL21表达产物；3、含JiroYYNA-3-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表 达产物的全菌；4、含JITOYYNA-3- pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的上清；5、含 JiroYYNA-3-pET28a质粒的大肠杆菌BL21表达产物的沉淀。
[0055] 图10重组纳米抗体蛋白的纯化，M、蛋白质分子量标志物；1、纯化的重组 JITOYYNA-1蛋白；2、纯化的重组JITOYYNA-2蛋白；3、纯化的重组JITOYYNA-3蛋白。
[0056] 图11重组VHH的驼源性验证，1、重组JITOYYNA-1表达菌裂解液；2、重组 JITOYYNA-2表达菌裂解液；3、重组JIH)YYNA-3表达菌裂解液；4、BL21菌裂解液；5、骆驼血 清。
[0057] 图12免疫印迹分析重组纳米抗体与Sj TGR的相互作用，M、蛋白质分子量标志物； 1-3、纯化的重组JIH)YYNA-1蛋白、JIH)YYNA-2蛋白及JIH)YYNA-3蛋白与Sj TGR反应，用 鼠抗Sj TGR抗体及HRP标记羊抗小鼠二抗检测；4、纯化的重组JITOYYNA-Ι蛋白不与S jTGR 反应，用鼠抗Sj TGR抗体与羊抗小鼠二抗检测。
[0058] 图13 JIH)YYNA-1与Sj TGR不同比例的混合物对Sj TGR酶活性的抑制作用。
[0059] 图14 JIH)YYNA-2与S j TGR不同比例的混合物对S j TGR酶活性的抑制作用。
[0060] 图15 JiroYYNA-3与Sj TGR不同比例的混合物对Sj TGR酶活性的抑制作用。 [0061] 下面提供的实施例可以详细地解释本发明的主要内容，但不局限于以下这些内 容。
[0062] 实施例1 :重组Sj TGR蛋白免疫新疆双峰驼及血清抗体的制备 免疫前经驼颈静脉采血，分离血清，低温保存备用。首次免疫以重组纯化Sj TGR蛋白 (500 μ g)完全福氏佐剂抗原，经皮下多点注射新疆双峰驼的颈部皮肤，随后用同剂量不完 全佐剂抗原进行加强免疫，免疫间隔为2周，共加强免疫4次。未次免疫后2周，经骆驼颈静 脉采血50 mL，分离血清。以重组Sj TGR蛋白的碳酸缓冲液（10 μ g/mL)包被酶标板，4°C过 夜，第二天用5%的脱脂奶粉PBS封闭，37°C 2h，再与倍比稀释的免疫驼血清反应，再与HRP 标记的兔抗骆驼IgG二抗反应，用底物TMB显色，测定Sj TGR免疫新疆双峰驼血清Sj TGR 蛋白抗体的效价。
[0063] 按以下方法进行骆驼血清抗体IgG的纯化。使用医用采血针采集免疫前青年雌性 新疆双峰，4 ?过夜析出血清。根据HananM. EL-Hewairy法使用40%饱和硫酸铵沉淀出胳 驼总抗体IgG，纯化过程如下： 1)取骆驼血清5 mL用生理盐水稀释至50 mL，加入33. 3 mL饱和硫酸铵，逐滴加入并进 行搅拌。
[0064] 2)将烧杯放置4°C静置过夜析出免疫球蛋白。
[0065] 3)以3500 rpm, 4 °C离心20 min,弃上清，沉淀用20 mL生理盐水溶解。
[0066] 4)将溶解的蛋白溶液放入透析袋中，用1XPBS进行透析，4 °C磁力搅拌，每2 h 更换一次透析液，向透析液中滴加1%氯化钡溶液，检测透析液中是否有硫酸铵存在，直至 透析液中加入氯化钡不产生白色雾状物，表示硫酸铵已透析干净。
[0067] 6)取少量透析后样本进行12% SDS-PAG电泳，观察纯化效果。
[0068] 结果：经过5次免疫骆驼血清中抗SjTGR蛋白抗体的效果达到1 : 12800,表明免 疫获得成功。经过饱和硫酸铵沉淀，制备了纯化的骆驼抗SjTGR抗体IgG。如图1所示。
