紫锥菊根口服液及其制备方法和在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明植物药制品领域，公开了一种紫锥菊根口服液及其制备方法和在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用。制备按照步骤：将1000～3000g紫锥菊根药材粉碎过筛得紫锥菊根粉末；将紫锥菊根粉末与重量百分比浓度为50～80％的乙醇溶液混合，浸泡，超声提取两次，过滤并收集滤液和残渣；将残渣与重量百分比浓度为10～30％的乙醇溶液混合，超声波提取1次，过滤并收集滤液，合并上述滤液；将滤液减压回收乙醇，浓缩；将浓缩液加山梨酸钾溶解，调节pH值至4.0～6.0；静置过夜，过滤；加蒸馏水至1000ml，灌装，灭菌，得紫锥菊根口服液。该紫锥菊根颗粒剂可显著增强鸡新城疫疫苗和猪蓝耳病疫苗的免疫效果。
【专利说明】紫锥菊根口服液及其制备方法和在制备猪鸡疫苗免疫增强 剂中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物药制品领域，具体涉及一种紫锥菊根口服液及其制备方法和在制 备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用。
【背景技术】
[0002] 现代规模化养殖由于各种管理原因导致动物免疫力低下，使养殖生产性能下降， 容易感染疾病，给养殖业带来巨大的经济利益损失，免疫增强剂可以提高动物机体的免疫 力，提高抗病能力、与疫苗同用，可以增强机体对疫苗的免疫应答，保护性免疫水平提前达 至IJ，抗体滴度明显提高，与抗病毒药物抗菌药物同用，可以增强抗病毒药物抗菌药物杀灭病 原体的能力。
[0003] 紫锥菊根为菊科紫锥菊属多年生草本植物紫锥菊（Echinaceapupurea(L.) Moench)的根和根茎，具有较强的免疫强化及抗炎作用，可通过刺激机体的免疫系统而增强 机体对细菌和病毒感染的抵抗力。研究结果表明，其根中含有大量咖啡酸衍生物、烷基酰胺 类、多糖类、生物碱类等物质，其中菊苣酸、烷基酰胺为主要的生理活性成分。在饲料中添加 推荐剂量紫锥菊根末能够提高猪PRRSV抗体水平，能够维持猪机体免疫内环境的稳定。明 显提高肉鸡新城疫抗体水平，提高血浆球蛋白含量；紫锥菊根末喂肉鸡能增强肉鸡红细胞 免疫功能，提高肉鸡NK细胞活性；紫锥菊根末有提高肉鸡免疫器官指数的作用，紫锥菊根 是一种良好的动物免疫增强药物。
[0004] 目前兽药上紫锥菊根剂型有紫锥菊根末，为散剂，散剂仅用于混饲，不能饮水给 药，使用不方便，其中有效成分在植物细胞内，需经过消化、溶出才能被动物吸收，而动物的 消化道短，部分药物未被吸收就被排出体外，造成浪费，紫锥菊根末的生物利用率相对较 低，使用不方便，起效慢。
[0005] 尚未有文献报道紫锥菊根原药材的提取加工方法，一般的中药材提取方法乙醇加 热回流提取，存在提取时间长，溶剂使用量大，提取温度相对较高，有效成分咖啡酸衍生物、 烷基酰胺类有效成分对热不稳定，容易降解，生产效率较低等缺点。
【发明内容】
[0006] 为了解决现有技术的缺点和不足之处，本发明的首要目的在于提供一种紫锥菊根 口服液的制备方法。该方法克服了现有技术提取有效成分收率低，提取时间长，溶剂使用量 大，提取温度较高，有效成分降解多、操作复杂的问题。
[0007] 本发明的另一目的在于提供一种由上述制备方法制备得到的紫锥菊根口服液。口 服液使用方便，提高药物的利用率。
[0008] 本发明的再一目的在于提供上述紫锥菊根口服液在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中 的应用。可以解决现有产品吸收慢、生物利用度低、使用不方便的问题。
[0009] 本发明目的通过以下技术方案实现：
[0010] 一种紫锥菊根口服液的制备方法，按照以下操作步骤：
[0011] (1)将紫锥菊根药材粉碎，过筛得到紫锥菊根粉末；
