类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经细胞损伤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及神经营养因子【技术领域】，是一种类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经细胞损伤药物中的应用；本发明类叶升麻苷能够显著提高模型组雌性昆明小鼠脑组织中NT-3、NGF、BDNF及其受体TrkB的mRNA的表达、增强脑内BDNF和TrkB蛋白含量以及增强脑组织皮层和海马区NT-3、NGF及其受体TrkA的蛋白表达水平，说明类叶升麻苷具有增强神经营养因子及受体的作用，能够改善因神经营养因子及其受体表达降低引起的神经细胞损伤，且作用显著性优于维生素E（vitaminE，VE）组和吡拉西坦片组。
【专利说明】类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经 细胞损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及神经营养因子【技术领域】，是一种类叶升麻苷在制备保护神经营养因子 及其受体引起的神经细胞损伤药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 神经营养因子（neurotrophic factors, NTFs)是机体产生的能促进神经细胞 存活、生长和分化的一类多肽或蛋白质，它不仅在发育过程中调节神经元存活，在生化 和生理上激活酶的活性发挥生理功能，而且还能阻止成年神经元损伤后的死亡，促使神 经元修复、轴突再生、调节突触可塑性和神经递质等神经系统的活动。调控神经元细胞 的有5种相关因子：神经生长因子（nerve growth factor, NGF)、脑源性神经营养因子 (brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养素-3 (neurotrophin-3，NT-3)、 NT-4(neurotrophin_3，NT-4)和 NT-5(neurotrophin_3，NT-5)，这些因子具有不同的结 构特征和受体信号机制，生物学效应也不尽相同。NTFs的特异性受体是原肌球蛋白激酶 (Trk) A、B和C受体，是典型的酪氨酸激酶受体，TrkA、B、C分别是NGF、BDNF、NT-3的受体。 神经营养因子抑制神经系统中的神经元细胞凋亡，缺乏神经营养因子时发生的凋亡是一种 依赖于大多数新蛋白合成和细胞死亡相关基因的细胞死亡。已经十分清楚确定，神经营养 因子抑制神经元细胞在神经系统发育中的预定死亡。
[0003] 实验研究已经证实，NGF具有作为用于若干种疾病的治疗剂的潜能。这些疾病 包括神经变性疾病、神经炎症和一些类型的癌症、多发性硬化、视神经脊髓炎、肌萎缩性侧 索硬化（ALS)、帕金森病、阿尔茨海默病、弗里德赖希共济失调、亨廷顿舞蹈病、卢伊体痴呆 (dementia with Lewy bodies)、脊髓性肌萎缩、严重抑郁障碍、精神分裂症、青光眼或周 围神经病（糖尿病性或 AIDS 神经病））（Longo 等人，2007; Schulte-Herbriiggen, 2007; Shi, 2007; Hellveg, 2008; Shoval, 2005; Apfel, 2002; Anand, 2004)。NGF 能 阻止损伤后的基底前脑胆碱能神经元变性，可用来治疗早老性痴呆。近年来的研究发现， BDNF能促进中脑多巴胺能神经元存活和分化，对治疗Parkinson病具有一定的潜在价值， 也能阻止红核神经元逆行性死亡，能阻止成年动物神经元损伤后的胆碱能神经元脱失。动 物实验表明，NT-3能促进皮质脊髓束神经细胞轴突生长，且在脊髓损伤后能促进运动功能 的修复。目前许多研究指出，抑郁症患者BDNF和TrkB水平明显降低，而抗抑郁治疗可以 逆转此改变，上调BDNF及其受体TrkB的表达，并阻止应激引起的BDNF表达下调反应，同 时，损伤性刺激可引起多种NTFs (NGF、NT-3)的表达减少。NGF除在神经元和寡突细胞中 的神经保护特性外还诱导自身免疫脱髓鞘过程中的免疫抑制这一发现使得它成为治疗中 枢神经系统炎性疾病的极为良好的候选物。然而，因不能通过血脑屏障（BBB)(P 〇dusl〇 和Curran, 1996)、其半衰期短及其副作用（Apfel, 2002)，所以NGFs不是理想的药物候选 物。已经进行了多种努力来寻找具有NGFs激动剂活性、更好的药代动力学特性和较少的 副作用的小分子。为了实现这一目的，已经尝试了不同的方法（Poduslo和Curran, 1996 ; Longo 等人，1997; Maliartchouk 等人，2000; Maliartchouk 等人，2000b ;Peleshok 和 Saragovi,2006)〇
