一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用，中药材牛膝经中提取的牛膝总皂苷用于在防治骨关节炎的药物中；所述牛膝总皂苷的药物剂型上包括片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂、靶向制剂；所述牛膝总皂苷对白细胞介素-1β所致软骨细胞凋亡有抑制作用，还可抑制白细胞介素-1β引起的软骨细胞炎症反应，对软骨细胞有保护作用。本发明拓宽了牛膝总皂苷的应用范围，也为骨关节炎的防治提供了新途径。
【专利说明】一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用
【【技术领域】】
[0001]本发明涉及一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用。
【【背景技术】】
[0002]骨关节炎(osteoarthritis, 0A)是一种慢性退行性骨关节疾病，多发于老年人，以关节软骨退行性病变，半月板损伤，轻度滑膜炎，骨重构，软骨下骨硬化，骨赘形成等为主要病理特征，又称骨关节病、退行性骨关节病、肥大性或增生性关节炎等。OA是全球范围内最常见的骨关节病，我国OA患者约占总人口的3%，其中大部分为膝骨关节病。
[0003]OA的病因及详细的病理机制目前仍不完全清楚，现一般认为关节软骨破坏及其修复过程的失衡导致0A。各种致病因素造成软骨退行性病变时均从各自途径导致了关节软骨细胞的死亡以及软骨基质的降解，其中软骨细胞的死亡又是软骨退行性病变的关键。
[0004]OA的治疗包括药物治疗和外科手术等。其中治疗药物可分为:快作用缓解症状的药物，主要是非留体类药物，但引起胃肠道明显的不良反应以及可能破坏软骨细胞进而限制了它的长期应用；慢作用缓解OA炎症的药物及软骨保护剂，如补充软骨基质的氨基葡萄糖类以及IL-1抑制剂如双醋瑞因，软骨保护剂如透明质酸等，但因价格昂贵而限制了使用。中医药治疗OA类疾病历史悠久，不良反应少，因此可深入挖掘中医药治疗的特色与优势。中医药防治OA实验研究取得了很大成绩，但是复方研究居多，寻找有效成分明确、质量可控且安全高效的组分中药具有显著的实用价值。
[0005]牛膝为觅科多年生草本植物Achyranthes bidentata B1.干燥根，又称怀牛膝，具有强筋骨、补肝肾、引血下行及逐瘀通经的作用。皂苷类成分是牛膝中重要的活性成分，现有专利申请涉及总皂苷的提取方法，但对牛膝总皂苷作为骨关节炎防治药物的作用并未见报道。
【
【发明内容】
】
[0006]本发明要解决的技术问题，在于提供一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用，拓宽了牛膝总皂苷的应用范围，也为骨关节炎的防治提供了新途径。
[0007]本发明是这样实现上述技术问题的:
[0008]一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用，中药材牛膝经中提取的牛膝总皂苷用于在防治骨关节炎的药物中。
[0009]进一步地，所述牛膝总皂苷的药物剂型上包括片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂、靶向制剂。
[0010]进一步地，所述牛膝总皂苷对白细胞介素-1 β所致软骨细胞凋亡有抑制作用，还可抑制白细胞介素-1 β引起的软骨细胞炎症反应，对软骨细胞有保护作用。
[0011]本发明具有如下优点:
[0012]牛膝饮片经乙醇回流提取，正丁醇萃取，DlOl大孔吸附树脂富集，获得牛膝总皂苷。牛膝总皂苷对白细胞介素-1β (IL-Ιβ)所致软骨细胞凋亡有抑制作用，还可抑制IL-1 β引起的软骨细胞炎症反应，对软骨细胞有显著保护作用。大鼠右后肢膝关节腔注射碘乙酸钠造成实验性骨关节炎模型，牛膝总皂苷能显著抑制实验性骨关节炎大鼠关节肿胀，降低血清IL-1 β与一氧化氮(NO)水平，抑制软骨胶原蛋白的降解，对实验性骨关节炎大鼠有显著治疗作用。总之，本发明拓宽了牛膝总皂苷的应用范围，也为骨关节炎的防治提供了新途径。
【【专利附图】
【附图说明】】
[0013]下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0014]图1为牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞活力影响的柱状图。
