组织工程支架的制作方法

组织工程支架的制作方法
【专利摘要】本发明涉及模拟天然血管的生物力学行为的组织工程支架(TE支架)、自TE支架衍生的组织工程血管(TEBV)、及制作和使用TE支架和TEBV的方法。
【专利说明】组织工程支架
[0001] 本申请是申请日为2009年2月13日、申请号为200980113252· 2、发明名称为"组 织工程支架"的发明专利申请（PCT/US2009/034137)的分案申请。 发明领域
[0002] 本发明涉及模拟天然血管的生物力学行为的组织工程支架，及其制作和使用方 法。
[0003] 发明背景
[0004] 血管组织工程中的一个主要难题是拥有与天然血管相称的合适的、长效的生物 力学特性的脉管移植物的构建。动脉置换引起特殊的挑战，原因在于所有血管共同的环 状加载，但是还有那些血管所要求的较高运转压力。经由多种合成和有机材料、不同构建 模态（例如静电纺织和铸造）及众多综合设计，研究人员已经着手这个难题。例如，已经 尝试使用供体移植物、天然成分、和合成成分的各种组合来创建血管移植物（参见例如 Zilla et al.，美国已公布的专利申请2005/0131520 ;Flugelman，美国已公布的专利申 请 2007/0190037 ;Shimizu，美国专利 6, 136, 024 ;Matsuda et al.，美国专利 5, 718, 723 ; 和Rhee et al.，美国专利5, 292, 802)。已经报告由聚酯型聚氨酯尿素（PEUU) (Courtney et al· (2006)Biomaterials. 27:3631-3638)和 PEUU/ 胶原（Guan et al. (2006)Cell Transplant. Vol. 15. Supp. 1 ;S17-S27)构成的其它支架展现组织样功能特性。然而，虽然 合成材料诸如Dacron? (对苯二酸乙二酯）和PTFE (Teflon)已经成功地用于大直径血管， 但是没有哪种合成材料已经成功地用于小直径（例如小于6mm内部直径）血管移植物。已 经发现由:(对苯二酸乙二酯）和PTFE构成的、具有小于5mm的内部直径的血管 移植物是临床上不可接受的，原因是急性血栓形成和慢性吻合和/或内层增生（Walpoth et al· (2〇〇5)Expert Rev. Med. Dev. 2 (6):647-51)。小直径血管移植物难以成功可部分地归因 于包括未能恰当地匹配体内力学特性在内的因素。
[0005] 已经广泛表征了天然血管的生物力学特性。已经清楚它们对应力和应变的 响应是一项重要特征（Roach et al· (1957) Can. J.Biochem. Physiol. 35:681-690 ; Gosline&Shadwick(1998)American Scientist.86:535-541)。展现称作"J 形"曲线的 应力-应变曲线的材料是可能适合于在希望对应力和应变的力学响应类似天然血管的组 织工程支架（诸如血管支架）中使用的候选者。已经报告了自弹性蛋白、胶原、和合成 聚合物的混合物制造的各种制作支架的力学特性（Lee et al. (2007) J.Biomed. Mater. Res.A. , Dec 15 ；83(4):999-1008 ；Smith et al. (2008)Acta Biomater. Jan ；4 (1):58-66 ； Lelkes et al.美国已公布的申请No. 2006/0263417)。然而，仍然需要能够重演J形曲线 行为的组织工程支架，及制作此类支架的方法。
[0006]本发明提供展现在天然血管中观察到的相同类型的对应力和应变的响应即J形 应力/应变曲线的组织工程支架，及其使用和制作方法。
[0007] 发明概述
[0008]本发明关注组织工程支架（tissue engineering scaffold)及其制作方法。 ----------- _]-方面，本发明提供制作包含两个或更多个不同管状元件（tubular element)的 组织工fe支架的方法。在一个头施方案中，该方法包括下述步骤：(a)提供第一管状元件， 其具有弹性体元件（elastomeric element)、外部表面、内部腔表面、和第一直径；(b)使^ =管状元件膨胀至第、二\直径；(c)在步骤（ b)的膨胀后的管状元件的外部表面上提供第二 管状元件，其具有抗拉元件（tensile element)、外部表面和内部腔表面；（d)粘合步骤（b) 的膨胀后的第一管状元件的外部表面与第二管状元件的内部腔表面；并 （e)缩小第一管状 元件的第二直径至步骤（a)的第一直径。
[0010]在一个实施方案中，步骤（a)的第一管状元件和/或步骤（c)的第二管状元件是 通过静电纺织（electrospinning)而形成的。在另一个实施方案中，步骤（a)的第一管状 元件是通过在表面上静电纺织材料而形成的。在其它实施方案中，步骤 （c)的第二管状元 件是通过在膨胀后的第一管状元件的外部表面上静电纺织材料而形成的，或者是通过将成 形前的第二管状元件放置在膨胀后的第一管状元件的外部表面上而形成的。在又一个实施 方案中，步骤（a)的第一管状元件是通过静电纺织而形成的，而步骤 （c)的第二管状元件是 通过将成形前的第二管状元件放置在膨胀后的第一管状元件的外部表面上而提供的。
[0011]在一个其它实施方案中，粘合（bonding)步骤（d)包括将第二管状元件的内部表 面粘附至膨胀后的第一管状兀件的外部表面。在另一个实施方案中，粘合步骤（d)是在膨 胀后的第一管状元件的外部表面上静电纺织第二管状元件之后实施的，或者是在将成形前 的第二管状元件放置在膨胀后的第一管状元件的外部表面上之后实施的，而且包括下述步 骤，将另一层材料应用在第二管状元件的外表面上以容许将第二管状元件夹心粘附在第一 管状元件和所述另一层材料之间。在另一个实施方案中，所述另一层是或含有用于形成第 一管状层相同类型的材料。
[0012]在另一个实施方案中，上述步骤（c)的第二管状元件的外层或表面是波纹状 (corrugated)。在一个实施方案中，波纹状第二管状元件具有纤维网络，其中纤维方向是周 向取向的。在其它实施方案中，第三、第四、第五、等管状元件的外层或表面是波纹状，和/ 或具有纤维网络，其中纤维方向是周向取向的。
[0013]在一些实施方案中，提供步骤（a)和/或提供步骤（C)包括在心轴（mandrel)上 静电纺织材料。在另一个实施方案中，提供步骤（c)包括将成形前的第二管状元件放置在 步骤（b)的膨胀后的第一管状元件上。在一个其它实施方案中，提供步骤（ a)包括在心轴 上静电纺织材料一形成第一管状元件，而提供步骤（c)包括将成形前的第二管状元件放置 在步骤（b)的膨胀后的第一管状元件上。
[0014] 在其它实施方案中，别的管状元件的形成包括在心轴上静电纺织，或者将别的成 形前的管状元件放置在已有的管状元件层上。
[0015] 在其它实施方案中，步骤（a)和（c)包括铸造（casting)技术。在一个其它实施 方案中，步骤（a)涉及使用与第一直径对应的铸件，而步骤（ c)涉及使用与第二直径对应的 铸件。在其它实施方案中，别的管状元件的形成包括铸造，诸如经由使用与大于或小于步骤 (c)第二直径的直径对应的铸件；和/或经由使用与大于或小于步骤（a)第一直径的直径 对应的铸件。
[0016] 在所有实施方案中，本发明的方法可包括下述步骤，在第二管状元件结构内提供 抗拉元件连续体（continuum)或加劲（stiffening)连续体。在一个实施方案中，连续体归 于第二管状元件材料内的纤维的不同形态。
[0017] 在所有实施方案中，提供管状元件的步骤涵盖使用下述一项或多项：铸造，使用成 形前的管状元件，和静电纺织技术。
[0018] 在所有实施方案中，本发明的方法涵盖在第一和第二管状元件上提供别的管状元 件，诸如第三管状元件、第四管状元件、第五管状元件、等。在所有实施方案中，每个别的管 状元件可包括一个或多个弹性体元件和/或一个或多个抗拉元件。本领域技术人员会了解 用于提供别的管状元件的各种技术，包括但不限于本文中所描述的那些。
[0019] 在本发明的另一个实施方案中，弹性体元件包括具有第一弹性模量的弹性体成 分，而抗拉元件包括具有第二弹性模量的抗拉成分，所述第二弹性模量大于第一弹性模量。 在一个优选的实施方案中，第二弹性模量大于第一弹性模量至少一个数量级。