[0012] (2)将1000?3000g紫锥菊根粉末以质量比1 :8?1 :15的料液比与重量百分比 浓度为50?80%的乙醇溶液混合，浸泡20?50分钟，超声提取两次，每次超声时间20? 30分钟，过滤并收集滤液和残渣；将残渣以质量比1 :5?1:10的料液比与重量百分比浓度 为10?30%的乙醇溶液混合，超声波提取1次，提取时间为10?50分钟，过滤并收集滤 液，合并上述滤液；
[0013] (3)将上述所得滤液在40?60°C下减压回收乙醇，浓缩至50°C下相对密度为 1. 02?1. 10的浓缩液；
[0014] (4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0. 1?0. 3%的山梨酸钾，充分溶解，调节 药液的pH值至4. 0?6. 0;
[0015] (5)药液静置过夜,过滤；
[0016] (6)加蒸馏水至1000ml，灌装，灭菌，即得紫锥菊根口服液。
[0017] 步骤（1)所述紫锥菊根药材为紫锥菊药材地下部分，即紫锥菊的根和根茎；所述 紫锥菊为紫花紫锥菊；所述过筛为过10?40目筛。
[0018] 步骤（6)所述灭菌是采用辐射灭菌、高压灭菌或超声波灭菌。
[0019] 一种由上述制备方法制备得到的紫锥菊根口服液。
[0020] 上述紫锥菊根口服液在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用，所述应用是采用以下 步骤：每100mL紫锥菊根口服液兑水20L?60L饮水使用，连用7天。
[0021] 本发明通过分析紫锥菊根中有效成分的理化性质差异，针对成分采取了不同的提 取方案，以获得尽可能多的有效成分，从而使得成品有效成分得到尽可能多的提取、药效稳 定。利用超声波振动方法进行提取的新工艺，使溶剂快速地进入固体物质中，将其所含的有 效成分尽可能完全地溶于溶剂之中，得到多成分混合提取液。成品紫锥菊根口服液为棕红 色澄清液体，相对密度不低于1. 02,PH值为4. 0?6. 0,味甜、微苦。
[0022] 本发明与现有技术相比具有以下优点：
[0023]1、提取温度低，有效成分降解少，得率高：超声波提取紫锥菊根药材的温度可控制 在常温，最佳提取时间为20?30分钟，有效避免菊苣酸、单咖啡酰酒石酸等对热不稳定、易 水解或氧化等成分的破坏，有效成分的收率比加热回流提取法得率高5%?15%，且大大 降低能耗。
[0024] 2、缩短提取时间：超声波提取紫锥菊根在20?30分钟即可获得最佳提取率，提取 时间较常规方法缩短50%?90%，提高了提取效率。
[0025] 3、溶剂用量少：超声波提取溶剂使用量是常规方法的40?70%，节省了溶剂的使 用量和浓缩时的耗能、耗时，减轻环境污染。
[0026] 4、本发明所得制剂，增强免疫活性和临床疗效可靠。
[0027] 5、采用口服或混水饮用的给药方式，使用方便，操作简单，药物水溶性好，易吸收， 生物利用度高，奏效快，药效好，适合在养殖生产中应用。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0029]实施例1
[0030] (1)先将紫锥菊根药材粉碎，过10目筛，得到紫锥菊根粉末；
[0031] (2)称取1000g紫锥菊根粉末，加8000ml重量百分比浓度为50%的乙醇溶液与紫 锥菊根粉末混合，浸泡30分钟，超声提取2次，每次提取时间为20分钟，过滤并收集滤液和 残渣；将残渣以质量比1:5的料液比与重量百分比浓度为10%的乙醇溶液混合，超声提取1 次，提取时间为20分钟，过滤，并收集滤液，合并上述滤液；
[0032] (3)将滤液在40°C下减压回收乙醇，浓缩至50°C下相对密度为1. 04的浓缩液；
[0033] (4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1?0.3%的山梨酸钾，充分溶解，调节 药液的pH值至5.4;
[0034] (5)药液静置过夜，用微孔滤膜过滤；
[0035] (6)加蒸馏水适量至1000ml，灌装，超声波灭菌，即得紫锥菊根口服液。
[0036] 本实施例所得紫锥菊根口服液为棕红色澄明液体，生药含量为每1ml药液含紫锥 菊根lg，50°C下相对密度为1. 04,经高效液相色谱法检测，菊苣酸含量为5. 82mg/ml。