[0015]图2为Hoechst33258染色检测牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞凋亡的显微图。
[0016]图3Α为Annexin V-FITC流式检测牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞凋亡散点图。
[0017]图3Β为Annexin V-FITC流式检测牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞凋亡柱形图。
[0018]图4为牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞凋亡蛋白的影响Western Blot图。
[0019]图5为牛膝总皂苷抑制IL-1 β诱导的软骨细胞caspase3活性的柱状图。
[0020]图6为牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞中炎症介质的影响Western Blot图。
[0021]图7为牛膝总阜昔对大鼠血清IL-1 β水平的影响柱状图。
[0022]图8为牛膝总阜昔对大鼠血清NO水平的影响柱状图。
[0023]图9为牛膝总皂苷对大鼠血清羟脯氨酸水平的影响柱状图。
【【具体实施方式】】
[0024]请参阅图1?9所示，对本发明的实施例进行详细的说明。
[0025]本发明涉及一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用，中药材牛膝经中提取的牛膝总皂苷用于在防治骨关节炎的药物中。
[0026]所述牛膝总皂苷的药物剂型上包括片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂、靶向制剂。
[0027]所述牛膝总皂苷对白细胞介素-1 β所致软骨细胞凋亡有抑制作用，还可抑制白细胞介素-1 β引起的软骨细胞炎症反应，对软骨细胞有保护作用。
[0028]下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0029]实施例一:干燥的牛膝饮片3.5kg，略破碎，加入4倍体积75%乙醇，水浴加热，回流提取三次，时间分别为4h、2h、2h。合并提取液，减压浓缩，称重。总浸膏用适量水溶解，依次用石油醚，水饱和正丁醇萃取，最后将正丁醇萃取液进行减压浓缩，称重。在预处理过的DlOl大孔吸树脂层表面放入一张滤纸，将事先准备好的上样液(样品液的前处理:样品用适量蒸馏水超声溶解，3000r/min离心20min以除去沉淀和杂质，得到的样品液放置于冰箱4°C低温放置备用)沿玻璃柱内壁小心加入柱子，以3mL/min (即I滴/秒)的流速放液，直至样品液降至树脂层表面。依次用5倍柱体积的水、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %乙醇以3mL/min的流速进行梯度洗脱，收集50%洗脱液，经回流浓缩、干燥，获得牛膝总皂苷提取物，以5%香草醛-冰乙酸:高氯酸:冰乙酸(2:8:50)为显色剂进行含量测定，所得提取物中牛膝总皂苷含量高于50%。
[0030]实施例二:无菌环境下，小心刮取100 ± 1g的SD雄性大鼠双侧膝关节胫骨坪及髌骨内侧透明软骨，用含100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗软骨，剪碎至Imm3大小。将软骨碎片转移至离心管中，依次用0.25%的胰蛋白酶及0.3%的II型胶原酶分别消化30min，3h。II型胶原酶消化时每隔30min吹打60s。将消化液经200目细胞筛过滤，得到细胞悬液，1200rpm/min离心lOmin。用DMEM/F-12培养基重悬细胞(含20%新生牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素)，将细胞悬液转移至25cm2细胞培养瓶中，37°C和5% CO2培养箱中培养，实验使用第2?3代细胞。