[0020] 在一些实施方案中，弹性体元件包含天然的弹性体成分、合成的弹性体成分、或天 然的弹性体成分和合成的弹性体成分。在一个实施方案中，天然的弹性体成分是弹性蛋 白。在其它实施方案中，天然的弹性体成分选自下组：弹性蛋白（elastin)，节肢弹性蛋白 (resilin)，外展素（abductin)，和蚕丝（silk)。在另一个实施方案中，合成的弹性体成分 可选自下组：|父乳（latex)，聚氣醋（polyurethane) (PU)，聚己酸内醋（polycaprolactone) (PCL)，聚-L-乳酸（poly-L-lactide acid) (PLLA)，聚二?雇烧酮（polydiaxanone) (PD0)， 聚（L-丙交酯共己内醋）（p〇ly (L-lactide-co-caprolactone)) (PLCL)，和聚酿型聚氨醋 (poly(etherurethane urea)) (PEUU)〇
[0021] 在其它实施方案中，抗拉元件包含天然的抗拉成分、合成的抗拉成分、或天然的 抗拉成分和合成的抗拉成分。在一个实施方案中，天然的抗拉成分是胶原。在其它实施 方案中，天然的抗拉成分选自下组：胶原（collagen)，纤维素（cellulose)，蚕丝，和角蛋 白（keratin)。在另一个实施方案中，合成的抗拉成分选自下组尼龙（ nyi〇n)，J^acr〇n@ (聚对苯一酸乙一酯（polyethylene terephthalate) (PET))，(聚四氟乙摇 (polytetrafluoroethylene))，聚酯（polyester)，聚乙醇酸（polyglycolic acid) (PGA)， 聚乳酸共乙醇酸（poly-lactic-co-glycolic acid)(PLGA)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。
[0022]另一方面，本发明提供通过本文中所描述的方法制作的、具有模拟天然血管特性 或与天然血管特性实质性相似的特性的组织工程支架。在一个实施方案中，本发明提供具 有与天然血管的响应实质性相似的对应力和应变的力学响应的组织工程支架，其具有（ a) 第一管状元件，其具有弹性体元件、外部表面和内部腔表面；和（b)第二管状元件，其具有 抗拉元件、外部表面和内部腔表面，第二管状元件的内部腔表面与第一管状元件的外部表 面接触，其中该组织工程支架对应力和应变的力学响应特征在于J形应力/应变曲线。 [00 23]在所有实施方案中，本发明的支架涵盖第一和第二管状元件之外一个或多个别的 管状元件。在一些实施方案中，所述别的管状元件是在第二管状元件的外部表面上形成的。 [00 24]在另一个实施方案中，具有与天然血管的响应实质性相似对应力和应变的力学响 应的组织工程支架具有（a)第一管状元件，其具有弹性体元件、外部表面和内部腔表面；和 (b)第二管状元件，其具有抗拉元件、外部表面和内部腔表面，第二管状元件的内部腔表面 与第一管状元件的外部表面接触，其中该组织工程支架具有（i)约〇· IMPa至约〇. 5MPa的 周向管弹性模量1，（ii)约3.0MPa至约6. OMPa的周向管弹性模量2;和（iii)约〇. 57至 约 1· 1_2 的周向模量过渡（circumferential modulus transition)。
[0025]在其它实施方案中，组织工程支架对应力（stress)和应变（strain)的力学响应 特征在于J形应力/应变曲线。
[0026]在一些实施方案中，组织工程支架对应力和应变的力学响应归于第一管状元件的 弹性体元件和第二管状元件的抗拉元件之间的协同。在又一个实施方案中，协同地，弹性体 元件赋予组织工程支架以弹性，而抗拉元件赋予组织工程支架以刚性。
[0027]在另一个实施方案中，组织工程支架的第二管状元件是波纹状。在一个实施方案 中，波纹状第二管状元件具有纤维网络，其中纤维方向是周向取向的。在一个其它实施方案 中，波纹状轴配置成与支架的轴向平行。在一些实施方案中，本发明的支架涵盖一个或多个 别的管状元件，诸如第三、第四、第五、等管状元件，其中第三、第四、第五、等管状元件的外 层或表面是波纹状，和/或具有纤维网络，其中纤维方向是周向取向的。
[0028] 本发明的一些实施方案提供组织工程支架，其中弹性体元件包含具有第一弹性模 量的弹性体成分，且抗拉元件含有具有第二弹性模量的抗拉成分，所述第二弹性模量大于 第一弹性模量。在一个优选的实施方案中，第二弹性模量大于第一弹性模量至少一个数量 级。
[0029] 在又一个实施方案中，本发明提供组织工程支架，其中弹性体元件具有天然的弹 性体成分、合成的弹性体成分、或天然的弹性体成分和合成的弹性体成分。在一个实施方案 中，天然的弹性体成分是弹性蛋白。在其它实施方案中，天然的弹性体成分选自下组：弹性 蛋白，节肢弹性蛋白，外展素，和蚕丝。在其它实施方案中，合成的弹性体成分选自下组：胶 乳，聚氨酯（PU)，聚己酸内酯（PCL)，聚-L-乳酸（PLLA)，聚二f悉烷酮（PDO)，聚（L-丙交酯 共己内酯）（PLCL)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。在一些实施方案中，本发明的支架包括（i)两 个和更多个不同类型的天然的弹性体成分；和/或（ii)两个或更多个不同类型的合成的弹 性体成分。
[0030]在其它实施方案中，本发明提供组织工程支架，其中抗拉元件具有天然的抗拉成 分、合成的抗拉成分、或天然的抗拉成分和合成的抗拉成分。在一个实施方案中，天然的抗 拉成分是胶原。在其它实施方案中，天然的抗拉成分选自下组：胶原，纤维素，蚕丝，和角蛋 白。在另一个实施方案中，合成的抗拉成分选自下组：尼龙，Dacron? (聚对苯二酸乙二醋 (PET))，G(?efexi):(聚四氟乙烯），聚酯，聚乙醇酸（PGA)，聚乳酸共乙醇酸（PLGA)，和聚醚 型聚氨酯（PEUU)。在一些实施方案中，支架的抗拉元件包括（i)两个或更多个不同类型的 天然的抗拉成分；和/或（ii)两个或更多个不同类型的合成的抗拉成分。
[0031] 在另一个实施方案中，本发明的组织工程支架具有下述至少一项：（i)孔径自第 二管状元件的外部表面处的约100微米逐渐缩小至第一管状元件的内部表面处的约5至 约15微米的孔梯度；（ii)约0· 45MJ/m3至约1. OMJ/m3的周向管韧度；（m)约〇· iMJ/m3至 约0· 5MJ/m3的轴向管靭度；（iv)约〇· 05至约0. 3的切向增量（tangent delta);和（v)约 400MPa至约0· l2MPa的储能模量（storage modulus)。在一个实施方案中，孔梯度有助于 TE支架细胞接种容量增强。在另一个实施方案中，轴向靭度和/或周向軔度有助于使得支 架对断裂或撕裂有抗性。在一个其它实施方案中，TE支架的粘弹性特征在于切向增量和/ 或储能模量值。
[0032]在所有实施方案中，本发明的TE支架可包括第一和第二管状元件以外的管状元 件。本领域技术人员会了解所述别的管状元件中可包含的各种成分，包括但不限于本文中 所描述的那些。
[0033]在别的实施方案中，本发明提供制作组织工程支架的方法。在一个实施方案中， 该方法包括下述步骤：(a)提供第一管状元件，其包含弹性体元件、外部表面、内部腔表面、 和第一直径；(b)使第一管状元件膨胀至第二直径；（ c)在步骤（b)的第一管状元件的外部 表面上提供第二管状元件，其包含抗拉元件、外部表面和内部腔表面；（d)在完成提供步骤 (c)之前完成提供步骤（a) ;(e)粘合步骤（b)的膨胀后的管状元件和步骤（c)的第二管状 元件；并（e)缩小第一管状元件的第二直径至步骤（ a)的第一直径。在另一个实施方案中， 组织工程支架在第一管状元件和第二管状元件之间的界面处包含带状渐变。在另一个实施 方案中，市状渐变包含异质性的过渡带（transitional zone)，其包含第一管状元件的弹性 体元件和第二管状元件的抗拉元件。