[0004] 因此，对提供具有神经保护特性的药物、特别是NGF模拟物存在持续的需求，优选 具有多种潜能作用，而没有NGF的缺陷具有相似作用的替代物是目前特别需求开发的。
[0005] 神经损伤疾病以及精神疾病作为一种慢性疾病，中医药以及天然药物在这方面有 极大的优势与潜力。植物中提取的天然产物在生物活性方面具有结构明确，毒性小，作用持 久、显著等特点。苯乙醇苷类化合物普遍分布于植物界中，有着广泛的生物活性。类叶升麻 苷为存在于肉苁蓉、车前草等植物中，是苯乙醇苷类化合物，在抗氧化、提高免疫、抗细胞凋 亡、神经保护等方面作用显著。
[0006] 然而，目前没有任何文献报道或披露关于类叶升麻苷对神经营养因子及其受体的 增强作用。
【发明内容】
[0007] 本发明提供了一种类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经细 胞损伤药物中的应用，本发明首次提出了类叶升麻苷作用于神经营养因子及其受体而起到 保护神经细胞损伤的作用。
[0008] 本发明的技术方案是通过以下措施来实现的：一种类叶升麻苷在制备保护神经营 养因子及其受体引起的神经细胞损伤药物中的应用。
[0009] 下面是对上述发明技术方案的进一步优化或/和改进： 上述神经营养因子为NGF、BDNF和NT-3中的一种以上。
[0010] 上述神经营养因子受体为TrkA或/和TrkB。
[0011] 上述类叶升麻苷以干品重量计，类叶升麻苷的含量为90%至99. 9%。
[0012] 上述类叶升麻苷为从植物中提取的类叶升麻苷或者通过合成得到的类叶升麻苷。
[0013] 本发明类叶升麻苷能够显著提高模型组雌性昆明小鼠脑组织中NT-3、NGF、BDNF 及其受体TrkB的mRNA的表达、增强脑内BDNF和TrkB蛋白含量以及增强脑组织皮层和海 马区NT-3、NGF及其受体TrkA的蛋白表达水平，说明类叶升麻苷具有增强神经营养因子及 受体的作用，能够改善因神经营养因子及其受体表达降低引起的神经细胞损伤，且作用显 著性优于维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦片组。
【专利附图】
【附图说明】
[0014] 附图1为正常对照组雌性昆明小鼠海马CA1区放大40倍的HE染色图。
[0015] 附图2为模型组雌性昆明小鼠海马CA1区放大40倍的HE染色图。
[0016] 附图3为维生素 E组雌性昆明小鼠海马CA1区放大40倍的HE染色图。
[0017] 附图4为吡拉西坦组雌性昆明小鼠海马CA1区放大40倍的HE染色图。
[0018] 附图5为类叶升麻苷低剂量组雌性昆明小鼠海马CA1区放大40倍的HE染色图。 [0019] 附图6为类叶升麻苷中剂量组雌性昆明小鼠海马CA1区放大40倍的HE染色图。
[0020] 附图7为类叶升麻苷高剂量组雌性昆明小鼠海马CA1区放大40倍的HE染色图。
[0021] 附图8为正常对照组、模型组、类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组、类叶 升麻苷高剂量组、维生素 E组和吡拉西坦片组分别对雌性昆明小鼠脑组织NT-3、NGF和TrkA 蛋白表达放大40倍的影响图。
[0022] 附图9为正常对照组对雌性昆明小鼠海马CA1区NT-3表达放大40倍的影响图。
[0023] 附图10为正常对照组对雌性昆明小鼠皮层NT-3表达放大40倍的影响图。
[0024] 附图11为模型组对雌性昆明小鼠海马CA1区NT-3表达放大40倍的影响图。
[0025] 附图12为模型组对雌性昆明小鼠皮层NT-3表达放大40倍的影响图。
[0026] 附图13为维生素 E组对雌性昆明小鼠海马CA1区NT-3表达放大40倍的影响图。