[0031]2?3代的软骨细胞，用0.25%的胰蛋白酶消化，将细胞浓度调为I X 15个细胞ZmL,接种于96孔细胞培养板，37°C和5% CO2培养箱中培养24h。加入含5% NCS的DMEM/F-12培养基，牛膝总皂苷(终浓度为3，10，30μ8/πιυ或IL-1 β (终浓度为10ng/mL)，至37°C,5% CO2条件下培养4h，每孔加MTT(5mg/mL) 20 μ L，继续培养4h后，小心吸出培养上清，每孔加入DMS0150yL，待结晶充分溶解后，570nm处测定OD值。如图1所示，图1为牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞活力影响的柱状图，(η = 3，**ρ〈0.0lvs模型组)。结果:牛膝总皂苷能显著抑制IL-1 β引起的大鼠软骨细胞活力下降，且呈现浓度依赖关系。
[0032]实施例三:实施例二得到的第2?3代的软骨细胞，接种于6孔细胞培养板，37°C和5% CO2培养箱中培养24h。加入牛膝总皂苷(终浓度为3，10，30 μ g/mL)或IL-1 β (终浓度为10ng/mL)，37°C，5% CO2条件下培养24h。
[0033]按照细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒说明书的方法进行检测。结果参阅图2，图2为Hoechst33258染色检测牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞凋亡的显微图，其中，(a)正常组，(b) IL-1 β，(c) IL-1 β + 牛膝总皂苷(3 μ g/mL)，(d) IL-1 β + 牛膝总皂苷(10 μ g/mL)，(e) IL-1 β +牛膝总皂苷(30 μ g/mL)。结果显示:正常软骨细胞呈蓝色，IL-1 β诱导的软骨细胞呈致密浓染，颜色发白，提示软骨细胞发生凋亡。牛膝总皂苷(10，30yg/mL)可逆转IL-1 β引起的软骨细胞凋亡。
[0034]实施例四:用实施例三的方法将软骨细胞接种及给药。
[0035]给药24h后，按照Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒说明书的方法，在Ih内进行流式细胞仪检测。重点参阅图3A和图3B，其中，n = 3，*p〈0.05，**p〈0.0lvs模型组。图3Α为Annexin V-FITC流式检测牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞凋亡散点图，其中(a)正常组，(b) IL-1 β，(c) IL-1 β + 牛膝总皂苷(3 μ g/mL)，(d) IL-1 β + 牛膝总皂苷(10 μ g/mL)，(e) IL-1 β +牛膝总皂苷(30 μ g/mL)，图3B为Annexin V-FITC流式检测牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞凋亡柱形图。结果显示刺激软骨细胞24h后，细胞凋亡增力口，牛膝总皂苷对IL-1 β所致的软骨细胞凋亡有一定的抑制作用。
[0036]重点参阅图4，图4是牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞凋亡蛋白的影响Western Blot图。对于IL-Ιβ诱导的抗凋亡蛋白Bcl-Xlj表达降低和凋亡蛋白Bax、Bad表达上升，牛膝总皂苷有显著抑制作用。
[0037]重点参阅图5，图5是牛膝总皂苷抑制IL-1 β诱导的软骨细胞caspase3活性的柱状图，(n = 3, **p〈0.0lvs.模型组)。对于IL-1 β引起的细胞凋亡酶caspase3活性上升，牛膝总皂苷有显著抑制作用。
[0038]重点参阅图6，图6为牛膝总皂苷对IL-1 β诱导的软骨细胞中炎症介质的影响Western Blot图。牛膝总皂苷还可下调IL-1 β引起的基质金属蛋白酶(ΜΜΡ3，ΜΜΡ9)和环氧化合酶(C0X-2)的表达。
[0039]实施例五:200±20g雄性SD大鼠36只，随机分为6组:正常对照组、模型组、牛膝总皂苷(50、100、200mg/kg)三个剂量组、硫酸氨基葡萄糖(75mg/kg)阳性对照组。除对照组外，其余各组大鼠右肢膝关节腔注射10mg/mL的碘乙酸钠生理盐水溶液100 μ L，各组大鼠灌胃给药或对照液，观测大鼠关节肿胀情况。分别于造模前lh，及造模后第1，2，3，7，14，21天，用500型开式双外爪游标卡尺测量各组大鼠右肢膝关节直径。结果如下表:
[0040]
xV正常组模型组低剂量组中剂量组高削量组阳性对照组
N.(mm)(mm)(mm)(mm)(mm)(rnm)