[0034]在一个其它实施方案中，制作组织工程支架的方法包括下述步骤：(a)提供第一 管状元件，其包含弹性体元件、外部表面、内部腔表面、和第一直径；(b)使第一管状元件以 连续速率膨胀至第二直径；（c)在膨胀步骤（b)期间在步骤（b)的第一管状元件的外部表 面上提供第二管状元件，其包含抗拉元件、外部表面和内部腔表面；( e)粘合步骤（b)的膨 胀后的管状元件和步骤（c)的第二管状元件；和（e)缩小第一管状元件的第二直径至步骤 (a)的第一直径。在另一个实施方案中，第二管状元件包含抗拉元件连续体或加劲连续体。 在一个其它实施方案中，抗拉元件连续体以不同应变值啮合（engage)。在另一个实施方案 中，粘合步骤（d)包括将第二管状元件的纤维结合至第一管状元件，由此提供连续体。在一 个实施方案中，在提供步骤（c)之前连接第二管状元件的纤维。在另一个实施方案中，根据 扭折（kinking)程度，纤维在应变下以不同时间间隔啮合。在一个实施方案中，没有较少量 扭折的纤维在有较大量扭折的纤维之前伸直和啮合。在另一个实施方案中，纤维啮合导致 应力/应变曲线的逐渐成圆，由此提供与天然血管相似的力学特性。
[0035]_在另二个实施方案中，该进一步包括（f)在第二管状元件的外部表面上提供第三 管状元件，该第三管状元件包含外部表面和内部腔表面。在另一个实施方案中，该方法进 一步包括（g)在第三管状元件的外部表面上提供第四管状元件，该第四管状元件包含外部 表面和内部fe表面。在一个其它实施方案中，该方法进一步包括（ h)在第四管状元件的外 部表面上提供第五管状元件，该第五管状元件包含外部表面和内部腔表面。在一个实施方 案中，该方法进一步包括提供一个或多个别的管状元件，该管状元件包含外部表面和内部 腔表面，使得每个别的管状元件的内部腔表面与最外面的管状元件接触。在一个实施方案 中，所述别的管状元件包含弹性体元件。在一个实施方案中，所述别的管状元件包含抗拉元 件。在另一个实施方案中，粘合步骤（ e)包括在第二管状元件的外部表面上提供别的管状 元件，其包含弹性体元件、外部表面、和内部腔表面。
[0036]在其它实施方案中，本发明提供组织工程支架。在一个实施方案中，组织工程支 架具有与天然血管的响应实质性相似的对应力和应变的力学响应，该支架包含（a)第一管 状元件，其包含弹性体元件、外部表面和内部腔表面；和第二管状元件，其包含抗拉元 件、外部表面和内部腔表面，第二管状元件的内部腔表面与第一管状元件的外部表面接触， 其中该组织工程支架包含下述至少一项：（i)约〇· 1Mpa至约〇· 5MPa的周向管弹性模量 (11) f 3· OMPa至约6_ OMPa的周向管弹性模量2 ;和（iii)约〇· 57MPa至约1. i2MPa的周 向模量过渡；（iv)孔径自第二管状元件的外部表面处的约1〇〇微米逐渐缩小至第一管状元 件的内部表面处的约5至约IS微米的孔梯度；(v)约〇· 45MJ/m3至约i· 〇MJ/m3的周向管韧 度；（vi)约〇· lMJ/m3至约0· 5MJ/m3的轴向管韧度；（vii)约〇· 〇5至约〇· 3的切向增量；和 (viii)约400MPa至约〇· UMPa的储能模量，或上述任何组合。在另一个实施方案中，组织 工程支架对应力和应变的力学响应特征在于j形应力/应变曲线。在一个实施方案中，组 织工程支架是细胞可接近的。在另一个实施方案中，组织工程支架对断裂有抗性。在又一 个实施方案中，组织工程支架是粘弹性的（ Visc0elastic)。
[0037]在=个其它实施方案中，本发明提供组织工程支架，其包含（a)第一管状元件，其 包含弹性体元件、外部表面和内部腔表面；和（b)波纹状第二管状元件，其包含抗拉元件: 外部表面和内部腔表面，第二管状元件的内部腔表面与第一管状元件的外部表面接触。 [00 38]在还有一个实施方案中，本发明提供组织工程血管（TEBV)。在一个实施方案中， TEBV包含（a)第一管状元件，其包含⑴弹性体元件、（⑴外部表面、（iii)内部腔表面； (b)第二管状元件，其包含（i)抗拉元件、（?)外部表面、Qii)内部腔表面，其与第一管 状元件的外部表面接触，和（c)第一细胞群，其中该TEBV对应力和应变的力学响应特征在 于J形应力/应变曲线。在另一个实施方案中，TEBV包含（a)第一管状元件，其包含（i) 弹性体元件、（ii)外部表面、（iii)内部腔表面；(b)第二管状元件，其包含（i)抗拉元件、 (ii)外部表面、（iii)内部腔表面，其与第一管状元件的外部表面接触，和（ c)第一细胞群， 其中该TEBV包含下述至少一项：（i)约〇· lMPa至约0· 5MPa的周向管弹性模量1，（ii)约 3. OMPa至约6. OMPa的周向管弹性模量2 ;和（iii)约0. 57MPa至约1. 12MPa的周向模量过 渡；（iv)孔径自第二管状元件的外部表面处的约100微米逐渐缩小至第一管状元件的内部 表面处的约5至约I 5微米的孔梯度；(v)约〇. 45MJ/m3至约L OMJ/m3的周向管钿度；(vi) 约0· lMJ/m3至约0· 5MJ/m3的轴向管韧度；（vii)约〇· 05至约0. 3的切向增量；和（viii) 约400MPa至约0· UMPa的储能模量。在另一个实施方案中，TEBV特征在于J形应力/应 变曲线。在一个实施方案中，TEBV对应力和应变的力学响应归于第一管状元件的弹性体元 件和第二管状元件的抗拉元件之间的协同。在另一个实施方案中，协同地，弹性体元件赋予 TEBV以弹性，而抗拉元件赋予TEBV以刚性。在其它实施方案中，第二管状元件是波纹状。 在另一个实施方案中，波纹状第二管状层包含纤维网络，其中纤维方向是周向取向的。在另 一个实施方案中，弹性体元件包含具有第一弹性模量的弹性体成分，且抗拉元件包含具有 第二弹性模量的抗拉成分，所述第二弹性模量大于第一弹性模量。在其它实施方案中，第二 弹性模量大于第一弹性模量至少一个数量级。在另一个实施方案中，弹性体元件包含天然 的弹性体成分。在其它实施方案中，弹性体元件包含合成的弹性体成分。在另一个实施方 案中，弹性体元件包含天然的弹性体成分和合成的弹性体成分。在一个实施方案中，天然的 弹性体成分选自下组：弹性蛋白，节肢弹性蛋白，外展素，和蚕丝。在另一个实施方案中，合 成的弹性体成分选自下组：胶乳，聚氨酯（PU)，聚己酸内酯（PCL)，聚-L-乳酸（PLLA)，聚二 嗓焼酮（PD0)，聚（L-丙交酯共己内酯）（PLCL)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。在一个实施方案 中，抗拉元件包含天然的抗拉成分。在一个实施方案中，抗拉元件包含合成的抗拉成分。在 一个实施方案中，抗拉元件包含天然的抗拉成分和合成的抗拉成分。在一个实施方案中，天 然的抗拉成分选自下组：胶原，纤维素，蚕丝，和角蛋白。在一个实施方案中，合成的抗拉成 分选自下组：尼龙，Dacron? (聚对苯二酸乙二酯（PET))，Goretex⑩（聚四氟乙烯），聚 酯，聚乙醇酸（PGA)，聚乳酸共乙醇酸（PLGA)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。在一个实施方案中， ------------i/〇( }J< 第-细胞群在第二管状元件内和/或在第二管状元件的外部表面上。在-个实施方案中， 第-细It群是平滑肌群。在-个实施方案中，管状支架进-步包含第二细胞群在另一个 实施方案中，第二细胞群在第一管状元件的内部腔表面上和/或内部腔表面; 施方案中，第二细胞群是内皮细胞群。
[0039^在另一个实施方案中，本发明提供TEBV，其包含（a)第一管状元件，其包含（i)弹 性体元件、(ji)外部表面、（iii)内部腔表面；(b)波纹状第二管状元件，其包g (i)抗拉元 件、（ii)外部表面、（iii)内部腔表面，其与第一管状元件的外部表面接触，和（c)第一细胞 群。