[0037] 实施例2
[0038] (1)先将紫锥菊根药材粉碎，过40目筛，得到紫锥菊根粉末；
[0039] (2)称取3000g紫锥菊根粉末，加30000ml重量百分比浓度为70%的乙醇溶液与 紫锥菊根粉末混合，浸泡50分钟，超声提取2次，每次提取时间为25分钟，过滤并收集滤液 和残渣；将残渣以质量比1 :8的料液比与重量百分比浓度为20%的乙醇溶液混合，超声提 取1次，提取时间为10分钟，过滤，并收集滤液，合并上述滤液；
[0040] (3)将滤液在45°C下减压回收乙醇，浓缩至50°C下相对密度为1. 03的浓缩液；
[0041] (4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0. 1?0. 3%的对山梨酸钾，充分溶解，调 节药液的pH值至4.8;
[0042] (5)药液静置过夜，取上清液，过滤；
[0043] (6)加蒸馏水至1000ml，灌装，辐射灭菌，即得紫锥菊根口服液。
[0044] 本实施例所得紫锥菊根口服液为棕红色澄明液体，生药含量为每1ml药液含紫锥 菊根3g，50°C下相对密度为1. 03,经高效液相色谱法检测，菊苣酸含量为16. 30mg/ml。
[0045] 实施例3
[0046] (1)先将紫锥菊根药材粉碎，过20目筛，得到紫锥菊根粉末；
[0047] (2)称取2000g紫锥菊根粉末，加30000ml重量百分比浓度为80%的乙醇溶液与 紫锥菊根粉末混合，浸泡20分钟，超声提取2次，每次提取时间为30分钟，过滤并收集滤液 和残渣；将残渣以质量比1:10的料液比与重量百分比浓度为30%的乙醇溶液混合，超声提 取1次，提取时间为10分钟，过滤，并收集滤液，合并上述滤液；
[0048] (3)将滤液在60°C下减压回收乙醇，浓缩至50°C下相对密度为1. 10的浓缩液；
[0049] (4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1?0.3%的山梨酸钾，充分溶解，调节 药液的pH值至4.3;
[0050] (5)药液静置过夜，用微孔滤膜过滤；
[0051] (6)加蒸馏水适量至1000ml，灌装，高压灭菌，即得紫锥菊根口服液。
[0052] 本实施例所得紫锥菊根口服液为棕红色澄明液体，生药含量为每1ml药液含紫锥 菊根2g，50°C下相对密度为1.07,经高效液相色谱法检测，菊苣酸含量为10.92mg/ml。
[0053] 实施例4 (对比实施例）：
[0054] (1)先将紫锥菊根药材粉碎，过40目筛，得到紫锥菊根粉末；
[0055] (2)称取3000g紫锥菊根粉末，加30000ml重量百分比浓度为95%的乙醇溶液与 紫锥菊根粉末混合，浸泡50分钟，超声提取2次，每次提取时间为25分钟，过滤并收集滤液 和残渣；将残渣以质量比1 :8的料液比与重量百分比浓度为20%的乙醇溶液混合，超声提 取1次，提取时间为10分钟，过滤，并收集滤液，合并上述滤液；
[0056] (3)将滤液在45°C下减压回收乙醇，浓缩至50°C下相对密度为1. 03的浓缩液；
[0057] (4)向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0.1?0.3%的对山梨酸钾，充分溶解，调 节药液的pH值至4.8;
[0058] (5)药液静置过夜，取上清液，过滤；
[0059] (6)加蒸馏水至1000ml，灌装，辐射灭菌，即得紫锥菊根口服液。
[0060] 本实施例所得紫锥菊根口服液为棕红色澄明液体，生药含量为每1ml药液含紫锥 菊根3g，50°C下相对密度为1. 03,经高效液相色谱法检测，菊苣酸含量为6. 30mg/ml。
[0061] 实施例5
[0062] 采用上述实施例1、实施例2、实施例3、实施例4所得紫锥菊根口服液增强猪免疫 功能试验。
[0063] 紫锥菊口服液对猪PRRSV抗体的影响