第 0 天9.82±0.48 9.96±0.519.87±0.5310.05±0.37 9.98±0.239.9牡31
第 I 天9.99±0.2312.36±0.35##12.53±0.2512.03±0.35 12,03±0,1412,02±0.16*
第 2 天9.86±0.1513.87±0.48##13.23±0.5212.96士0.51*11.80±0.30*11.34±0.38-*
第 3 天10.01±0.1111.83±0.21##11.03±0.0710.65士0.20*10.42±0.11**10.30士0.08**
第 7 天10.85±0.0511.76±0.11##11.37±0.4811.26±0.3210.98±0.12**10.51±0.18**
第 M 天11.15士0,79 11,73±0.1511.47±0.2811.36士0.45 11.30±0.5111.11 士0.75
第 21 天11.07±0.82 11,74±0.0711.47±0,3011.38±0.41 11.27±0.5711.14±0.68
[0041](注:η= 6, *ρ〈0.05, **ρ〈0.0lvs.模型组，#p<0.05, ##p<0.0lvs.正常组)
[0042]实施例六:实施例五中大鼠造模后第28天，各组大鼠断头取血，分离膝关节软骨标本。血清及标本_80°C冻存，进行各项指标的检测。
[0043]重点参阅图7，图7为牛膝总皂苷对大鼠血清IL-1 β水平的影响柱状图，(η = 6，**P<0.01vs.模型组)。按照IL-Ιβ检测试剂盒说明书进行测定，结果显示:模型组大鼠血清中的IL-1 β水平显著上升，牛膝总皂苷(100、200mg/kg)能显著减少大鼠血清IL-1 β的水平。
[0044]重点参阅图8，图8为牛膝总皂苷对大鼠血清NO水平的影响柱状图，(η = 6，*Ρ<0.05, **p〈0.01vS.模型组)。按照一氧化氮(NO)检测试剂盒说明书进行测定，结果显示:模型组大鼠血清中的NO水平显著上升，牛膝总皂苷能剂量依赖性降低大鼠血清NO的水平。
[0045]重点参阅图9，图9为牛膝总皂苷对大鼠血清羟脯氨酸水平的影响柱状图，(η = 6，**P<0.01vs.模型组)。按羟脯氨酸试剂盒说明书进行测定，结果显示:模型组大鼠血清中羟脯氨酸水平显著上升，牛膝总皂苷(100、200mg/kg)能显著降低大鼠血清中Hyp的水平，表明牛膝总皂苷能抑制实验性OA大鼠软骨胶原蛋白的降解。
[0046]综上，本发明的牛膝饮片经乙醇回流提取，正丁醇萃取，DlOl大孔吸附树脂富集，获得牛膝总皂苷。牛膝总皂苷对白细胞介素-1 β (IL-Ιβ)所致软骨细胞凋亡有抑制作用，还可抑制IL-Ιβ引起的软骨细胞炎症反应，对软骨细胞有显著保护作用。大鼠右后肢膝关节腔注射碘乙酸钠造成实验性骨关节炎模型，牛膝总皂苷能显著抑制实验性骨关节炎大鼠关节肿胀，降低血清IL-1 β与一氧化氮(NO)水平，抑制软骨胶原蛋白的降解，对实验性骨关节炎大鼠有显著治疗作用。总之，本发明拓宽了牛膝总皂苷的应用范围，也为骨关节炎的防治提供了新途径。
[0047]虽然以上描述了本发明的【具体实施方式】，但是熟悉本【技术领域】的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。
【权利要求】
1.一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用，其特征在于:中药材牛膝经中提取的牛膝总皂苷用于在防治骨关节炎的药物中。
2.如权利要求1所述的一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用，其特征在于:所述牛膝总皂苷的药物剂型上包括片剂、胶囊剂、口服液、口含片、颗粒剂、混悬剂、栓剂、注射剂、粉针剂、滴丸、缓释剂、控释剂、靶向制剂。
3.如权利要求1所述的一种牛膝总皂苷在防治骨关节炎的药物中的应用，其特征在于:所述牛膝总皂苷对白细胞介素-1 β所致软骨细胞凋亡有抑制作用，还可抑制白细胞介素-1β引起的软骨细胞炎症反应，对软骨细胞有保护作用。
【文档编号】A61P19/02GK104127455SQ201410342914
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月18日 优先权日:2014年7月18日
【发明者】徐先祥, 张小鸿, 李琼 申请人:华侨大学