[0040]在还有一个实施方案中，本发明提供制作组织工程血管（TEBV)的方法，包括下述 步骤：(a)提供第一管状元件，其包含弹性体元件、外部表面、内部腔表面、和第一直径； ，第=管状元件膨胀至第二直径；(c)在步骤（b)的第一管状元件的外部表面上提供第二 管状兀件，其包含抗拉兀件、外部表面、在第二管状元件的外部表面上和y或在第二管状元 件内的第一细胞群和内部腔表面；(d)粘合步骤（b)的膨胀后的管状元件和步骤（ c)的第 二管状元件；(e)缩小第一管状元件的第二直径至步骤（a)的第一直径以提供 TEBV ; (f)培 养TEBV。在一个实施方案中，步骤（c)的第二管状元件是波纹状。在一个实施方案中，波 纹状第二管状元件包含纤维网络，其中纤维方向是周向取向的。在一个实施方案中，提供步 骤（a)包括在心轴上静电纺织弹性体成分，而提供步骤（ c)包括Q)在心轴上静电纺织抗 拉成分，和（ii)在心轴上电喷射第一细胞群。在一个实施方案中，静电纺织步骤Q)和电 喷射步骤（ii)是同时实施的。在一个实施方案中，该方法进一步包括步骤（ f)，给步骤（a) 的内部腔表面接种第二细胞群。在一个实施方案中，第二细胞群是内皮细胞群。在一个实 施方案中，弹性体元件包含具有第一弹性模量的弹性体成分，且抗拉元件包含具有第二弹 性模量的抗拉成分，所述第二弹性模量大于第一弹性模量。在一个实施方案中，第二弹性模 量大于第一弹性模量至少一个数量级。在一个实施方案中，弹性体元件包含天然的弹性体 成分。在一个实施方案中，弹性体元件包含合成的弹性体成分。在一个实施方案中,弹性体 元件包含天然的弹性体成分和合成的弹性体成分。在一个实施方案中，天然的弹性体成分 是弹性蛋白。在一个实施方案中，合成的弹性体成分选自下组：聚己酸内酯（PCL)，聚-L-乳 酸（PLLA)，聚二P恶烷酮（PDO)，聚（L-丙交酯共己内酯）（PLCL)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。 在一个实施方案中，抗拉元件包含天然的抗拉成分。在一个实施方案中，抗拉元件包含合成 的抗拉成分。在一个实施方案中，抗拉元件包含天然的抗拉成分和合成的抗拉成分。在一 个实施方案中，天然的抗拉成分是胶原。在一个实施方案中，合成的抗拉成分选自下组：聚 乙醇酸（PGA)，聚乳酸共乙醇酸（PLGA)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。在一个实施方案中，该方 法进一步包括在步骤（f)之前或在步骤（f)之后使步骤（e)的TEBV与至少一个别的细胞 群接触。在一个实施方案中，培养步骤（f)包括在生物反应器中通过脉动的和/或稳定的 流动来调理（conditioning)。
[0041] 在还有一个实施方案中，本发明致力于通过本文中所公开的方法或任何其它合适 方法制作的组织工程支架（TE支架）或组织工程血管（TEBV)，其中TE支架或TEBV在第一 管状元件和第二管状元件之间的界面处具有带状渐变。在其它实施方案中，带状渐变包含 异质性的过渡带，其包含来自第一管状元件弹性体元件的材料和来自第二管状元件抗拉元 件的材料。
[0042]在某些实施方案中，本发明致力于通过本文中所公开的方法或任何其它合适方法 制作的组织工程支架（TE支架）或组织工程血管（TEBV)，其中TE支架或TEBV的第二管状 兀件具有抗拉兀件连续体或加劲连续体（continuum of stiffening)。在其它实施方案中， 抗拉元件连续体以不同应变值啮合。在一个实施方案中，连续体归于第二管状元件材料的 各纤维的不同形态。
[0043] 在一些实施方案中，组织工程支架（TE支架）或组织工程血管（TEBV)在第一管状 元件和第二管状元件之间的界面处具有带状渐变，而第二管状元件具有抗拉元件连续体。 在其它实施方案中，带状渐变包含异质性的过渡带，其包含来自第一管状元件弹性体元件 的材料和来自第二管状元件抗拉元件的材料和/或抗拉元件连续体以不同应变值啮合。
[0044] 本申请还涉及以下方面：
[0045] 项1. 一种制作组织工程（TE)支架的方法，包括下述步骤：
[0046] (a)提供第一管状元件，其包含弹性体元件、外部表面、内部腔表面、和第一直径；
[0047] (b)使第一管状元件膨胀至第二直径；
[0048] (c)在步骤（b)的膨胀后的第一管状元件的表面上提供第二管状元件，其包含抗 拉元件、外部表面和内部腔表面；
[0049] (d)粘合步骤（b)的膨胀后的第一管状元件和第二管状元件；并
[0050] (e)缩小第一管状元件的第二直径至步骤（a)的第一直径以形成TE支架。
[0051] 项2.项1的方法，其中所述第二管状元件是波纹状。
[0052] 项3.项2的方法，其中所述波纹状第二管状元件包含纤维网络，其中纤维方向是 周向取向的。
[0053] 项4.项1的方法，其中所述提供步骤（a)包括在心轴上静电纺织。
[0054] 项5.项1的方法，其中所述提供步骤（c)包括在心轴上静电纺织。
[0055] 项6.项1的方法，其中所述提供步骤（c)包括将成形前的第二管状元件放置在步 骤（b)的膨胀后的第一管状元件上。
[0056] 项7.项1的方法，其中所述弹性体元件包含具有第一弹性模量的弹性体成分且所 述抗拉元件包含具有第二弹性模量的抗拉成分，所述第二弹性模量大于第一弹性模量。
[0057] 项8.项7的方法，其中所述第二弹性模量大于第一弹性模量至少一个数量级。
[0058] 项9.项1的方法，其中所述弹性体元件包含天然的弹性体成分。
[0059] 项10.项1的方法，其中所述弹性体元件包含合成的弹性体成分。
[0060] 项11.项1的方法，其中所述弹性体元件包含天然的弹性体成分和合成的弹性体 成分。
[0061] 项12.项9或11的方法，其中所述天然的弹性体成分选自下组：弹性蛋白，节肢弹 性蛋白，外展素，和蚕丝。
[0062] 项13.项10或11的方法，其中所述合成的弹性体成分选自下组：胶乳，聚氨酯 (PU)，聚己酸内酯（PCL)，聚-L-乳酸（PLLA)，聚二卩恶烷酮（PD0)，聚（L-丙交酯共己内酯） (PLCL)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。
[0063] 项14.项1的方法，其中所述抗拉元件包含天然的抗拉成分。
[0064] 项15.项1的方法，其中所述抗拉元件包含合成的抗拉成分。
[0065] 项16.项1的方法，其中所述抗拉元件包含天然的抗拉成分和合成的抗拉成分。
[0066]项17·项14或16的方法，其中所述天然的抗拉成分是胶原、纤维素、蚕丝、和角蛋 白。
[0067]项18·项15或16的方法，其中所述合成的抗拉成分选自下组：尼龙，X^.aefC)禮 (聚对苯二酸乙二酯（PET))，Goretex? (聚四氟乙烯），聚酯，聚乙醇酸（PGA)，聚乳酸共 乙醇酸（PLGA)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。
[0068]项19· 一种组织工程支架，其具有与天然血管的响应实质性相似的对应力和应变 的力学响应，该支架包含（a)第一管状元件，其包含弹性体元件、外部表面和内部腔表面； 和（b)第二管状元件，其包含抗拉元件、外部表面和内部腔表面，第二管状元件的内部腔表 面与第一管状元件的外部表面接触，其中所述组织工程支架对应力和应变的力学响应特征 在于J形应力/应变曲线。
[0069] 项20. -种组织工程支架，其具有与天然血管的响应实质性相似的对应力和应变 的力学响应，该支架包含（a)第一管状元件，其包含弹性体元件、外部表面和内部腔表面； 和（b)第二管状元件，其包含抗拉元件、外部表面和内部腔表面，第二管状元件的内部腔表 面与第一管状元件的外部表面接触，其中该组织工程支架具有下述至少一项：
[0070] ⑴约〇· IMPa至约0. 5MPa的周向管弹性模量1 ;
[0071] (ii)约3. OMPa至约6. OMPa的周向管弹性模量2 ;和
[0072] (iii)约〇· 57至约1. 12的周向模量过渡。
[0073] 项21.项20的组织工程支架，其中所述支架特征在于J形应力/应变曲线。
[0074] 项22.项19或20的组织工程支架，其中所述第二管状元件是波纹状。
[0075] 项23.项22的组织工程支架，其中所述波纹状第二管状元件包含纤维网络，其中 纤维方向是周向取向的。
[0076] 项24.项19或20的组织工程支架，其中所述弹性体元件包含具有第一弹性模量 的弹性体成分且所述抗拉元件包含具有第二弹性模量的抗拉成分，所述第二弹性模量大于 第一弹性模量。
[0077] 项25.项24的组织工程支架，其中所述第二弹性模量大于第一弹性模量至少一个 数量级。
[0078] 项26.项19或20的组织工程支架，其中所述弹性体元件包含天然的弹性体成分。