[0027] 附图14为维生素 E组对雌性昆明小鼠皮层NT-3表达放大40倍的影响图。
[0028] 附图15为吡拉西坦片组对雌性昆明小鼠海马CA1区NT-3表达放大40倍的影响 图。
[0029] 附图16为吡拉西坦片组对雌性昆明小鼠皮层NT-3表达放大40倍的影响图。
[0030] 附图17为类叶升麻苷低剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区NT-3表达放大40倍 的影响图。
[0031] 附图18为类叶升麻苷低剂量组对雌性昆明小鼠皮层NT-3表达放大40倍的影响 图。
[0032] 附图19为类叶升麻苷中剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区NT-3表达放大40倍 的影响图。
[0033] 附图20为类叶升麻苷中剂量组对雌性昆明小鼠皮层NT-3表达放大40倍的影响 图。
[0034] 附图21为类叶升麻苷高剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区NT-3表达放大40倍 的影响图。
[0035] 附图22为类叶升麻苷高剂量组对雌性昆明小鼠皮层NT-3表达放大40倍的影响 图。
[0036] 附图23为正常对照组对雌性昆明小鼠海马CA1区NGF表达放大40倍的影响图。
[0037] 附图24为正常对照组对雌性昆明小鼠皮层NGF表达放大40倍的影响图。
[0038] 附图25为模型组对雌性昆明小鼠海马CA1区NGF表达放大40倍的影响图。
[0039] 附图26为模型组对雌性昆明小鼠皮层NGF表达放大40倍的影响图。
[0040] 附图27为维生素 E组对雌性昆明小鼠海马CA1区NGF表达放大40倍的影响图。
[0041] 附图28为维生素 E组对雌性昆明小鼠皮层NGF表达放大40倍的影响图。
[0042] 附图29为吡拉西坦片组对雌性昆明小鼠海马CA1区NGF表达放大40倍的影响图。
[0043] 附图30为吡拉西坦片组对雌性昆明小鼠皮层NGF表达放大40倍的影响图。
[0044] 附图31为类叶升麻苷低剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区NGF表达放大40倍的 影响图。
[0045] 附图32为类叶升麻苷低剂量组对雌性昆明小鼠皮层NGF表达放大40倍的影响 图。
[0046] 附图33为类叶升麻苷中剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区NGF表达放大40倍的 影响图。
[0047] 附图34为类叶升麻苷中剂量组对雌性昆明小鼠皮层NGF表达放大40倍的影响 图。
[0048] 附图35为类叶升麻苷高剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区NGF表达放大40倍的 影响图。
[0049] 附图36为类叶升麻苷高剂量组对雌性昆明小鼠皮层NGF表达放大40倍的影响 图。
[0050] 附图37为正常对照组对雌性昆明小鼠海马CA1区TrKA表达放大40倍的影响图。
[0051] 附图38为正常对照组对雌性昆明小鼠皮层TrKA表达放大40倍的影响图。
[0052] 附图39为模型组对雌性昆明小鼠海马CA1区TrKA表达放大40倍的影响图。
[0053] 附图40为模型组对雌性昆明小鼠皮层TrKA表达放大40倍的影响图。
[0054] 附图41为维生素 E组对雌性昆明小鼠海马CA1区TrKA表达放大40倍的影响图。
[0055] 附图42为维生素 E组对雌性昆明小鼠皮层TrKA表达放大40倍的影响图。
[0056] 附图43为吡拉西坦片组对雌性昆明小鼠海马CA1区TrKA表达放大40倍的影响 图。
[0057] 附图44为吡拉西坦片组对雌性昆明小鼠皮层TrKA表达放大40倍的影响图。
[0058] 附图45为类叶升麻苷低剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区TrKA表达放大40倍 的影响图。
[0059] 附图46为类叶升麻苷低剂量组对雌性昆明小鼠皮层TrKA表达放大40倍的影响 图。
[0060] 附图47为类叶升麻苷中剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区TrKA表达放大40倍 的影响图。