[0069] 实施例2 :编码骆驼抗Sj TGR纳米抗体基因片段的制备 以1000 rpm离心Sj TGR免疫胳骑抗凝血10 min,分离血楽和血细胞。采用percoll (GE Health产品）配制比重为1. 07的骆驼白细胞分离液，将抗凝血细胞加于白细胞分离液的上 层，以3000 g的转速在4 °C离心30 min，收集界面的白色细胞层于一新的无菌离心管中，力口 入无菌PBS悬浮并洗涤细胞，1000 rpm离心10 min，去上清，再加入PBS，如此反复洗涤细胞 3次，收集细胞沉淀，并计数。
[0070] 采用Trizol抽提Sj TGR免疫骆驼外周血白细胞总RNA，方法如下： 1) 取约1X107个Sj TGR免疫新疆双峰驼外周血白细胞，按Trizol说明书要求的比例 加入相应体积的Trizol,用无菌枪头混勻数次； 2) 室温放置5 min，让细胞核蛋白复合体完全解离； 3) 按1 mL Trizol试剂加入0. 2 mL氯仿的比例向裂解液中加入氯仿，盖紧盖子； 4) 剧烈晃动试管15 Sec，室温孵育2-3 min ; 5) 将样品4°C、12000 g离心15 min，离心后液体分为3层，底层是红色酚-氯仿层，中 间层和无色上层液相，RNA完全存在于上层水相中； 6) 将上层液小心转移至一个新的离心管中； 7) 加10 μ g无 RNA酶的糖原和醋酸钾（3M)，混勻，再加入2倍体积的冷无水乙醇，混 匀后，-20 °C沉淀过夜； 8) 以4 °C、12000 g离心10 min，去上清(此时可见RNA白色沉淀）； 9) 用75%乙醇洗涤沉淀2次，再以4 °C、12000 g离心10 min。尽量去净上清； 10) 将沉淀在室温中干燥5-10 min至沉淀变至半透明，可加入50 μ LRNase-free水溶 解RNA沉淀。
[0071] 采用磁珠亲和层析法制备Sj TGR免疫骆驼外周血白细胞mRNA，方法按Invitrogen 公司的Dynabeads mRNA纯化试剂盒的说明书。
[0072] 1)将获得的总RNA中加入试剂盒中的Lysis/Binding Buffer,补至总体积为1 mL ； 2) 充分重悬试剂盒中的Oligo (dT) 25磁珠液，吸取lmL磁珠至一个RNase-free的15 mL离心管中，然后将离心管放在磁力器上； 3) 静置至管中液体变清，用移液管吸出管中的液体，将离心管从磁力器上取出，加入1 mL新鲜的Binding Buffer,重悬洗漆磁珠； 4) 将离心管重新放在磁力器上，静置至管中液体变清，然后吸出液体； 5) 从磁力器上取出离心管中加入1 mL样本裂解液重悬磁珠，再将含有总RNA的样本加 入磁珠中，混匀； 6) 在室温下持续轻柔混匀管中的液体10 min，使mRNA的"A尾"与磁珠上的 01igo(dT)25 结合； 7) 将离心管放在磁力器上静置2 min，待管中的液体变清后，吸出液体； 8) 室温下用2 mL Washing Buffer A洗漆2次磁珠/mRNA复合物。用磁力器将磁珠从 洗漆液中分离，吸出Washing Buffer A ; 9) 加入1 mL cDNA第一链合成Buffer洗漆磁珠一次，在磁力作用下分离磁珠，吸出上 清液； 10) 最后加入 50 以1^111衍〇1181^€61'(1〇11111'1^8-!1(：14!17.5)，并在8〇1：孵育211^11， 随即立即放置于磁力器上分离磁珠，并将包含mRNA的上清转移至一个新的RNase-free管 中，并放置于冰上保存； 11) 以Elution Buffer作为空白对照，用Nanodrop 2000紫外核酸蛋白测定仪测量获 得的mRNA的浓度和纯度。