[0064] 35日龄杜长大三元杂断奶仔猪70只，体重为（10 ±0. 5)kg，ELISA检测PRRSV抗 体阴性。随机分成7组，每组10只。第1、2、3、6、7组分别为实施例1紫锥菊口服液的高、 中、低剂量（高、中、低剂量分别为在饮水中的添加剂量〇. 5ml/L、l. 5ml/L、2. 5ml/L)试验 组和实施例2 (推荐剂量：饮水中的添加剂量0. 17ml/L)、实施例3推荐剂量组（推荐剂量： 饮水中的添加剂量〇. 25ml/L)，对照组实施例4推荐剂量组（推荐剂量：饮水中的添加剂量 0. 17ml/L)，第1天注射PRRSV灭活疫苗，2mL/头，全部肌肉注射，同时每组分别按2倍、1倍 和1/2倍的紫锥菊口服液推荐剂量拌料给药，连续用药7天。第4组为疫苗对照组，疫苗免 疫同试验组。第5组为药物对照组，免疫同试验组，黄芪多糖拌料给药，使用方法和剂量按 照产品说明书进行，注射疫苗后7、14、24、34山于前腔静脉采血，4 1^，其中一份（21^)不加 抗凝剂，分离血清，-20°C冻存备用，另2mL加EDTAK盐作抗凝剂用于T细胞亚群检测。
[0065] 血清ELISA抗体检测按照PRRSV抗体检测试剂盒说明书进行，S/P值彡0. 149为 阴性，S/P值彡0. 200为阳性。
[0066] T细胞亚群检测每管加入经过预试验确定体积的鼠抗猪淋巴细胞⑶4+、⑶8+单 克隆抗体10mL，相应对照管加入抗小鼠IgG单克隆抗体10mL，分别加入全血50mL，混匀， 室温避光作用20min，加入opticycleC溶血素250mL，室温避光作用lOmin，加入PBS溶 液500mL，混勻，室温避光作用lOmin，1500r/min离心lOmin，弃去上清，再加入PBS溶液 500mL，重悬细胞，流式细胞仪分析细胞亚群数量。
[0067] 试验数据以[士S.E.表示，统计学处理采用SPSS11. 5软件进行方差分析结果见表 下表1 :
[0068]表1猪PRRSV抗体检测结果（[士S.E.，n= 4)
[0069]
【权利要求】
1. 一种紫锥菊根口服液的制备方法，其特征在于按照以下操作步骤： (1) 将紫锥菊根药材粉碎，过筛得到紫锥菊根粉末； (2) 将1000?3000g紫锥菊根粉末以质量比1 :8?1 :15的料液比与重量百分比浓 度为50?80%的乙醇溶液混合，浸泡20?50分钟，超声提取两次，每次超声时间20?30 分钟，过滤并收集滤液和残渣；将残渣以质量比1 :5?1:10的料液比与重量百分比浓度为 10?30%的乙醇溶液混合，超声波提取1次，提取时间为10?50分钟，过滤并收集滤液， 合并上述滤液； (3) 将上述所得滤液在40?60°C下减压回收乙醇，浓缩至50°C下相对密度为1. 02? 1. 10的浓缩液； (4) 向上述浓缩液中加入占浓缩液质量0. 1?0. 3%的山梨酸钾，充分溶解，调节药液 的pH值至4. 0?6. 0 ; (5) 药液静置过夜，过滤； (6) 加蒸馏水至1000ml，灌装，灭菌，即得紫锥菊根口服液。
2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（1)所述紫锥菊根药材为紫锥 菊药材地下部分，即紫锥菊的根和根茎；所述紫锥菊为紫花紫锥菊；所述过筛为过10?40 目筛。
3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤（6)所述灭菌是采用辐射灭菌、 高压灭菌或超声波灭菌。
4. 一种由权利要求1?3任一项所述制备方法制备得到的紫锥菊根口服液。
5. 根据权利要求4所述的紫锥菊根口服液在制备猪鸡疫苗免疫增强剂中的应用，其特 征在于：所述应用是采用以下步骤：每100mL紫锥菊根口服液兑水20L?60L饮水使用，连 用7天。
【文档编号】A61K125/00GK104257713SQ201410461283
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月11日 优先权日:2014年9月11日
【发明者】吴鸿, 郭世宁, 武力, 王昌库, 石达友, 李美娣, 陈宝妮, 涂玉蓉 申请人:华南农业大学, 广州华农大实验兽药有限公司