[0061] 附图48为类叶升麻苷中剂量组对雌性昆明小鼠皮层TrKA表达放大40倍的影响 图。
[0062] 附图49为类叶升麻苷高剂量组对雌性昆明小鼠海马CA1区TrKA表达放大40倍 的影响图。
[0063] 附图50为类叶升麻苷高剂量组对雌性昆明小鼠皮层TrKA表达放大40倍的影响 图。
[0064] 附图51为类叶升麻苷的结构式。
【具体实施方式】
[0065] 本发明不受下述实施例的限制，可根据本发明的技术方案与实际情况来确定具体 的实施方式。
[0066] 实施例1，一种类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经细胞损 伤药物中的应用。
[0067] 实施例2,作为上述实施例的优化，实施例2中神经营养因子为NGF、BDNF和NT-3 中的一种以上。
[0068] 实施例3,作为上述实施例的优化，实施例3中神经营养因子受体为TrkA或/和 TrkB。
[0069] 实施例4,作为上述实施例的优化，实施例4中类叶升麻苷以干品重量计，类叶升 麻苷的含量为90%至99. 9%。
[0070] 实施例5,作为上述实施例的优化，实施例5中类叶升麻苷为从植物中提取的类叶 升麻苷或者通过合成得到的类叶升麻苷。
[0071] 类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经细胞损伤药物中的应 用的试验步骤如下： 类叶升麻苷对D-半乳糖联合A1C13诱导衰老小鼠模型的影响 1实验方法 1. 1造模及给药方法 雌性昆明小鼠，体质量为20±2g，随机分为7组，每组12只：（1)正常对照组；（2)模型 组；（3)类叶升麻苷低剂量组（0. 5mg/kg); (4)类叶升麻苷中剂量组（15mg/kg); (5)类叶升 麻苷高剂量组（450 mg/kg);(6)维生素 E (vitamin E，VE)组（150mg/kg);(7)批拉西坦片 组（300mg/kg);除正常对照组外，其余组雌性昆明小鼠均腹腔注射D-半乳糖60mgAkg*d)， 灌胃A1C1 3 5mgAkg*d)，灌胃和注射剂量均为0. 1 mL/10 g，正常对照组灌胃和注射等量生 理盐水，连续灌胃和注射90d ;从造模第61d开始，同时分别给予类叶升麻苷低剂量组、类叶 升麻苷中剂量组和类叶升麻苷高剂量组灌胃类叶升麻苷，维生素 E (vitamin E，VE)组灌胃 维生素 E，吡拉西坦片组灌胃吡拉西坦片，类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组、类叶 升麻苷高剂量组、维生素 E (vitamin E，VE)组和批拉西坦片组分别连续灌胃30d;类叶升 麻苷、VE和批拉西坦片灌胃前溶于5g/L的羧甲基纤维素钠 （carmellose sodium, CMC-Na) 中，现用现配。
[0072] 1. 2溶液配制 1. 2. 1 D-半乳糖溶液配制方法：精密称取D-半乳糖0. lg溶于20ml 0. 9%生理盐水中， 混合均匀、过滤除菌，现用现配。
[0073] 1.2.2 A1C13 · 6H20 溶液配制方法：精密称取 A1C13 · 6H20 0.0905g 溶于 100ml 0. 9%生理盐水中，混合均匀，现用现配。
[0074] 1. 2. 3 0. 5%的伊红酒精溶液配制方法：称取伊红Y 0. 5g，加少量蒸馏水溶解后， 滴加冰醋酸至浆糊状，过滤，将滤渣烤干，用l〇〇ml 95%酒精溶解。
[0075] 1. 2. 4苏木素染液配制方法：将2. 5g苏木素溶于20ml无水乙醇，再将5g硫酸错 钾溶于330ml蒸馏水中，溶解后混合于150ml甘油中，最后加入10ml冰醋酸和0. 25g碘酸 钠。
[0076] 1. 2. 5 1%盐酸酒精分化液配制方法：将1ml浓盐酸(质量百分数> 37%)加入99ml 70%的酒精中，混匀。
[0077] 1. 3 检测 正常对照组、模型组、类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组、类叶升麻苷高剂量 组、维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦片组中的雌性昆明小鼠最后一次给药后2h，每 组随机选取6只雌性昆明小鼠，将雌性昆明小鼠断髓处死，迅速取出脑组织，制备脑组织匀 浆，备用；然后将每组剩余的6只雌性昆明小鼠用4%甲醛灌注，取脑，放置于4%甲醛固定液 中进行固定，用于HE染色和免疫组织化学检测。