[0079] 项27.项19或20的组织工程支架，其中所述弹性体元件包含合成的弹性体成分。
[0080] 项28.项19或20的组织工程支架，其中所述弹性体元件包含天然的弹性体成分 和合成的弹性体成分。
[0081] 项29.项26或28的组织工程支架，其中所述天然的弹性体成分选自下组：弹性蛋 白，节肢弹性蛋白，外展素，和蚕丝。
[0082] 项30.项27或28的组织工程支架，其中所述合成的弹性体成分选自下组：胶乳， 聚氨酯（PU)，聚己酸内酯（PCL)，聚-L-乳酸（PLLA),聚二瞒烷酮（PD0),聚（L-丙交酯共己 内酯）（PLCL)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。
[0083] 项31.项19或20的组织工程支架，其中所述抗拉元件包含天然的抗拉成分。
[0084] 项32.项19或20的组织工程支架，其中所述抗拉元件包含合成的抗拉成分。
[0085] 项33.项19或20的组织工程支架，其中所述抗拉元件包含天然的抗拉成分和合 成的抗拉成分。
[0086] 项34.项31或33的组织工程支架，其中所述天然的抗拉成分选自下组：胶原、纤 维素、蚕丝、和角蛋白。
[0087] 项35.项32或33的组织工程支架，其中所述合成的抗拉成分选自下组：尼龙， Dacron⑧（聚对苯二酸乙二酯（PET))，G_etex? (聚四氟乙烯），聚酯，聚乙醇酸（PGA)， 聚乳酸共乙醇酸（PLGA)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。
[0088] 项36.项19或20的组织工程支架，其具有下述至少一项：
[0089] (i)孔径自第二管状元件的外部表面处的约100微米逐渐缩小至第一管状元件的 内部表面处的约5至约15微米的孔梯度；
[0090] (ii)约 0. 45MJ/m3 至约 1 · OMJ/m3 的周向管軔度；
[0091 ] (iii)约 0· lMJ/m3 至约 0. 5MJ/m3 的轴向管靭度；
[0092] (iv)约0· 05至约0· 3的切向增量；和
[0093] (v)约400MPa至约0· 12MPa的储能模量。
[0094] 附图简述
[0095] 图1显示天然血管、天然血管减胶原（标记为"弹性蛋白"）、和天然血管减弹性蛋 白（标记为"胶原"）的应力/应变关系。
[0096] 图2显示通过区分涉及两种不同模量的两个线性区而模拟的"J"形曲线。
[0097] 图3A-B图示通过静电纺织和铸造来创建管状结构。
[0098] 图4图示通过静电纺织来创建管状体系结构。图4A-B图示用于提供组织工程支 架的静电纺织技术。图4C图示层之间的突然过渡（顶图）和层的过渡混合（底图）。图 4D图示用于在组织工程支架中实现带状渐变的静电纺织技术。图4E描绘膨胀心轴工艺的 一个替代实施方案。
[0099] 图5A-B图示能够在旋转期间实现连续直径变化的膨胀心轴。
[0100] 图6图示在扩大的弹性层上应用薄抗拉网。
[0101] 图7图示来自毡材料（felt material)的纤维形态。
[0102]图8显示胶乳/PD0体系结构的应力/应变关系。
[0103] 图9显示胶乳/Vicryl体系结构的应力/应变关系。
[0104] 图10显示PD0和Vicryl的应力/应变关系。
[0105] 图11显示胶乳的应力/应变关系。
[0106] 图I2显示含有PGA和/或PU的管的应力/应变关系。
[0107] 图Π 显示含有和PGA的管和天然猪颈动脉的应力应变关系。
[0108] 图14A-B显示缝合材料围绕胶乳管的代表性管状支架。
[0109] 图15A-B显示一种代表性波纹状支架。
[0110] 图16A-B显示代表性波纹状支架的横切面。
[0111] 图I7显示含有PLCL/PGA和PU/PGA的管的应力/应变关系。
[0112] 图I8显示含有PLCL/PGA和PU/PGA的管的压力/体积关系。
[0113] 图19A-C描绘管状支架的可调性的概念。A -抗拉元件的失效（failure)和弹性 元件的失效相合；B -弹性元件的失效在抗拉元件的失效之前；C -抗拉元件的假设失效在 弹性元件的失效之前。
[0114] 图20显示管状支架的组织化学。
[0115] 图21A-E显示细胞接种和生物反应器调理后多节管状支架的细胞染色。
[0116] 图22显示经过细胞接种、生物反应器调理的管状支架的全血凝固测定法的结果。
[0117] 图23显示调理管状支架的生物反应器的示意图。
[0118] 优选实施方案的详述
[0119] 本发明关注组织工程（TE)支架及其制作方法。具体而言，本发明提供具有与天然 血管的特性实质性相似的特性的TE支架。例如，本发明的TE支架展现与天然血管实质性 相似的对应力和应变的力学响应，即J形应力/应变曲线。
[0120] 1.定义
[0121]除非另有定义，本文中所使用的技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术 人员普通理解相同的含义。
[0122]本领域技术人员会认识到许多与本文中所描述的那些相似或相当的方法和材料， 它们可以在本发明的实践中使用。确实，本发明绝非限于所描述的方法和材料。为本发明 目的，下文定义了下述术语。
[0123]其它有关信息可见组织工程领域的教科书，诸如例如Palsson, Bernhard 0. , Tissue Engineering. Prentice Hall, 2004 及 Princiol es of Tissue F.nginftftring.笛 3 版（R Lanza, R Langer,和 J Vacanti 编），2007。
[0124]术语"组织工程支架"或"TE支架"如本文中所使用的，指层状或多层的管状结构， 其特征在于以与天然血管实质性相似的方式响应应力和应变的能力。例如，支架对应力和 应变的力学响应优选特征在于J形应力/应变曲线。本发明支架的特性使它们适合于用作 血管支架的框架。
[0125]术语"组织工程血管"或"TEBV"或"血管支架"如本文中所使用的，指经过进一步 操作以使得它适合于移植入有所需要的哺乳动物受试者的、上文定义和本文描述的组织工 程支架。例如，可以如下形成TEBV,即通过本文所述方法，或者通过任何其它合适方法，操 作组织工程支架以添加一种或多种细胞群。本领域普通技术人员会领会本发明适合于许多 类型的血管，包括但不限于颈动脉、锁骨下动脉、腹腔干、肠系膜动脉、肾动脉、髂动脉、微动 脉、毛细管、微静脉、锁骨下静脉、颈静脉、肾静脉、髂静脉、腔静脉。另外，本发明的 TEBV也 可以是动静脉分流器（shunt) (AV分流器）或位置血管间移植物（j_nter-positional blood vessel graft)。
[0126]术语"弹性体元件"指一种材料，其特征在于其以完全可恢复和可重复的大尺度变 形响应应力的能力。弹性体元件可包含天然成分、合成成分、或天然和合成成分的混合物。 [0127]术语"抗拉兀件"指一种材料，其特征在于在受到应力时拉伸的能力很小。拉伸元 件可包含天然成分、合成成分、或天然和合成成分的混合物。
[0128] 术语"合成成分"如本文中所使用的，指在自然界中天然不存在的成分。一般而言， 合成成分在正常情况中在天然血管中不存在，但是尽管如此却具有在力学和细胞行为方面 展现天然血管样特性的潜力。合成成分可以是本文所述可任选包含天然成分（下文定义） 的组织工程支架和/或TEBV的一部分。合成成分本质上可以是弹性体的或抗拉的。
[0129] 术语"天然成分"如本文中所使用的，指在自然界中存在的或自自然界中存在的物 质衍生的物质，不管其制备模式。如此，例如，"天然成分，，可以是自其天然来源分离和纯化 的，或者通过重组和/或合成手段生成的天然多肽。天然成分可以在天然血管中存在，而且 因此具有在力学和细胞行为方面展现天然血管样特性的潜力。在某些实施方案中，天然成 分本质上可以是弹性体的或抗拉的。
[0130] 文中所用术语"波纹状"指的是一种结构，这种结构包含以出现在其一个或多个表 面上的波纹、起伏和/或扭结所表征的抗拉部件。这种结构一般表现为以纤维网络构成的 薄料层或片层形式，在所述纤维网络中，纤维方向一般沿周向取向。此外，波纹轴线配置成 平行于该结构的轴向，例如该结构为管状组织工程支架。