[0073] 使用Pusion? RT-PCR kit合成Sj TGR免疫骆驼白细胞第一链cDNA，操作按照说明 书： 在一无菌〇. 5 mL离心管中加入以下成分： mRNA 10 μ L 01igo (dT) Primer 1 μ L RNase-free H20 4 μ L 总计 15 μ L 混匀后70 °C水浴10 min，然后立即放置冰上，加入以下试剂： 5 X RT Buffer 5 μ L 10mM dNTP Mix 1. 25 μ L RNase-free H20 2. 75 μ L 混匀后37 °C孵育2 min，然后加入1 μ L M-MLV逆转录酶，总体积共25 μ L。
[0074] 将反应管置于42°C保温60 min，随后置80°C加热10 min，终止反应。合成的cDNA 置4°C保存。
[0075] 扩增编抗Sj TGR单区抗体基因的引物设计 根据文献报道的编码骆驼单区抗体基因序列，设计扩增双峰驼两个亚类重链抗体 (IgG2, IgG3)可变区引物，以骆驼重链抗体（HCAb)可变区VHH的前导肽保守序列作为共同 上游引物，并引入Sfil酶切位点，引物序列如下： VHH-P1 :5' -CATGCCATGA CTCGCGGCCC AGCCGGCCGT CCTGGCTGCT CTTCTACAAG G-3'（划线 部分为Sfil酶切位点）。
[0076] 两种亚型HCAb特异的铰链区序列作为下游引物并引入Notl酶切位点，引物序列 分别为： VHH-P2-IgG2 :5'-CGGCACCGGC GCACCTGCGG CCGCCGTGCA TTCTGGTTCA GGTTTTGGTT GTGG-3'（划线部分为 Not 1 酶切位点）；VHH-P3-IgG3 :5'-CGGCACCGGC GCACCTGCGG CCGCCTTGCA TACTTCATTC GTTCC -3'（划线部分为 Not 1 酶切位点）。
[0077] 引物由上海英俊生物技术有限公司合成。
[0078] 编码抗Sj TGR单区抗体基因的扩增 分别以两对引物VHH-P1/VHH-P2 (IgG2);VHH-Pl/VHH-P3 (IgG3)从TGR免疫骆驼血白 细胞cDNA中扩增出编码IgG2、IgG3重链可变区的基因片段，并使之5'、3'端分别带有Sfil、 Notl酶切位点。扩增体系如下： IgG2扩增： 5 Xphusion HF buffer 20 μ L dNTPs(10 mM) 2 μ L VHH-P1 (50 μ M) 2 μ L VHH-P2 (IgG2) (50 μ M) 2 μ L cDNA 模板 10 μ L Phusion高保真酶 1 μ L ddH20 63 μ L 总计 100 μ L 扩增条件如下：98°C、预变性30 s ;98°C、变性10 s，50°C、退火35 s，72°C、延伸40 s，进 行 35 个循环；721：、1〇1^11，41：保存。
[0079] IgG3 扩增： 5 Xphusion HF buffer 20 μ L dNTPs(lOmM) 2 μ L VHH-P1 (50 μ M) 2 μ L VHH-P3(IgG3) (50 μ M) 2 yL cDNA 模板 10 μ L Phusion高保真酶 1 μ L ddH20 63 μ L 总计 100 μ L 扩增条件如下：98°C、预变性30 s ;98°C、变性10 s，55°C、退火35 s，72°C、延伸40 s，进 行35个循环；72°C、10min ;4°C保存。