[0078] 1. 3· 1 HE染色(采用常规HE染色方法） 1.3. 2荧光定量PCR检测 根据NCBI网站报道的基因序列，利用Premier 5.0软件设计引物：1)神经营养因 子-3(NT-3, neurotrophins-3):上游引物为 5'-GGA GTT TGC CGG MG ACT CTC-3'，下游引 物为 5' -GGG TGC TCT GGT AAT TTT CCT TA-3'；2)神经生长因子（Nerve growth factor, NGF):上游引物位为 5'-AAG CCC ACT GGA CTA AAC T-3'，下游引物为 5'-ACC TCC TTG CCC TTG ATG -3' ；3)脑源性神经营养因子（BDNF, brain-derived neurotrophic factor):上 游引物位为 5'-GTT ATT TCA TAC TTC GGT TGC-3'，下游引物为 5'-ATG GGA TTA CAC TTG GTC TCG -3'；4)酪氨酸激酶受体 A (TrkA, Tyrosine kinase receptor A):上游引物位为 5)酪氨酸激酶受体B(TrkB, Tyrosine kinase rec印tor B):上游引物位为 5'-TGC GCT TCA GTG GTT CTA CAA-3'，下游引物为 5' -CCG TGG AGG GGA TTT CAT TAC-3'；6) β-actin :上 TGC TTG CTG-3。以上引物由上海英骏生物技术有限公司合成。从脑组织中抽提总RNA，反 转录成cDNA后进行RT-PCR扩增，以2- ΛΛ ct计算目的基因 mRNA表达。
[0079] 1. 3. 3 ELISA法检测蛋白含量 取小鼠脑组织称重，加入等倍体积的预冷生理盐水，于冰盘中用组织匀浆机，匀浆；然 后，用低温离心机在4°C、3500r/min离心lOmin，提取上清；采用双抗体夹心ELISA法检测 脑组织BDNF和TrkA蛋白含量，具体操作按Promega ELISA试剂盒说明书。
[0080] 1.3. 4免疫组织化学检测蛋白表达 利用免疫组化SP法检测目的表达水平。简述如下：将固定的脑组织进行脱水透明，浸 蜡、包埋，切片脱蜡至水，然后用10mL/L甲醇双氧水处理10min，0. 1 mol/L PBS洗后，在切 片上滴加抗原修复液处理l〇min，0. 1 mol/L PBS洗后，切片上滴加正常山羊血清封闭液处 理20min，甩去多余液体，然后在切片上滴加兔抗小鼠的蛋白抗体（1:100)，4°C孵育过夜， 0.1111 〇1/1?85清洗；在切片上滴加生物素化的山羊抗兔186(1:100)，371：孵育201^11，0.1 mol/L PBS清洗；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素工作液，37°C孵育20min，0. 1 mol/ L PBS洗清洗；DAB显色、苏木素复染细胞核，常规脱水、透明、封片。在雌性昆明小鼠海马组 织区域随机选取5个高倍镜视野，拍照，使用Image-Pro Plus 6. 0图像分析软件计数目的 蛋白表达的阳性细胞表达率以及测定目的蛋白表达平均吸光度值并进行分级。平均吸光度 值(阳性细胞显色强度）评分标准为：〇 (阴性)，1 (弱阳性)，2 (阳性)，3 (强阳性)。
[0081] 1. 3. 5 Western blot 法检测 NT-3 蛋白表达 提取脑组织总蛋白，测定蛋白浓度；蛋白上样量为50--g，经电泳、转膜、封闭后，加入 兔抗抗体（1:1 〇〇〇)，4°C孵育过夜，Tris-HCl缓冲液洗脱后放入辣根过氧化物酶标记的山 羊抗兔IgG (1:2 000)中室温孵育2 h后，进行ECL反应，以β-actin抗体为内参照；目的 蛋白和相应的β -actin片段的条带吸光度比值为相对表达量分别进行比较。
[0082] 1. 3. 6统计学分析 采用SPASS16. 0统计学软件对实验数据进行统计学分析，数据结果用' x± s表示，组间 比较采用单因素方差分析和t检验；P < 0. 05为差异有统计学意义。