[0131] 文中所用术语"力学响应"或"生物力学响应"指的是天然血管、血管支架或组织 工程支架在承受应力和应变时表现出的特性。在承受应力和应变式表现出的特性优选通过 以下一种或多种特征来表征：（i)J形应力/应变曲线；（ii)粘弹性；和（iii)耐撕裂性或 耐断裂性。
[0132] 文中所用术语"基本上类似于天然血管"指的是支架具有近似模拟或类似天然血 管的力学属性。本领域普通技术人员应该理解，可以表征和测量若干参数来说明这种基本 类似性。用来提供本发明具有类似天然血管力学特性包括J形应力/应变曲线的组织工程 支架的重要参数是：支架周向管弹性模量1、周向管弹性模量2 ;和周向管的模量过渡。在优 选实施方案中，其他参数也有助于支架对于应力和应变的期望力学特性或响应和/或它们 用作血管移植物的能力，包括但不限于：柔顺性、杨氏模量或弹性模量、破裂压力、壁厚、孔 隙性、孔直径、孔梯度、纤维直径、断裂应变（轴向和/或周向）、断裂应力（轴向和/或周 向）、韧性（轴向和/或周向）、轴向管弹性模量1和2、轴向管弹性模量过渡、粘弹性属性诸 如借助特定的切向增量（tan δ)和储能模量值所表示的属性。
[0133] 文中所用术语"J形曲线"指的是在y轴上绘制应力（材料每单位面积上的力或压 力）并在X轴上绘制应变（相对于原始长度的长度变化或位移）的曲线形状。J形曲线是 天然动脉固有的、来自胶原和弹性蛋白协同相互作用的对应力和应变的力学响应。
[0134] 文中所用术语"柔顺性"由压力（X轴）/体积（y轴）曲线上的方程C = Δ (德尔 塔）V/Δ (德尔塔）P(斜度）来定义。这是材料"柔软度"的量度，并且是"刚性"的倒数。 通常，C的单位是mL/mm-Hg、V的单位是体积（mL)、Ρ的单位是压力（mm-Hg)。
[0135] 文中所用术语"杨氏模量"或"弹性模量"定义为刚性参数。它是从应力（y轴）/ 应变（X轴）曲线的斜度推导而来。在非线性J形曲线的情况下，弹性模量以两个单独的相 交斜度来近似，其中第一斜度从初始拟线性区段（弹性模量1)得出，而第二斜度从后面的 拟线性区段（弹性模量2)得出。图2示出了这一概念。
[0136] 文中所用术语"弹性模量1到弹性模量2的过渡"或"模量1到模量2的过渡"或 "弹性模量过渡"指的是弹性模量1的斜度过渡或转变到弹性模量2的斜度的区间。表示 这一参数的单位是出现所述斜度处的应变值。该参数在图2中表示为由模量（斜度）1和 模量（斜度） 2所代表的直线相交处。在示出天然血管响应的曲线上，所述过渡由表示模量 (斜度）1转变到模量（斜度）2)的曲线区段来表示。
[0137]文中所用术语"柔顺性错配"指的是柔软度/刚性（即，柔顺性/杨氏模量或弹性 模量）量度不同的两种材料的结合体。
[0138] 文中所用术语"孔隙性"指的是支架中孔体积与支架总体积的比率，并且可以表述 为百分比孔隙性。作为替代，孔隙性可以是支架中孔面积与支架总面积的百分比比率。
[0139]文中所用术语"破裂应力，，定义为支架发生至少部分解体之前支架所能承受的管 状支架内部和外部之间的压力差。
[0140]文中所用术语"壁厚，，定义为从管状支架外表面到其内腔表面的深度或跨度。 [0141]文中所用术语"孔直径"定义为本发明的支架中的平均孔直径。
[0142]文中所用术语"孔梯度，，定义为从一个表面到另一个表面的孔直径尺寸线性变化。 孔直径尺寸在管状元件的料层内逐渐减小。例如，尺寸可以从一个表面诸如管状元件的外 膜或外表面向另一个表面诸如管状元件内腔或内表面减小。
[0143]文中所用术语"纤维直径"指的是本发明的支架的平均纤维直径。
[0144]文中所用术语"断裂应变"定义为材料断裂时的应变。
[0145]文中所用术语"断裂应力"定义为材料断裂时的应力。
[0146]文中所用术语"韧性"定义为断裂材料所需的能量，即应力/应变曲线下直到失效 为止的计算面积。
[0147]文中所用术语"切向增量，，定义为管状支架中储存或损失的能量的相对数量指标， 并且通常用来表征分子驰豫并识别流变转化。
[0148]文中所用术语"储能模量，，定义为材料储存机械能的能力，并且通常用来表征分子 驰豫。
[0149]文中所用术语"扭结半径，，定义为在弯曲的管状结构中形成扭结处的半径。
[0150]文中所用术语"带状渐变"定义为具有至少两个不同料层的分层结构中的渐变梯 度，其中每个料层包含不同类型的材料，并且料层之间存在梯度且作为不同材料之间异质 性的区域带。例如，异质性区域带可以包含自弹性体元件的材料和来自抗拉元件的材料。 [0151]术语"平滑肌细胞"如本文中所使用的，指构成见于中空器官（例如膀胱、腹腔、子 宫、胃肠道、脉管系统、等）壁的非横纹肌的细胞，其特征在于收缩和舒张的能力。血管平滑 肌细胞见于整个中膜（血管最后的层），其含有环状排列的弹性纤维和结缔组织。如下文所 描述的，可以自多种来源分离平滑肌细胞群。
[0152]术语"内皮细胞"如本文中所使用的，指适合于在本发明的支架上接种（或是在内 部腔表面上或是在支架内）的细胞。内皮细胞覆盖天然血管的内或腔表面，而且发挥多种 功能，包括但不限于预防血栓形成和预防组织向内生长和不想要的细胞外基质生成。如下 文所描述的，可以自多种来源分离用于接种到本发明支架上的内皮细胞群，包括但不限于 脉管薄壁组织、正在循环的内皮细胞和内皮细胞前体诸如骨髓祖细胞、外周血千细胞和胚 胎干细胞。 ~
[0153] 一术语"细胞群"如本文中所使用的，指通过直接自合适的组织来源（通常是哺乳动 物）分离，及随后在体外培养而获得的一定数目的细胞。本领域普通技术人员会领会用于 分离和培养与本发明一起使用的细胞群的各种方法和适合于在本发明中使用的细胞群中 的多种细胞。
[0154]术语"哺乳动物"如本文中所使用的，指任何归类为哺乳类的动物，包括但不限于 人，非人灵长类，家畜和牲畜，及和动物园、运动或宠物动物诸如马、猪、牛、犬、猫和雪貂等。 在本发明的一个优选实施方案中，哺乳动物是人。 °
[0155]术语"非人动物"如本文中所使用的包括但不限于哺乳动物，诸如例如非人灵长 类、啮齿类（例如小鼠和大鼠）、和非啮齿类动物诸如例如家兔、猪、绵羊、山羊、牛、猪、马和 驴。还包括鸟类（例如鸡、火鸡、鸭、鹅等等）。术语"非灵长类动物"如本文中所使用的，指 除灵长类以外的哺乳动物，包括但不限于上文具体所列的哺乳动物。
[0156] "心血管疾病"或"心血管病症，，在本文中以广义、一般意义用于指哺乳动物中特征 在于心脏或血管（动脉和静脉）功能异常且侵袭心血管系统的病症或状况，特别是那些与 动脉粥样硬化有关的疾病。此类疾病或病症特别适合于使用本文所述TEBV作为旁路血管 移植物来治疗。此类移植物包括但不限于冠状动脉旁路移植物（CABG)、外周旁路移植物、或 动静脉分流器。心血管病症的例子包括但不限于由心肌缺血、心脏病发作、中风、透壁性或 非透壁性心肌梗死、急性心肌梗死、外周血管病、冠状动脉病、冠心病、心率失调、心脏性猝 死、脑血管意外诸如中风、充血性心力衰竭、危及生命的节律障碍、心肌病、短暂性（脑）缺 血发作、急性缺血综合征、或咽峡炎、急性冠状支架失效、或其组合引起的那些状况。此类病 症的其它例子包括但不限于血栓性状况，诸如肺栓塞、冠状动脉急性血栓形成、心肌梗死、 (大）脑动脉（中风）或其它器官的急性血栓形成。
[0157] 2. J形曲线应力/应变响应
[0158] 图1描绘了 J形曲线，这是天然动脉所固有的来源于两种主要结构蛋白即胶原 和弹性蛋白之间的协同相互作用的应力和/应变力学响应（Roach et al.(1957)Can. J.Biochem. Physiol. 35:681-690)。天然血管力学特性是非线性的，并由来自胶原和弹性蛋 白的协同相互作用的力（应力）/位移（应变）示意图（图2)上的"J"形曲线来表征。动 脉中存在胶原和弹性蛋白两者，赋予它们强烈的非线性特性。如果从天然动脉分离弹性蛋 白，留下胶原作为剩下的主要结构蛋白，则力学响应变得更加剧烈。相反，如果天然动脉经 过处理，去掉胶原，则主要的结构蛋白为弹性蛋白，并且力学特性反映出线性弹性特征。天 然动脉的"J"形曲线是来自存在于动脉中的主要结构蛋白即胶原和弹性蛋白两者联合影响 的非线性特性（Gosline&Shadwick(1998)American Scientist. 86:535-541)。