[0080] 取5 μ L扩增产物进行琼脂糖凝胶（1%)电泳，观察扩增产物状况。
[0081] 编码抗Sj TGR蛋白单区抗体基因 DNA的纯化 将编码IgG2、IgG3重链抗体可变区的PCR产物分别进行低熔点琼脂糖凝胶（NuSieve GTG琼脂糖，1%)电泳，紫外灯下割取含有预期大小的目的DNA片段胶块，置于冰上。用两倍 体积的1 X β琼脂糖酶I buffer浸泡胶条两次，每次30 min，平衡胶条。吸净缓冲液后，将 胶块置65 °C加温融化10 min，然后降温至42°C。向已融化的琼脂糖胶液中加入2 U的β 琼脂糖酶I，在42 °C消化1 h。然后在65 °C加热15 min，失活β琼脂糖酶I。高速离心1 min，将上清液转移到另一干净离心管中。
[0082] 米用 Promega 公司的 PCR 产物纯化试剂盒（Wizard SV Gel and PCR clean-up System)从琼脂糖消化液中纯化编码单区抗体DNA片段，纯化过程如下： 1) 在上述琼脂糖消化液中加入等体积的Membrance Bingding Solution,混勻；将SV Minicolumn 置于 Collection Tube 中； 2) 将样本液和Membrance Bingding Solution的混合物加入到SV Mini column中，室 温静置1 min ; 3) 14,000 rpm离心1 min,将离出的液体倒出，重新放好SV Mini column ; 加 700 μ L 的 Membrane Wash Solution，14,000 rpm 离心 1 min，将离出的液体倒出，重 新放好 SV Mini column ; 4) 再向柱中加入 500 μ L 的 Membrane Wash Solution，14 000 rpm 离心 1 min，将离出的 液体倒出，以相同的转速离心1 min以去除残余的液体； 5) 将 SV Minicolumn置于一干净的 1. 5 mL离心管中，加 50 μ L 的Nuclease-Free Water 到SV Mini column柱的娃胶膜上，室温下放置1 min, 14,000 rpm离心1 min ;收集纯化的目 的基因片段，置_20°C保存；用Nanodrop 2000核酸蛋白测定仪测定纯化DNA片段的浓度与 纯度。
[0083] 结果：使用纯化重组Sj TGR蛋白免疫新疆双峰驼，经过5次免疫，ELISA法检测骆 驼血清抗Sj TGR抗体IgG的水平达到了 1:12800,获得了较好的免疫效果。收集免疫骆驼 外周血液中的白细胞，用Trizol法制备细胞的总RNA，再用Invitrogen公司mRNA磁珠分离 试剂盒纯化mRNA，获得4. 456 μ g免疫骆驼白细胞的mRNA，其0D260/0D280的比值为2. 23。
[0084] 采用NEB的反转录PCR试剂盒中第一链cDNA合成系统，合成了免疫骆驼血白细胞 的第一链cDNA。利用基因特异性引物，以免疫骆驼白细胞cDNA为模板，分别扩增IgG2和 IgG3重链可变区基因片段，均获得分子量约500 bp的DNA片段，如图2。
[0085] 实施例3:抗57 TGR单区抗体噬菌体展示库的构建 采用Sfil和Notl双酶切方法制备线性化噬粒pCANTab5E DNA和酶切编码纳米抗体的 DNA片段，酶切反应体系如下： pCANTab5E DNA 片段 30 μ L 10XBuffer4 5 μ L 100XBSA 0. 5 μ L Notl-HF 1 uL ddH20 2. 5 μ L 总计 49 μ L 混匀离心后，置37°C水浴反应4 h。加入Sfil 1 μ L混匀离心后，置50 °C水浴保温3 h。