[0083] 2 结果 2.1类叶升麻苷对小鼠脑组织形态的影响 各组对雌性昆明小鼠脑组织形态的影响见图1至图7所示，由图1至图7可以看出， HE染色后，雌性昆明小鼠神经细胞胞浆呈紫红色，核呈紫蓝色，可以清楚地观察细胞的整体 形态。实验中，正常对照组雌性昆明小鼠皮层脑细胞结构正常，数量较多，胞核清晰，胞浆丰 富，间质无水肿表现，海马CA1区锥体细胞3?4层，排列整齐，细胞相对稠密，细胞核圆而 大，核仁清晰，未见炎细胞浸润，未见细胞空泡变性、未见细胞坏死；模型组雌性昆明小鼠皮 层神经细胞减少，体积变小，胞核与胞浆界限模糊，核固缩成三角形或不规则形，核仁消失， 海马CA1区锥体细胞层数减少，排列紊乱，明显变稀疏，不规则，细胞体积变小，部分细胞出 现空泡变性，细胞出现固缩坏死；与模型组比较，维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦 片组雌性昆明小鼠皮层神经细胞结构较正常，数量较多，虽仍有不同程度的神经细胞变形， 但变形神经细胞数量明显减少，海马CA1区锥体细胞排列整齐，相对稠密，未见细胞出现空 泡、固缩坏死；类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组和类叶升麻苷高剂量组雌性昆明 小鼠皮层神经元细胞结构正常，密度增高，胞核清晰，胞浆丰富，海马CA1区锥体细胞排列 整齐，细胞层数增加，排列相对稠密，空泡、固缩坏死细胞减少，仅零星可见，雌性昆明小鼠 脑组织细胞的数量和排列均明显得到改善，说明类叶升麻苷具有明显的神经元细胞保护作 用，其作用明显优于维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦片组。
[0084] 2. 2类叶升麻苷对NT-3、NGF、BDNF及其受体TrkA和TrkB的mRNA表达的影响 类叶升麻苷对NT-3、NGF、BDNF及其受体TrkA和TrkB的mRNA表达的影响见表1所 示，由表1可以看出，模型组雌性昆明小鼠脑内NT-3、NGF、BDNF和TrkB的mRNA表达水平 显著降低0° < 〇. 01 )，而TrkA的mRNA表达水平降低，但不具有统计学意义0° > 0. 05);除 类叶升麻苷低剂量组对NT-3的mRNA表达水平无影响外，类叶升麻苷中剂量组和类叶升麻 苷高剂量组均能显著增高雌性昆明小鼠脑内NT-3、NGF、BDNF和TrkB的mRNA表达水平0° < 0.01)，而对TrkA的mRNA表达水平可以提高，但不具有统计学意义0°> 0.05);吡拉西 坦组也能够显著增高雌性昆明小鼠脑内NT-3、NGF、BDNF的mRNA表达水平0° < 0. 05或产 < 0. 01)，对TrkB的mRNA表达水平无影响0° > 0. 05);而维生素 E (vitamin E，VE)组则 对NT-3、NGF、BDNF和TrkB的mRNA表达水平均无影响0° > 0. 05);从表1可以看出，类叶 升麻苷对神经营养类因子及其受体的影响作用优于吡拉西坦组和VE组。
[0085] 2. 3类叶升麻苷对BDNF及其受体TrkB蛋白含量的影响 类叶升麻苷对雌性昆明小鼠脑组织中BDNF和TrkB蛋白含量的影响见表2所示，由表 2可以看出，与正常对照组相比，模型组雌性昆明小鼠脑内BDNF和TrkB的蛋白含量显著降 低0°< 0.05或/0.01);与模型组相比，类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组和 类叶升麻苷高剂量组均能显著增高雌性昆明小鼠脑内BDNF和TrkB的蛋白含量0° < 0. 05 或产< 0.01);吡拉西坦组也能显著增高雌性昆明小鼠脑内BDNF蛋白含量0°< 0.05)，但 对TrkB蛋白含量无影响0°> 0.05);维生素 E (vitamin E，VE)组对BDNF和TrkB蛋白含 量均无影响0° > 〇. 05);说明类叶升麻苷对BDNF及其受体TrkB的影响作用显著性优于吡 拉西坦组和VE组。