[0159] 在这种生物复合物中，胶原表现为高刚性低弹性成分，而弹性蛋白表现为高弹性 低刚性成分。胶原是承受应力时延展能力非常小的抗拉成分，因此特别适合在组织诸如筋 腱和軔带中扮演角色。然而，弹性蛋白的特征在于能以可完全恢复并重复的大尺度变形对 应力作出响应。弹性蛋白的这种特性使其适合要求一些回跳或回复力的组织诸如皮肤、动 脉和肺。
[0160] 与血管移植物中的通畅性损失相关的一种重要的失效模式是内膜增生（IH)， 内膜增生由缝合线处的组织生长来表征。已经知道IH是由力学特性差异明显的两个 血管区段之间形成的结合部的柔顺性错配所导致（O'Donnell et al. (1984) J. Vase. Surg. 1:136-148 ；Sayers et al. (1998)Br. J. Surg. 85:934-938 ；Stephen et al. (1977) Surgery. 81:314-318 ；Teebken et al. (2002) Eur. J. Vase. Endovase. Surg. 23(6) :475-85 ； Kannan et al. (2005) J. Biomed. Mater. Res Part B-Appl Biomater 74B (1) : 570-81 ； Walpoth et al.(2〇〇5)Expert Rev.Med.Dev_2(6):647-5l)。所述结合区域发展出非天然 的流体动力学状况，这种流体动力学状况确定移植物病变和最终闭合（通畅性损失）的阶 段。
[0161] 虽然已经认识到柔顺性匹配的重要性，但是由于天然动脉的非线性特性，仅指定 一个斜度（力学响应曲线的一部分）不可能实现明显的匹配。确定柔顺性（和刚性）的一 般趋势似乎是仅考虑各曲线的初始拟线性区段（(Sanders et al.U.S. Published Patent Application 2003/0211130 (Figure 16) ；Lee et al. (2007)J Biomed Mater Res A. [Epub ahead of print PMID:17584890] ；Smith et al. (2007)Acta Biomater. [Epub ahead of print，PMID: 17897890])。但是，由于忽略了初始拟线性区段之后发生的情况，所以损失了 重要的信息。如图1所示，"J"形曲线为非线性曲线，因此可以近似为两个单独的斜度相交。 图2示出了这一概念，通过区分与两个不同模量（刚性）相关的线性区间大致示出了一条 "J"形曲线。相同的方法可以用在表示柔顺性的压力/体积曲线图上。因此，对于柔顺性， 本发明不仅考虑从应力/应变曲线图上的初始拟线性区段中获取的度量值，而且考虑在初 始区段之后获取的度量值。
[0162] 曲线的"J"形不仅仅代表构造天然血管所用材料的特定选择所导致的偶然力 学特性。相反，该形状本身表明了对形成动脉瘤的特定抗性（Shadwick(1998)American Scientist· 86:535-541)。此外，模拟天然血管力学特性带来了宏观的好处，即调节柔顺 性错配。其他研究表明，许多不同类型的细胞对于它们根植于其中的微观力学环境敏 感。这些微观力学环境包括其上接种细胞的基片的力学属性以及借助影响组织的因素 诸如压缩（例如，膝关节中的软骨）、循环应变（例如血管经受搏动血流）等输入细胞的 应力，等等（Georges et al_(2006)Biophys.J_ 90 (8) :3012-18 ;Engler et al· (2004) J.Cell Biol. 13 ； 166 (6) :877-87 ；Rehfeldt et al. (2007) Adv. Drug. Deliv. Rev. Nov 10 ； 59 (13): 1329-39 ;Peyton et al. (2007)Cell Biochem_Biophys_ 47 (2):300-20)。例如， 血管平滑肌细胞对于血管组织中的特定应变状态敏感（Richard et al. (2007) J. Biol. Chem· 282(32) :23081-8)。此外，筋腱、骨骼以及身体中基本上每一种组织中的细胞都精确 地适配它们栖居的微观力学环境，这也为贴切地模拟天然组织的属性提供了另一个令人信 服的理由。背离预期的力学属性可能将细胞送入不同的发展道路，或者送往最终引起坏疽 或凋亡的死路。
[0163] 3.组织工程支架
[0164]天然血管具有多层或分层结构。例如，动脉具有三层：称为内膜的最内层，该最内 层包括内衬于内腔表面的大血管内皮细胞；称为中膜的中间层，该中间层包括多片平滑肌 细胞；和称为外膜的外层，该外层包含松散连接组织、较小的血管和神经。内腔和中膜被基 底膜分开。
[0165] 天然血管中特定的结构特征（起伏、波纹、扭结）有利于平行布置以不同的应变不 同程度地机械接合的胶原和弹性蛋白薄层。天然动脉拥有沿着周向方向同心布置的弹性薄 层。这些薄层为波纹状薄层。理论上，弹性薄层的波纹可以牵拉周围的胶原层并赋予它们类 似的几何形状，但这并不是通常观察到的情形。此外，组织学研究表明弹性薄层通常被氨基 多糖浓聚物（GAG)包围。例如，Dahl的一份2007报告给出了组织工程支架与天然动脉的对 比，其中通过使用典型莫娃（Movat)染剂和范吉逊氏（Verheoff-Van Gieson)染剂，波纹状 弹性蛋白薄层在每~种情况下清晰可见（Annals of Biomedical Engineering 2007Mar ; 35(3) :348-55)。因此，天然血管中通常观察到弹性薄层中存在波纹，而周围胶原层中不存 在波纹。这种情况的例外是长须鲸中存在的不寻常结构，其中存在新颖的连接组织布局，在 这种布局中，恰好为抗拉元件的成胶成分生成显著的波纹（Gosline 1998supra)。
[0166] 正如文中所述，本发明涉及组织工程支架及其制作方法，采用与天然血管中常见 方式相反的方法，就是说，支架的抗拉层具有波纹，而弹性层不存在波纹。这种方法具有优 势，原因在于较之弹性层而言，更容易在抗拉层中形成波纹。
[0167] 本发明的组织工程支架具有多层或分层结构。在一种实施方案中，所述支架包括： (a)第一管状元件，所述第一管状元件包括弹性体元件、外表面和内腔表面；和（b)第二管 状元件，所述第二管状元件包含抗拉元件、外表面和与所述第一管状元件的外表面接触的 内腔表面。
[0168] 在另一种实施方案中，第二管状元件为波纹状。存在于文中所述组织工程支架中 的波纹借助图15A-B来例述，图15A-B示出了它们在支架外表面上的外观。
[0169] 在另一种实施方案中，波纹状第二管状元件具有纤维网络，该纤维网络中的纤维 方向为周向取向。图16A-B示出了具有周向均匀性质的波纹截面图。
[0170] 额外的管状元件可以添加在第一和第二管状元件上。
[0171] 第一管状元件的内腔表面和第二管状元件的外表面都可以访问，用于进一步的操 作，诸如例如在形成TEBV时。如下所述，通过向支架中包含一个或多个细胞群，本发明的组 织工程支架可以用来制作组织工程血管（TEBV)。所述支架的分层构造提供了更为自然的血 管形态，这种血管形态可能有利于对细胞群进行预期分化，诸如平滑肌细胞、内皮细胞和成 纤维细胞。
[0172] 文中所述支架的弹性体元件使得所述支架有能力以可以完全恢复并重复的大尺 度变形对应力作出响应。所述弹性体元件具有弹性体成分，所述弹性体成分可以是天然成 分、合成成分、一种以上的天然成分的混合物、一种以上的合成成分的混合物、天然成分和 合成成分的混合物，或者它们的任意组合。一般来说，有机或天然成分为通常存在于天然组 织结构中的蛋白质，或者可以从天然组织结构中获取的蛋白质，或者可以根据编码蛋白质 和/或其氨基酸序列的已知核酸序列重组或合成制造的蛋白质。例如，弹性蛋白天然存在 于动脉中，并且可以用作本发明血管支架中的天然成分。天然成分可以是TE支架和/或 TEBV的一部分，如文中所述，TE支架和/或TEBV也可以包括或不包括合成成分。