[0086] 酶切产物的回收：将上述酶切产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，100 V电压电泳60 min后，观察酶切产物状况。从琼脂糖胶上切下含有目的片段胶块，用Promega公司DNA胶 回收纯化试剂盒纯化双酶切的线性化噬粒pCANTab5E DNA片段。酶切后纳米抗体基因片段 用Promega公司DNA胶回收纯化试剂盒直接进行纯化，方法按操作说明书。用Nanodrop 2000核酸蛋白测定仪测定纯化的线性化噬粒pCANTab5E DNA和纳米抗体DNA片段的浓度与 纯度。
[0087] 连接：采用Lucigen公司的CloneDirect Rapid Ligation Kit进行连接。将双酶切 的纳米抗体IgG2和IgG3 DNA片段和线性化噬粒pCANTab5E DNA按3:1摩尔比混合，在DNA 连接酶的作用下进行连接，连接体系如下： 10 X ligase Buffer 1 μ L VHH DNA 片段 5 μ L pCA NTab5E 3 μ L Clone Smart DNA ligase 1 μ L 总计 10 μ L 反应条件：23 °C水浴孵育2 h，然后在70 °C加热15 min终止反应。
[0088] 为了扩大噬粒库的多样性，本研究分别进行了 5次连接反应，共得到50 μ L连接产 物。
[0089] 浓缩：将50 μ L连接产物用无菌水稀释至300 μ L，加2倍体积无水乙醇，混匀后 置-30 °C沉淀3 h ;在4 °C以12000 g离心30 min，弃上清，在室温干燥5-10 min ;沉淀物用 10 μ L无菌水在4 °C溶解3 h，最后获得约10 μ L的连接产物。
[0090] 转化：采用电脉冲方法将连接产物转化大肠杆菌TG1感受态细胞。方法如下： 1) 将狭缝为〇. 1 cm电击杯和1. 5 mL离心管放在冰上预冷； 2) 从-80 °C取出TG1感受态细胞，放冰上10-15 min待完全解冻； 3) 吸取25 μ L感受态细胞至预冷过的无菌离心管中（置冰上)，加入2 μ L连接产物，用 枪头轻柔搅匀，冰上放置30 min ; 4) 将TG1感受态细胞/DNA混合物从离心管小心转移至电击杯的狭缝中，不要产生气 泡，冰上放置5 min ; 5) 设置电脉冲仪（BI0-RAD)脉冲参数：电压2. 5 kV，电容25 μ F，电阻200 Ω ;将电击杯 插入电脉冲仪电击槽内，同时按住两个脉冲电极保持至放电为止； 6) 取出电击杯，加入0.975 mL 37 °C预热的S0C培养基，混匀后将细菌液转移到一无菌 玻璃试管中，37 °C，120rpm振荡培养1 h ; 7) 以相同的方法重复转化5次，将所有连结产物进行电转化；将转化产物混合后分成6 份分别涂布至6块24X24cm的2XYT平板上（Amp 100 μ g/mL，Glucose 2%);室温下放置， 待平板上的菌液完全吸收后，倒置平板于37 °C培养箱生长过夜； 8) 纳米抗体噬粒库的保存：用10 mL 2XYT培养基将6个培养板上的菌落全部刮洗下 后混合在一起，加入终浓度为20%的无菌甘油，分装成1 mL/支，-80°C保存备用。
[0091] 库容的计算： 1) 取刮洗下的噬粒库菌液10 μ L，用2 XYT培养基做梯度稀释后，分别取100 μ L涂2 XYT板，37°C生长过夜后，取菌落全部为单克隆的平板计数单个克隆数； 2) 以平板上全部单个克隆数乘以稀释倍数，再除以该平板上涂布菌液的体积（mL)则为 重组噬粒库的库容量。