[0086] 2. 4类叶升麻苷对NT-3、NGF及其受体TrkA蛋白表达的影响 类叶升麻苷对雌性昆明小鼠脑组织中NT-3、NGF和TrkA蛋白表达的影响见表3所示； 类叶升麻苷对雌性昆明小鼠脑组织中NT-3蛋白表达的影响见表4所示；类叶升麻苷对雌性 昆明小鼠皮层和海马CA1区NGF蛋白表达的影响见表5所示；类叶升麻苷对雌性昆明小鼠 皮层和海马CA1区TrkA蛋白表达的影响见表6所示；由图8至图50和表3、4、5、6可以看 出，与正常对照组相比，模型组雌性昆明小鼠脑内NT-3、NGF及其受体TrkA蛋白表达水平显 著降低0° < 0. 05或产< 0. 01);与模型组相比，类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组 和类叶升麻苷高剂量组雌性昆明小鼠脑内NT-3、NGF及其受体TrkA蛋白表达水平显著增高 0° < 0. 05或/7 < 0. 01);维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦组也能显著增高雌性昆 明小鼠脑内NT-3、和TrkA蛋白表达水平0°< 0. 05或/0. 01)，但不能影响NGF蛋白表 达水平0° > 0· 05)。
[0087] 类叶升麻苷对NT-3蛋白表达的影响，由图9至图22和表4的免疫组织化学染色图 观察发现正常对照组、模型组、类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组、类叶升麻苷高 剂量组、维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦片组雌性昆明小鼠皮层和海马CA1区NT-3 表达的变化，在光镜下可见NT-3免疫组化染色阳性标记物为棕褐色颗粒，位于胞质中，胞 核呈阴性反应；图像分析系统分析结果显示，与正常对照组相比，模型组雌性昆明小鼠皮层 和海马CA1区神经元NT-3阳性细胞数明显减少，胞浆着色变浅，光密度值降低0°< 0.05 或产< 0. 01);与模型组相比，类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组和类叶升麻苷高 剂量组均能增加雌性昆明小鼠皮层和海马CA1区APP阳性细胞数0° < 0. 05或/^ < 0. 01)， 显著加深胞浆着色程度，提高光密度值〇°< 0.05或/7 <0.01);维生素 E (vitamin E，VE) 组和吡拉西坦组均能明显增加雌性昆明小鼠皮层和海马CA1区NT-3阳性细胞数(产< 0. 05 或P < 0.01)，提高光密度值0°< 0.01)。
[0088] 类叶升麻苷对NGF蛋白表达的影响，由图23至图36和表5的免疫组织化学染色图 观察发现正常对照组、模型组、类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组、类叶升麻苷高 剂量组、维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦片组雌性昆明小鼠皮层和海马CA1区NGF 表达的变化，在光镜下可见NGF免疫组化染色阳性标记物为棕褐色颗粒，表达部位分布较 广，在神经元的胞膜、胞浆、核膜上均可见到；与正常对照组相比，雌性昆明小鼠皮层和海马 CA1区NGF阳性细胞显著减少0°< 0.01)，染色变浅，光密度值显著降低0°< 0.01);与模 型组相比，类叶升麻苷治疗各组的雌性昆明小鼠皮层和海马CA1区NGF阳性细胞数目均能 显著增多0° < 0. 05或/^ < 0. 01)，染色变深，尤其在海马CA1区0° < 0. 01) ;VE组和吡拉 西坦组能明显增加模型组雌性昆明小鼠皮层和海马CA1区的NGF阳性细胞数目0° < 0. 05 或 P < 0· 01)和染色程度 0° < 0· 05 或/7 < 0· 01 )。
[0089] 类叶升麻苷对TrkA蛋白表达的影响，由图37至图50和表6的免疫组织化学染色 图观察发现正常对照组、模型组、类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组、类叶升麻苷 高剂量组、维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦片组雌性昆明小鼠皮层和海马CA1区 TrkA表达的变化，在光镜下可见TrkA免疫组化染色阳性标记物为深浅不一的棕黄色颗粒， 位于神经元胞浆内；结果显示模型组雌性昆明小鼠皮层和海马CA1区TrkA阳性细胞的数量 和平均光密度值评分均明显低于正常对照组0° < 0. 01)，且细胞的胞浆染色较淡，尤其在 海马CA1区差异具有显著性Μ < 0. 01);类叶升麻苷低剂量组、类叶升麻苷中剂量组、类叶 升麻苷高剂量组、维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦组雌性昆明小鼠皮层和海马CA1 区可见较多胞浆呈浅棕黄至深棕黄色颗粒状的阳性细胞，其TrkA阳性细胞的数量和平均 光密度值评分较模型组均显著增加，差异具有显著性0° < 〇. 05或产< 0. 01)。