[0173] 在一些实施方案中，第一管状元件的弹性体元件包括有机或天然成分， 诸如弹性蛋白质，弹性蛋白质包括但不限于：弹性蛋白、谷蛋白、麦醇溶蛋白、外展 素、蜘蛛丝和节肢弹性蛋白或前身节肢弹性蛋白（Elvin et al.(2〇05)NatUre.〇ct 12:437(7061) :999-1002)本领域普通技术人员应该理解其他可以适用于本发明的支架中 的弹性蛋白质。
[0174] 在完整血管支架为构造组织工程血管而接受进一步操作时，使用天然材料带来了 优势。例如，在该支架上培养或接种特定细胞群时，存在于支架中的天然弹性蛋白质鼓励正 确的细胞与支架相互作用。
[0175] 在另一些实施方案中，弹性体元件包括合成成分。合成的弹性体成分的例子包括 但不限于：乳胶、聚氨酯（PU)、聚己酸内酯（PCL)、聚-L-乳酸（PLLA)、聚二?恶烷酮（PD0)、 聚（L-丙交酯共己内酯）（PLCL)和聚醚型聚氨酯（PEUU)。
[0176] 在一种实施方案中，本发明考虑了第一管状元件中的弹性体元件包括天然弹性成 分和合成弹性成分。
[0177] 文中所述支架中的抗拉元件赋予所述支架刚性或抗拉性，允许所述支架抵抗应力 造成的延展。抗拉元件具有抗拉成分，抗拉成分可以是天然成分、合成成分、-种以上的天 然成分的混合物、一种以上的合成成分的混合物、天然成分和合成成分的混合物，或者它们 的任意组合。
[0178] 在另一种实施方案中，第二管状元件的抗拉元件包括有机或天然成分，诸如纤维 蛋白质，纤维蛋白质包括但不限于胶原、纤维素、蚕丝和角蛋白。本领域普通技术人员应该 理解可以适用于本发明的支架中的其他天然纤维蛋白质。在另一些实施方案中，抗拉元件 是合成成分。合成的抗拉成分的例子包括但不限于：尼龙、Dacron? (聚对苯二酸乙二酯 (PET))、〇〇顏ex? (聚四氟乙烯）、聚酯、聚乙醇酸（PGA)、聚乳酸共乙醇酸（PLGA)和聚醚 型聚氨酯（PEUU)。在一种实施方案中，本发明考虑了第二管状元件中的抗拉元件包括天然 的抗拉成分和合成的抗拉成分。
[0179] 支架中的弹性体元件和抗拉元件可以包含天然成分和合成成分的不同组合。例 如，支架可以包含天然弹性成分和/或天然的抗拉成分；和合成弹性成分和/或合成的抗拉 成分。
[0180] 在本发明的一个方面，TE支架并不限于如上所述的第二管状元件位于第一管状元 件之上的两层结构。在一些实施方案中，所述支架包括额外的管状元件，诸如位于第二管状 元件之上的第三管状元件、位于第三管状元件之上的第四管状元件、位于第四管状元件之 上的第五管状元件。此外，如文中所述，额外的管状元件可以包含弹性体元件（例如，天然 和/或合成）或抗拉元件（例如，天然和/或合成）。额外的管状元件可以利用文中所述的 技术粘合。
[0181] 在一方面，包含在弹性体元件中的弹性体成分和包含在抗拉元件中的抗拉成分分 别具有不同的弹性模量。在一种实施方案中，弹性体元件的弹性体成分的弹性模量具有第 一弹性模量，而抗拉元件的抗拉成分具有第二弹性模量。在优选实施方案中，第二弹性模量 比第一弹性模量大至少大约一个数量级。在一种实施方案中，第二弹性模量比第一弹性模 量大大约一个数量级、大约两个数量级、大约三个数量级、大约四个数量级或者其他的数量 级。例如，示例1显示出抗拉成分PD0和Vicryl的弹性模量分别为3GPa和9_18GPa,与弹 性体成分乳胶的弹性模量0. 3MPa到0. 5MPa相对（另见图10和11)。
[0182] 在另一方面，本发明的TE支架展现出基本上类似于天然血管中发现的结构和功 能属性。在天然血管中，两种主要蛋白质成分即胶原和弹性蛋白的协同相互作用，产生以 J形应力/应变曲线表征的应力和应变力学响应（Roach et al. (1957)Can. J.Biochem. Physiol· 35:681_69〇)。本领域普通技术人员应该理解，可以用来表示本发明的支架模拟或 贴切地类似天然血管的众多参数包括但不限于：应力应变响应、柔顺性、杨氏模量、孔隙性、 强度等。在一种实施方案中，本发明支架的特征在于，能以各向异性方式对应力和应变作出 力学响应。
[0183] 本领域众所周知的许多参数能用于表征组织工程支架的特性。表1提供了这些参 数的报告值（及其对应公开出处）示例。
[0184] 表 1
[0185]
【权利要求】
1. 一种组织工程支架，其具有与天然血管的响应实质性相似的对应力和应变的力学响 应，该支架包含（a)弹性体管状元件，其包含外部表面和内部腔表面；和（b)抗拉波纹状管 状元件，其包含外部表面和内部腔表面，抗拉波纹状管状元件的内部腔表面与弹性体管状 元件的外部表面接触，其中所述组织工程支架对应力和应变的力学响应特征在于J形应力 /应变曲线。
2. -种组织工程支架，其具有与天然血管的响应实质性相似的对应力和应变的力学响 应，该支架包含（a)弹性体管状元件，其包含外部表面和内部腔表面；和（b)抗拉波纹状管 状元件，其包含外部表面和内部腔表面，抗拉波纹状管状元件的内部腔表面与弹性体管状 元件的外部表面接触，其中该组织工程支架具有选自下述的至少一项： ⑴0· IMPa至0· 5MPa的周向管弹性模量1 ;和 (ii) 3. OMPa至6. OMPa的周向管弹性模量2。
3. 权利要求2的组织工程支架，其中所述支架特征在于J形应力/应变曲线。
4. 权利要求1-3中任一项的组织工程支架，其中所述抗拉波纹状管状元件包含纤维网 络，其中纤维方向是周向取向的。
5. 权利要求4的组织工程支架，其中波纹轴线平行于支架的轴向。
6. 权利要求1的组织工程支架，其中所述弹性体管状元件包含具有第一弹性模量的弹 性体成分且所述抗拉波纹状管状元件包含具有第二弹性模量的抗拉成分，所述第二弹性模 量大于第一弹性模量。
7. 权利要求6的组织工程支架，其中所述第二弹性模量大于第一弹性模量至少一个数 量级。
8. 权利要求1或2的组织工程支架，其中所述弹性体管状元件包含天然的弹性体成分。
9. 权利要求1或2的组织工程支架，其中所述弹性体管状元件包含合成的弹性体成分。
10. 权利要求1或2的组织工程支架，其中所述弹性体管状元件包含天然的弹性体成分 和合成的弹性体成分。
11. 权利要求8或10的组织工程支架，其中所述天然的弹性体成分选自下组：弹性蛋 白，节肢弹性蛋白，外展素，和蚕丝。
12. 权利要求9或10的组织工程支架，其中所述合成的弹性体成分选自下组：胶乳，聚 氨酯（PU)，聚己酸内酯（PCL)，聚-L-乳酸（PLLA)，聚（L-丙交酯共己内酯）（PLCL)，和聚醚 型聚氨酯（PEUU)。
13. 权利要求1或2的组织工程支架，其中所述抗拉波纹状管状元件包含天然的抗拉成 分。
14. 权利要求1或2的组织工程支架，其中所述抗拉波纹状管状元件包含合成的抗拉成 分。
15. 权利要求1或2的组织工程支架，其中所述抗拉波纹状管状元件包含天然的抗拉成 分和合成的抗拉成分。
16. 权利要求13或15的组织工程支架，其中所述天然的抗拉成分选自下组：胶原、纤 维素、蚕丝、和角蛋白。
17. 权利要求14或15的组织工程支架，其中所述合成的抗拉成分选自下组：尼龙，聚 二P恶烷酮（PD0)，聚对苯二酸乙二酯（PET)，聚四氟乙烯，聚酯，聚乙醇酸（PGA)，聚乳酸共乙 醇酸（PLGA)，和聚醚型聚氨酯（PEUU)。
18. 权利要求1或2的组织工程支架，其具有选自下述的至少一项： (i) 孔径自抗拉波纹状管状元件的外部表面处的100微米逐渐缩小至弹性体管状元件 的内部表面处的5至15微米的孔梯度； (ii) 0. 45MJ/m3 至 1. OMJ/m3 的周向管韧度； (iii) 0. lMJ/m3 至 0· 5MJ/m3 的轴向管韧度； (iv) 0.05至0.3的切向增量；和 (v) 400MPa至0. 12MPa的储能模量。
19. 权利要求2的组织工程支架，其中所述组织工程支架具有约0. 57至约1. 12的周向 模量过渡。
【文档编号】A61L31/06GK104248477SQ201410457774
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2009年2月13日 优先权日:2008年2月14日
【发明者】H.斯科特.拉波波特, 杰弗里.E.菲什, 小尼尔.F.罗宾斯, 罗杰.M.艾莱甘, 凯利.I.格思里, 纳姆雷塔.桑加 申请人:坦吉恩股份有限公司