[0092] 噬粒库重组率的鉴定 从平板上随机挑取20个单菌落，转种到3 mL LB液体培养基中37 °C培养过夜，用 Promega公司质粒DNA纯化试剂盒（Promega plasmid Miniprep Kit)抽提质粒，方法按操作 说明书。
[0093] 用限制性内切酶Sfil和Not 1对20个单个菌落中的质粒进行双酶切，分析其重组 率。反应体系如下： 质粒 DNA 10 μ L 10 X NEB Buffer4 2 μ L 100XBSA 0. 2 μ L Notl-HF 1 yL ddH20 6. 8 μ L 总计 19 μ L 混匀离心后，置37 °C水浴箱反应4 h ;再加1 μ L Sfil混匀离心后，置50°C水浴箱反应 过夜。
[0094] 将酶切产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，100 V电泳40 min，凝胶成像仪上观察重组 噬粒DNA的酶切产物是否含有分别与纳米抗体基因片段及线性化pCANTab5E大小相似的 DNA条带，并计算重组率。
[0095] 展示抗57 TGR纳米抗体重组噬菌体的拯救 1) 接种10倍库容量的噬粒库菌液于50 mL 2XYTAG (氨苄100 μ g/mL，葡萄糖20% w/ v)中，37 °C、200 rpm振荡培养，每间隔30 min测0D6QQmi -次，在0D值接近0. 4时，再每20 min 测一次，直至 0D_=0. 4 ; 2) 按感染复数（Μ0Ι) 20:1的比例（即每20个辅助噬菌体感染一个大肠杆菌)在菌液中 加入适量数目的辅助噬菌体M13K07,37 °C、200 rpm继续培养1 h ; 3) 以4000 rpm离心10 min,去上清，细菌沉淀重悬于50 mL 2XYTAK (氨节：100 μ g/ mL，卡那霉素：50 μ g/mL)培养基中，30 °C、200 rpm培养过夜； 4) 第二天，将培养液转移至离心管中，4 °C以8, 000 g离心10 min，然后将上清转移至 一个新的管中，弃沉淀(此时噬菌体在上清液中）； 5) 重新离心上清液，将80%上清液小心转移至一个新管中，并加入1/6体积的 20%PEG/2. 5MNaCl，倒转混匀后4 °C静置沉淀过夜； 6) 将沉淀过夜的液体4 °C以12, 000 g离心15 min，弃上清，再次快速短暂离心后将剩 余液体吸尽，噬菌体为吸附在管壁上的白色沉积物； 7) 用TBS溶解噬菌体沉淀物，室温以14, 000 rpm离心5 min ; 8) 将上清液转移至一个新离心管，加1/6体积的20% PEG/2. 5 M NaCl，冰浴放置1 h，4 ?以14, 000 rpm离心10 min,弃上清，短暂快速离心后吸尽剩余上清； 9) 用TBS重新悬浮沉淀，室温以14, 000 rpm离心1 min，吸取上清至另一新管中，加灭 菌甘油至终浓度为30%，混匀并保存于4 °C ;此即为抗57 TGR单区抗体噬菌体展示库。
[0096] 抗57 TGR单区抗体噬菌体展示库滴度测定，方法如下： 1) 从2XYT板上挑取TG1单个菌落接种至5 mL 2XYT培养基中，37 °C振荡培养至 〇〇600ηιιι ^ 〇· 5 ； 2) 当细菌生长时，将顶琼脂用微波炉融化后，分装9 mL到无菌管中，并保持在45 °C水 浴中； 3) 用预温的2XYT液体培养基连续稀释库噬菌体液，稀释度分别为1 : 103、105、107、 109、10 n、1012 ; 4) 当TG1菌到达对数生长期时，分别取200 μ L加至每个离心管中，每管中加入10 μ L 一个稀释度的噬菌体液，混匀，室温下感染5 min ; 5) 将感染的细菌/噬菌体混合物转移到45 °C预温的顶脂中，颠倒混匀后，快速倾倒37 °C预热的2XYT平板，旋转平板使顶琼脂均匀分布于平板的表面； 平板冷却10 min后，倒置，37 °C培养过夜； 6) 选取平板上噬菌斑独立分布的平板，计数噬菌斑数，并计算噬菌体的滴度（pfu/mL)。