[0090] 通过类叶升麻苷对NT_3、NGF及其受体TrkA蛋白表达的影响可以看出类叶升麻苷 能够显著提高模型组雌性昆明小鼠脑组织中NT-3、NGF、BDNF及其受体TrkB的mRNA的表达 以及增强脑组织皮层和海马区NT-3、NGF及其受体TrkA的蛋白表达水平，说明类叶升麻苷 具有增强神经营养因子及受体的作用，且作用显著性优于维生素 E (vitamin E，VE)组和吡 拉西坦片组。
[0091] 综上所述，本发明类叶升麻苷能够显著提高模型组雌性昆明小鼠脑组织中NT-3、 NGF、BDNF及其受体TrkB的mRNA的表达、增强脑内BDNF和TrkB蛋白含量以及增强脑组织 皮层和海马区NT-3、NGF及其受体TrkA的蛋白表达水平，说明类叶升麻苷具有增强神经营 养因子及受体的作用，能够改善因神经营养因子及其受体表达降低引起的神经细胞损伤， 且作用显著性优于维生素 E (vitamin E，VE)组和吡拉西坦片组。
[0092] 以上技术特征构成了本发明的实施例，其具有较强的适应性和实施效果，可根据 实际需要增减非必要的技术特征，来满足不同情况的需求。
【权利要求】
1. 一种类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经细胞损伤药物中的 应用。
2. 根据权利要求1所述的类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经 细胞损伤药物中的应用，其特征在于神经营养因子为NGF、BDNF和NT-3中的一种以上。
3. 根据权利要求1或2所述的类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神 经细胞损伤药物中的应用，其特征在于神经营养因子受体为TrkA或/和TrkB。
4. 根据权利要求1或2所述的类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神 经细胞损伤药物中的应用，其特征在于类叶升麻苷以干品重量计，类叶升麻苷的含量为90% 至 99. 9%。
5. 根据权利要求3所述的类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经 细胞损伤药物中的应用，其特征在于类叶升麻苷以干品重量计，类叶升麻苷的含量为90% 至 99. 9%。
6. 根据权利要求1或2所述的类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神 经细胞损伤药物中的应用，其特征在于类叶升麻苷为从植物中提取的类叶升麻苷或者通过 合成得到的类叶升麻苷。
7. 根据权利要求3所述的类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经 细胞损伤药物中的应用，其特征在于类叶升麻苷为从植物中提取的类叶升麻苷或者通过合 成得到的类叶升麻苷。
8. 根据权利要求4所述的类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经 细胞损伤药物中的应用，其特征在于类叶升麻苷为从植物中提取的类叶升麻苷或者通过合 成得到的类叶升麻苷。
9. 根据权利要求5所述的类叶升麻苷在制备保护神经营养因子及其受体引起的神经 细胞损伤药物中的应用，其特征在于类叶升麻苷为从植物中提取的类叶升麻苷或者通过合 成得到的类叶升麻苷。
【文档编号】A61K31/7032GK104147021SQ201410363553
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】闫明, 高莉, 彭晓明, 霍仕霞 申请人:新疆维吾尔自治区维吾尔医药研究所