[0097] 结果：将扩增的重链抗体IgG2及IgG3可变区（VHHn)基因片段连接到噬粒载体 pCANTab5E中构建重组噬粒VHHn-pCANTab5E。通过多次电转到宿主菌TG1大肠杆菌中，全 部涂多块2XYT平板后获得存在于宿主菌中的VHHn- pCANTab5E噬粒库。噬粒库的库容量 约为 4. 5X10lclCFU/mL。
[0098] 随机从连接产物转化平板上挑选20个单个菌落，抽提噬粒DNA后进行Sfil/Notl 双酶切，酶切产物的电泳结果显示20个单菌落噬粒DNA经双酶切后，均可产生与骆驼重链 抗体可变区（VHH)大小相似，长度约400-500 bp的插入DNA片段，如图3。提示本次制备的 纳米抗体噬粒库的重组率达100%。
[0099] 以M13K07辅助噬菌体感染纳米抗体噬粒库进行噬菌体拯救，获得展示单区抗体 的重组噬菌体展示库，库的效价为4X 1012 pfu/mL，总体积为8 mL。
[0100] 实施例4 :展示抗TGR单区抗体重组噬菌体的筛选 方法如下：第一轮淘洗 1) 挑取大肠杆菌TG1单个菌落，分别接种于10 mL、20 mL的LB培养基中，37°C剧烈振 摇至对数生长期，用于噬菌体滴度测定和扩增； 2) 将纯化的57 TGR蛋白用0. 1 M NaHC03 (pH 8 . 6)溶液配成浓度为1000 μ g/mL的溶 液，取1 mL (1000 μ g)蛋白溶液包被12孔细胞培养板，4°C过夜； 3) 将包被液倒掉后，在干净的纸上拍干，去除剩余的液体，再在孔中加满封闭液（5%的 脱脂奶粉PBS)，置37°C封闭2 h ; 4) 倒掉封闭液后同法拍干，用TBST (TBS+0. l%[v/V]Tween-20)洗板，洗板6次； 5) 用TBST将噬菌体展示库噬菌体（8X 1013pfu)稀释至1 mL，加入到包被好的板孔中， 室温下轻柔混合，结合60 min ; 6) 倒掉未结合的噬菌体，然后再拍干，去除残余液体； 7) 用TBST洗板10次，再用TBS洗5次。（吸干时每次采用新的纸巾防止交叉污染）； 8) 向孔内加入900 yL甘氨酸液（0. 1M，pH2. 2)在室温中轻轻摇动10 min，洗脱结合 的噬菌体；然后迅速将洗脱液转移到一个新的无菌管中，加入100 μ L TriS-HCl(l mol/L、 ρΗ8· 0)，中和pH至约为7· Ο ; 9) 噬菌体扩增：将洗脱液接种到10 mL对数生长期（OD_nm= 0. 5)的TG1菌液中，室温 孵育30 min后，取10 μ L菌液进行梯度稀释，与顶琼脂混合后分别涂布于2 X YT平板表面， 测定洗脱液中噬菌体的滴度（pfu/mL); 10) 其余的菌液转种到50 mL的2 X YTA培养液中，37°C，200 rpm培养至0D6QQmi约为0. 4 后，加入100 μ L M13K07辅助噬菌体（1012 pfu)，感染30 min后补加卡那霉素至终浓度为50 μ g/mL，37°C、200 rpm 培养过夜； 11) 按照实施例3的方法，用PEG/2. 5M NaCl对过夜培养的噬菌体进行沉淀收集，上清 液即为扩增的噬菌体； 12) 按实施例3的方法对第一轮淘选、扩增的噬菌体进行滴度测定，扩增的噬菌体加入 等体积的无菌甘油，混匀，4°C储存。
[0101] 第二轮淘洗 以1 mL (100 μ g)纯化TGR蛋白包被12孔细胞培养板，4°C包被过夜，封闭后加入第 一轮淘洗后扩增的噬菌体，按第一轮筛洗步骤5)-12)进行第二轮淘洗，所用噬菌体为第一 轮扩增的噬菌体液（1012 pfu)，洗液中吐温的浓度增加到0. 5% (v/v)。
[0102] 按照第一轮的方法测定第二轮洗脱的噬菌体数量，并进行噬菌体扩增、浓缩及滴 度测定。
[0103] 第三轮淘洗 以1 mL (10 μ g)纯化57 TGR蛋白包被12孔细胞培养板，4°C包被过夜，封闭后加入第 一轮淘洗后扩增的噬菌体，按第一轮筛洗步骤5)-12)进行第三轮淘洗，所用噬菌体为第二 轮扩增的噬菌体液（1012 pfu)。
[0104] 重组噬菌体的鉴定 限制性酶切分析：将第三次淘选获得的噬菌体感染TG1细菌，随机挑选平板上10个单 个菌落，分别接种到10个3mL2XYTA培养基中。37 °C、200 rpm摇菌过夜。次日用Promega 公司质粒DNA纯化试剂盒（Promega plasmid Miniprep Kit)提取10个菌落的噬粒。用限制 性内切酶Sfil和Notl同时进行酶切分析，反应体系如下： 质粒 DNA 10 μ L Notl-HF 1 yL 100XBSA 0. 2 μ L 10 X NEB Buffer 4 2 μ L ddH20 6. 8 μ L 总计 19 μ L 混匀离心后，置37°C水浴箱反应4 h。再加1 μ L Sfil混匀离心后，置50 °C水浴箱反应 过夜。
[0105] 将酶切产物全部进行1 %琼脂糖凝胶电泳，100 V电泳40 min，凝胶成像仪观察噬 粒DNA是否被酶切成两条分别与预期纳米抗体及线性化pCANTab5E大小相似的DNA条带。
[0106] DNA序列分析：从第三次淘洗获得的噬菌体感染TG1细菌平板上随机挑选100 个单菌落分别接种到100个3mL2XYTA培养基中。37 °C、200 rpm摇菌过夜。次日用 Promega公司质粒DNA纯化试剂盒（Promega plasmid Miniprep Kit)提取噬粒DNA。所获 得的噬粒样本全部寄送至上海invitrogen公司，用噬粒pCANTab5E上游引物（引物序列： CCATGATTACGCCAAGCTTTGGAGCC)进行单向测序，并对测序结果进行分析。
[0107] 结果：以M13K07辅助噬菌体感染纳米抗体噬粒库进行噬菌体拯救，获纳米抗体重 组噬菌体展示库，库的效价为4X 1012 pfu/mL，总体积为8 mL。
[0108] 用纯化的重组57 TGR蛋白包被酶标板，再与纳米抗体噬菌体展示库中的重组噬 菌体结合，进行3轮淘洗后，随着57 TGR包被量的降低，淘洗次数的增加，以及淘洗条件逐渐 严谨，特异性结合的噬菌体呈显著的富集趋势，噬菌体回收率明显增加。各轮淘洗获得噬菌 体的数据如表1及图4。
[0109] 表1各轮淘洗噬菌体的回收率

【权利要求】
1. 一种单区抗体的噬菌体展示库，其特征在于含有新疆双峰驼全部的编码单区抗体的 基因，可用于筛选和制备抗57 TGR蛋白单区抗体，以及抗任何其它抗原分子或表位的特异 性单区抗体的筛选和制备。
2. 用权利要求1所述单区抗体的噬菌体展示库筛选和制备的三株抗57TGR蛋白的单区 抗体JIH)YYNA-l、JIPDYYNA-2及JITOYYNA-3,其特征在于可用于血吸虫病治疗新药的开发 和血吸虫病靶向治疗载体、方法或其它基于此三株单区抗体的免疫检测、免疫干预和免疫 治疗的免疫学应用。
【文档编号】A61P33/12GK104047061SQ201410285116
【公开日】2014年9月17日 申请日期:2014年7月29日 优先权日:2014年7月29日
【发明者】宋丽君, 姚媛, 余传信, 殷旭仁, 沈双, 高玒 申请人:江苏省血吸虫病防治研究所